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Qu'est-ce qui permet à l'azacitidine de s'incorporer à la fois dans l'ADN et l'ARN ?

Qu'est-ce qui permet à l'azacitidine de s'incorporer à la fois dans l'ADN et l'ARN ?



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J'ai réalisé un mini-projet sur le médicament azacitidine pour mon cours de pharmacologie, et j'ai appris que l'azacitidine a la capacité de s'incorporer à la fois dans l'ADN et l'ARN. Je pense que c'est vraiment unique car un médicament similaire, la décitabine, est exclusivement incorporé dans l'ADN. Existe-t-il des caractéristiques physiques/structurelles spécifiques de l'azacitidine qui lui permettent d'affecter la structure et la fonction de l'ADN/ARN ? Toute aide serait grandement appréciée!


Si vous regardez au tout début de la page Wikipédia, vous verrez que l'azacitidine est un analogue de la cytidine, leClettre de la renommée de l'ADN et de l'ARN. La décitabine est un dérivé désoxy, et ne serait donc incorporée que dans l'acide désoxyribonucléique, ou ADN.

En lisant plus loin, par structure, l'azacitidine est un dérivé de ribonucléoside et est préférentiellement incorporée dans l'ARN. Cependant, il peut être métabolisé en 5-aza-2'-désoxycytidine-triphosphate et ainsi être incorporé dans l'ADN.


La biologie chimique au carrefour de la structure et du mécanisme moléculaire

La compréhension chimique de la fonction biologique est le Saint Graal de la biologie structurale. Les petites molécules sont des acteurs centraux en tant que blocs de construction, effecteurs et sondes de la structure et de la fonction macromoléculaires.

La récente explosion d'intérêt pour la biologie chimique reflète la fascination pour la recherche à l'interface de la chimie et de la biologie, où les connaissances chimiques sont mises à contribution sur des problèmes biologiques et biomédicaux passionnants. En vérité, cependant, les petites molécules ont longtemps joué un rôle important dans le déchiffrement des réponses aux questions biologiques fondamentales. Par exemple, l'utilisation de modificateurs à petites molécules de l'ADN, et plus tard des didésoxy nucléosides triphosphates, a fourni les premières informations sur la séquence de l'ADN et a conduit au développement des analogues de nucléotides fluorescents qui ont permis le séquençage du génome entier. Les premiers indicateurs de petites molécules pour le calcium intracellulaire ont conduit à la découverte des changements de concentration de calcium qui signalent tout, de la fécondation des œufs à la formation de la mémoire.


Transcriptions

La découverte la plus remarquable de la biologie moderne de l'ARN est peut-être la prise de conscience de la diversité du transcriptome. Les technologies basées sur le séquençage de nouvelle génération (NGS) ont démontré l'existence de nombreuses nouvelles classes de transcrits et la grande variété de transcrits codant pour les protéines, tant en termes d'isoformes que de variantes synonymes. La diversité du transcriptome et son interaction avec les phénotypes était le thème principal des deux conférences principales. Ben Blencowe (Université de Toronto) a présenté le concept de réseaux réglementaires d'épissage alternatif et leur rôle dans le développement et les troubles du spectre autistique. Blencowe a illustré comment l'analyse des données NGS a permis la découverte d'une nouvelle classe de micro-exons (3-27 nucléotides) qui sont fortement conservés et dont l'exclusion alternative est associée au phénotype de l'autisme. Les méthodes de quantification des isoformes ont été discutées par Eduardo Eyras (Université de Pompeu Fabra, Barcelone, Espagne), qui a expliqué comment la méthode SUPPA permet d'obtenir des performances de calcul élevées en découplant le mappage de lecture de l'annotation de transcription. Les méthodologies de quantification des isoformes à partir de données chronologiques d'ARN-seq à l'aide de la méthode DICEseq ont également été présentées lors de la session d'affiches par Yuanhua Huang (Université d'Édimbourg, Royaume-Uni). Naturellement, la présence de molécules d'ARN d'isoformes n'implique pas immédiatement l'expression d'isoformes au niveau de la protéine, car la régulation traductionnelle peut sélectionner préférentiellement uniquement un sous-ensemble d'isoformes. Cette question a été abordée par Lorenzo Calviello (Centre Max Delbrück de médecine moléculaire, Berlin, Allemagne), qui a utilisé les données de profilage des ribosomes et l'outil Splice-aware Translational Annotation (SaTAnn). Cette analyse a révélé que près de 55% des gènes (dans les cellules HEK293) traduisent une seule isoforme et a mis en évidence un contrôle traductionnel étendu. SaTAnn a également reçu le prix du meilleur acronyme, battant une rude concurrence du CRAC et du BUM-HMM (voir ci-dessous).

Alors que l'épissage alternatif est reconnu depuis longtemps comme un déterminant majeur de la diversité du transcriptome, des recherches récentes mettent également en lumière la signification fonctionnelle des variants synonymes, c'est-à-dire des transcrits qui ne diffèrent que dans la région non codante. Christine Mayr (Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York) a décrit comment des variants de transcription avec différents 3 ′ UTR peuvent donner lieu à des fonctions radicalement différentes dans la protéine pour laquelle ils codent. Un exemple frappant est donné par le transcrit CD47 chez l'homme : les variants avec une longue UTR 3 ′ sont préférentiellement liés par la protéine HuR (en raison de l'abondance des sites de liaison HuR sur la longue UTR), ce qui conduit alors à une localisation membranaire de la tandis que les protéines CD47 synthétisées à partir d'un court variant 3 ′ UTR restent dans une localisation périnucléaire. Des variantes de transcription plus courtes peuvent également résulter d'une utilisation alternative de sites polyA, le sujet de la présentation de Christina Leslie (également du Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York), bien que dans ce cas, la transcription la plus courte aboutisse principalement à une protéine tronquée ou à une non- ARN codant (ARNnc).

La découverte d'une grande variété de nouveaux ARNnc a également été l'une des avancées majeures des technologies NGS. Les ARNnc restent cependant largement mystérieux dans leur fonction biologique. Albin Sandelin (Biotech Research & Innovation Centre, Copenhague, Danemark) a décrit les données d'expériences d'analyse de cap d'expression génique (CAGE) illustrant l'omniprésence de la transcription bidirectionnelle, donnant souvent lieu à des paires ARNm-ARNnc. Il a en outre expliqué comment les caractéristiques génomiques telles que la densité des sites polyA ou les sites de démarrage de la transcription étroitement espacés influencent l'expression des ARNnc. Igor Ulitsky (Institut Weizmann, Rehovot, Israël) a utilisé la synténie pour élucider la fonction et l'origine des lincRNAs (long intergenic ncRNAs), mettant en évidence un niveau modeste de conservation des séquences, en partie expliqué par la présence d'activateurs au sein des lincRNAs. Les méthodologies de comparaison de séquences, initialement développées pour étudier les gènes paralogues, ont également été discutées par Jana Hertel (Université de Leipzig, Allemagne) pour aborder l'évolution des ARNnc. Enfin, Todd Lowe (Université de Californie, Santa Cruz, États-Unis) a utilisé les données de chromatine du projet Encyclopedia Of DNA Elements (ENCODE) pour découvrir une régulation épigénétique généralisée du transcriptome de l'ARNt humain.


1. INTRODUCTION

L'agrégation des protéines augmente inexorablement avec le vieillissement dans toutes les espèces animales et dans tous les tissus examinés (Ayyadevara, Balasubramaniam, Johnson, et al., 2016 Ayyadevara, Balasubramaniam, Suri, et al., 2016 Brignull et al., 2007 Cohen et al., 2009 David et al., 2010 Dillin & Cohen, 2011 Reis-Rodrigues et al., 2012 ). On pense que des composants agrégés spécifiques, diagnostiques pour chaque maladie neurodégénérative humaine, jouent un rôle causal parce que leur mutation et/ou surexpression associées à la pathologie sont suffisantes pour conférer une neuropathie héréditaire dans les pedigrees humains et dans les modèles animaux transgéniques (Bandyopadhyay et al., 2007 Dillin & Cohen, 2011 Li et al., 2013 Miller et al., 2010 Roodveldt et al., 2009 ). Les protéines qui nécessitent une flexibilité structurelle incorporent souvent des régions désordonnées, les rendant ainsi vulnérables à l'agrégation. D'autres protéines ne sont sensibles à l'agrégation qu'après oxydation ou modifications post-traductionnelles spécifiques (Ayyadevara et al. 2016).

Nous avons récemment développé des réactifs de réticulation click-chemistry améliorés et un logiciel analytique pour identifier les protéines adjacentes dans les agrégats, sur la base de la réticulation peptide-peptide, et nous l'avons appliqué pour définir le réseau d'adhérence protéine, ou « contactome », des agrégats. Nous avons commencé avec des agrégats totaux insolubles dans le sarkosyl isolés de SY5Y-APPSw cellules de neuroblastome humain (Ayyadevara et al., 2017), un modèle de la maladie d'Alzheimer familiale (fAD). Ce travail a révélé une structure complexe et non aléatoire d'agrégats dans laquelle les mégahubs (hubs à très haute connectivité avec ≥100 partenaires) et les connecteurs de hub (protéines à faible connectivité reliant les grands hubs) contribuent fonctionnellement à l'assemblage de gros agrégats (Balasubramaniam et al., 2019). Nous avons noté un enrichissement marqué parmi les mégahubs pour les grandes protéines structurelles telles que la titine, les ankyrines 1 à 3, les nesprins 1 à 3, MAP1A et d'autres protéines des neurofilaments, uniquement en raison de leur taille. Nous avons également observé un enrichissement significatif pour une variété de protéines de liaison aux acides nucléiques (Balasubramaniam et al., 2019).


2 Thermodynamique et cinétique des prions à ARN

La structure secondaire de l'ARN est une bonne approximation de la structure réelle de l'ARN car, contrairement aux protéines, la structure secondaire de l'ARN capture la majorité de l'énergie libre de repliement. De plus, il existe un modèle énergétique bien établi pour les structures secondaires de l'ARN qui est largement paramétré via des expériences de fusion [39]. Du côté informatique, des algorithmes ont été développés pour la caractérisation thermodynamique et cinétique des structures secondaires de l'ARN [28]. En particulier, la structure énergétiquement optimale ainsi que les propriétés de l'ensemble structurel à l'équilibre thermodynamique peuvent être calculées efficacement. La topologie du paysage de plissement discret [12], qui a une forte influence sur la cinétique de plissement, peut être analysée en détail. Plusieurs approches modélisent la cinétique de repliement de la structure secondaire de l'ARN en tant que processus stochastique avec une résolution différente du paysage de repliement [9, 45, 26] (pour une revue, voir [10]). Récemment, ces approches ont été étendues pour opérer sur des paysages de pliage qui changent avec le temps, comme dans le cas du pliage lors de la transcription [19].

2.1 Thermodynamique

Laissez l'ensemble Ω de structures secondaires d'ARN être limité à ceux qui sont formés à partir de paires de bases isostériques imbriquées (GC, AU, GU), qui ont une taille de boucle en épingle à cheveux minimale de 3 nt et une taille de boucle intérieure maximale de 30 nt. Ces restrictions sont suffisamment larges pour inclure la grande majorité des conformations d'ARN sans pseudo-nœud connues, et elles définissent un ensemble de structures pour lesquelles un modèle énergétique déterminé expérimentalement E existe [29]. Plus important encore du point de vue informatique, ces définitions nous permettent de calculer la structure de l'énergie libre minimale (MFE) et la fonction de partition d'équilibre (Z) dans O(m 3 ) le temps, où m est la longueur de la séquence.

2.2 Pliage cinétique

Trouver le meilleur chemin de repliement s'est avéré être un problème NP-difficile [30]. Cependant, il existe des heuristiques rapides pour calculer les chemins directs (les plus courts) entre deux structures, comme la méthode findpath [11] disponible dans le package ViennaRNA, ainsi que des chemins indirects utilisant, par exemple, RNAtabupath [7]. Pour les séquences plus courtes qu'environ 100 nt, les chemins avec une barrière énergétique minimale peuvent être calculés exactement avec RNAsubopt [46] et les barrières [12]. Le premier programme calcule une liste de toutes les structures secondaires d'ARN dans une certaine plage d'énergie. Les barrières traitent une liste triée de ces conformations pour calculer tous les minima locaux et les points de selle les reliant par un algorithme d'inondation.

2.3 Paysages des prions à ARN

Les prions d'ARN sont des molécules bistables qui favorisent une structure (S1) s'il est présent sous forme de monomère et l'autre structure (S2) lors de la dimérisation. Pour éviter le repliement spontané entre S2 et S1, la barrière énergétique βS2S1 doit être très élevé (voir Figure 1).

Exigences schématiques pour un prion à ARN. Les parties rouge et bleue de la molécule sont complémentaires et peuvent former une réaction d'hybridation intermoléculaire. Panneau supérieur: S1 et S2 sont des conformations stables qui ne se replient pas les unes dans les autres, car les conformations sont séparées par une barrière énergétique élevée dans le paysage énergétique. Panneau inférieur: S2 déstabilise S1 avec une interaction en boucle de baiser de type HIV-Dis. La barrière énergétique pour le S1S2 complexe à replier dans le S2S2 complexe est faible et permet donc un repliement spontané.

Exigences schématiques pour un prion à ARN. Les parties rouge et bleue de la molécule sont complémentaires et peuvent former une réaction d'hybridation intermoléculaire. Panneau supérieur: S1 et S2 sont des conformations stables qui ne se replient pas les unes dans les autres, car les conformations sont séparées par une barrière énergétique élevée dans le paysage énergétique. Panneau inférieur: S2 déstabilise S1 avec une interaction en boucle de baiser de type HIV-Dis. La barrière énergétique pour le S1S2 complexe à replier dans le S2S2 complexe est faible et permet donc un repliement spontané.

Dans notre conception, S2 forme deux épingles à cheveux de 10 nt qui sont susceptibles de s'hybrider via une interaction de baiser comme indiqué pour la boucle HIV-DIS [8], une séquence tige-boucle hautement conservée trouvée dans de nombreux rétrovirus. Surtout, S2 devrait non seulement stabiliser d'autres molécules dans S2 conformation à des concentrations élevées, mais abaisse activement la barrière énergétique pour se replier S1 dans S2 (voir la figure 1).

Si ces propriétés paysagères sont remplies, cela garantit qu'une population initiale de seulement S1 les molécules ne se replieront pas en S2 sauf si le repliement est déclenché par un mécanisme extérieur. Cependant, dès qu'une petite population de molécules dans S2 conformation est présente, ils peuvent catalyser le repliement de S1 molécules en S2.


Applications et avantages du marquage au phosphate d'isotope stable de l'ARN en spectrométrie de masse

La spectrométrie de masse (MS) est devenue une technologie habilitante pour la caractérisation des nucléosides modifiés post-transcriptionnellement dans les acides ribonucléiques (ARN). Ces ARN modifiés ont tendance à être plus difficiles à caractériser complètement à l'aide des technologies de séquençage conventionnelles basées sur la génomique. Comme pour de nombreuses molécules biologiques, les informations relatives à la présence ou à l'absence d'un composé particulier (c'est-à-dire une mesure qualitative) ne sont qu'une étape de la caractérisation de l'échantillon. Des informations utiles supplémentaires sont trouvées en effectuant des mesures quantitatives sur les niveaux du composé d'intérêt dans l'échantillon. Le marquage au phosphate des ARN modifiés a été développé par notre laboratoire pour améliorer les techniques conventionnelles de spectrométrie de masse. En tirant parti du mécanisme d'action de nombreuses ribonucléases (RNases), la digestion d'échantillons d'ARN en présence d'eau marquée au 18 O génère un 3′-phosphate marqué au 18 O dans chaque produit de digestion. Nous décrivons le développement historique de cette approche, contrastons cette stratégie d'étiquetage des isotopes stables avec d'autres utilisées dans la spectrométrie de masse d'ARN et fournissons des exemples de nouvelles méthodes de spectrométrie de masse analytique qui sont activées par le marquage au phosphate de cette manière.

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PLAN DE COURS

CONTEXTE DE LA LEÇON

Pour intégrer les recherches de l'instructeur et donner aux étudiants une opportunité de recherche guidée mais authentique, le corps professoral et les étudiants travaillent en collaboration pour identifier un gène d'intérêt à modifier. Le premier déploiement de cette leçon a créé des mutants de troncature pour le C. elegans gène klp-4, mais n'importe quel modèle ou cible génétique pourrait être utilisé comme l'instructeur l'entend. Bien que nous ayons inclus nos réactifs spécifiques, nous nous sommes efforcés de rendre cette leçon générale afin qu'elle puisse être utilisée dans de multiples contextes/modifications. Une liste complète du matériel général et des solutions requises se trouve dans les fichiers de support 6 et 7 (fichier de support S6 : matériel de cours/réactifs requis et fichier de support S7 : solutions communes).

Chaque session de ce laboratoire doit commencer par un exposé à la craie impliquant les points clés et les processus impliqués dans le développement des compétences. Nous préférons les discussions à la craie plutôt que les conférences préparées étant donné les connaissances de base variées des étudiants et la capacité de s'adapter en « temps réel » en fonction des questions et des interactions des étudiants. Les discussions à la craie permettent de se concentrer sur le rôle de chaque compétence dans le processus scientifique et sur la manière dont chacune de ces compétences a été utilisée pour atteindre les objectifs de la recherche (Fichier d'appui S8 : Points de discussion à la craie et réponses aux questions de discussion). De plus, la fin de chaque document de laboratoire contient des questions de discussion et d'application pour renforcer les idées clés (Fichier de support S8). Un exemple de calendrier de cours se trouve dans le tableau 1.

MODULE 1 : PRINCIPES DE LA PCR - SYNTHÈSE DES MODÈLES DE RÉPARATION DIRECTÉE PAR HOMOLOGIE (HDR)

Les étudiants effectuent des recherches de base sur un gène d'intérêt et consultent l'instructeur pour choisir une modification potentielle qui pourrait être apportée à ce gène et concevoir des cassettes knock-in de réparation dirigée par homologie (HDR) (Fichier d'appui S9 : Lignes directrices pour la consultation sur les projets étudiants) . Grâce à ce processus, les étudiants apprendront les bases du logiciel de clonage moléculaire, les compétences de base en bio-informatique et se familiariseront avec la littérature primaire dont ils auront besoin pour leur évaluation par affiche.

Les étudiants utilisent un logiciel de clonage moléculaire pour concevoir des amorces pour amplifier la séquence de leur cassette HDR knock-in, en prêtant attention à l'ajout de bras d'homologie et au maintien du cadre de lecture lors d'une insertion réussie (Fichier de support S10 : Lab 1 - PCR and Primer Design et 7 ). Les points importants sont l'orientation 5'-3' de l'ADN, l'hypothèse de la séquence du brin opposé et les propriétés thermodynamiques de la fusion et de l'hybridation des ADN complémentaires.

Après avoir effectué leurs réactions PCR, de petites aliquotes de chaque réaction sont passées sur des gels d'agarose pour analyse (Fichier d'appui S11 : Lab 2 - Mise en place des réactions PCR, Fichier d'appui S12 : Lab 3 - Électrophorèse sur gel d'agarose d'ADN et Figure 1A). Les élèves devraient être capables de prédire la taille d'un produit, puis d'analyser leurs données et d'identifier les réactions positives potentielles. Les échantillons potentiellement positifs sont ensuite purifiés et séquencés (Fichier de support S13 : Lab 4 - PCR Purification and Sequence Prep). À l'aide d'un logiciel de clonage moléculaire, les étudiants analysent leurs données de séquençage pour déterminer si leurs réactions PCR ont réussi (Fichier de support S14 : Lab 5 - Analyse de séquence, Fichier de support S15 : KIF17B-1 - Fichier .ab1, Fichier de support S16 : KIF17B-2.ape fichier, fichier de prise en charge S17 : fichier inconnu.ab1 et figure 1B). Les modèles HDR à séquence vérifiée sont ensuite stockés pour une utilisation ultérieure en aval si vous le souhaitez.


Figure 1. L'amplification des modèles de réparation dirigée par homologie mCherry (HDR). (A) Gel d'agarose représentatif des produits de réaction PCR pour les modèles HDR 1-4. La taille attendue des produits PCR mCherry avec des bras d'homologie est de 935 paires de bases. (B) L'étudiant a généré l'alignement des résultats de séquençage démontrant une amplification réussie de mCherry pour HDR Template-3. Les nucléotides 61 à 100 de mCherry sont indiqués par souci de concision. Les alignements de séquences ont été générés à l'aide du logiciel ApE.

MODULE 2 : PRODUCTION D'ADN RECOMBINANT - CONSTRUCTION DE PLASMIDES À ARN SIMPLE-GUIDE

Les ARN à guide unique (sgRNA) pour le ciblage spécifique au site de Cas9 sont conçus à l'aide de la séquence génomique annotée d'un gène cible (Fichier de support S18 : Lab 6 - Designing crRNA Oligos). Rappelons qu'un sgRNA complet contient deux composants liés, un ARN CRISPR spécifique (crRNA) qui cible une séquence d'ADN spécifique et un ARN CRISPR transactivant universel (tracrRNA) qui relie le crRNA à l'enzyme Cas9. Hwang et al. ont conçu le plasmide DR274 (Addgene Plasmid #42250, MTA requis) qui contient un site d'insertion pour les crRNAs suivi de la séquence tracrRNA. Pour utiliser ce plasmide, les utilisateurs n'ont besoin que de concevoir et d'hybrider des oligonucléotides complémentaires correspondant à une séquence d'ARNc souhaitée. Fait important, DR274 a été conçu pour l'insertion directionnelle (à sens unique) d'oligonucléotides d'ARNc recuits. DR274 contient deux sites d'enzyme de restriction Bsal séparés par une séquence d'espacement. La séquence de reconnaissance de l'enzyme BsaI est 5' GGTCTC 3', cependant l'enzyme digère un nucléotide non spécifique après l'extrémité 3' de la séquence de reconnaissance GGTCTC (5'GGTCTCN3') et cinq nucléotides non spécifiques vers l'extrémité 5' sur le brin inférieur (3'CCAGAGNNNNN5'). Les séquences flanquantes sur le site d'insertion de l'ARNcr de DR274 sont intentionnellement différentes pour faciliter l'insertion directionnelle d'oligonucléotides d'ARNcr recuits immédiatement en amont de la séquence tracrRNA pour produire des sgRNA via in vitro transcription (10). Les réactions de ligature standard utilisent des oligonucléotides digérés par Bsal, déphosphorylés et annelés (fichier de support S19 : Lab 7 - Préparation des plasmides sgRNA). Les réactions de ligature sont transformées en bactéries compétentes et étalées sur des plaques de LB-Kanamycine pour une incubation d'une nuit à 37°C.

Les étudiants choisiront des clones bactériens pour les cultures liquides pendant la nuit et recevront des instructions détaillées sur le but de chaque solution utilisée dans l'isolement de l'ADN (Fichier de support S20 : Lab 8 - Minipreps and Diagnostic Digest et 5). Une fois l'ADN isolé avec succès, les plasmides sont séquencés et analysés pour plus de pratique sur les compétences bioinformatiques. Les plasmides contenant des cassettes d'ARNcr sont digérés de manière diagnostique en utilisant Nhel et HindIII. La digestion produit des fragments de 2018 et 143-nucléotides qui nécessitent un gel d'agarose à pourcentage élevé. Le succès de ce condensé de diagnostic varie, mais 50% du temps, les étudiants sont capables de produire une bande de la bonne taille. Le plasmide non coupé peut également être exécuté à côté du plasmide digéré pour démontrer l'ADN superenroulé par rapport à l'ADN linéarisé (figure 2A). Les élèves analysent leurs gels pour déterminer les clones positifs potentiels. Même si les résumés de diagnostic échouent, les étudiants reçoivent régulièrement des résultats positifs de l'analyse de séquence ci-dessus (Figure 2B).


Figure 2. Vérification du clonage du plasmide sgRNA. (A) L'étudiant a généré un gel d'agarose représentatif en utilisant HindIII/Nhel pour effectuer une digestion diagnostique de quatre clones individuels de DR274 + crRNA-3 contre un échantillon superenroulé non digéré du même clone. Taille attendue des clones positifs doublement digérés : 2152 paires de bases et 134 paires de bases (B) Alignement des résultats de séquençage entre le clone 2 de DR274 + crRNA-3 et la séquence crRNA-3 conçue. Les alignements de séquences ont été générés à l'aide du logiciel ApE.

MODULE 3 : TRAVAILLER AVEC L'ARN - PRODUCTION DE SGRNA

ruissellement in vitro la transcription est utilisée pour produire des ARNsg (fichier de support S21 : Lab 9 - In vitro Transcription). Les plasmides sgRNA vérifiés par séquence sont d'abord linéarisés avec Dral, suivis d'une extraction au phénol-chloroforme et d'une précipitation à l'éthanol. Les étudiants doivent veiller à éviter la contamination par l'ARNase, car les ADN seront utilisés dans les applications d'ARN en aval. Les rendements typiques des étudiants de cette procédure de purification vont de 10 à 200 ng/μl d'ADN matrice linéarisé. Les sgRNA sont ensuite produits par in vitro transcription. Aussi peu que 10 ng au total d'ADN matrice linéarisé peuvent être utilisés pour le in vitro réaction de transcription. Les échantillons doivent être traités à la DNase pour retirer la matrice d'ADN après in vitro transcription. In vitro les sgRNA produits sont purifiés et soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose dénaturante (fichier support S22 : Lab 10 - Purification of sgRNAs). Au lieu d'utiliser des techniques de gel dénaturant traditionnelles, Arnanda et ses collègues ont développé une alternative simple et efficace qui utilise des gels d'agarose standard qui incluent jusqu'à 5% d'eau de Javel domestique standard pour dénaturer les ARN (7). Un échantillon de 200 à 250 ng d'ARN total produit des bandes de la bonne taille (

133 nucléotides) et l'exécution de plus que cette quantité d'ARN sur le gel entraîne la formation d'une structure secondaire d'ARN, une mauvaise résolution des bandes et une taille incorrecte sur le gel (Figure 3).


Figure 3. Gel de blanchiment dénaturant des sgRNA transcrits in vitro 1-4. La taille attendue du produit est de 133 bases. Notez que la réaction de transcription in vitro de sgRNA-4 a produit un faible rendement.

MODULE 4 : CONCEPTION EXPÉRIMENTALE AVEC UN IN VITRO ESSAI DE Clivage CAS9

Pour démontrer le principe de CRISPR-Cas9 et le processus de conception expérimentale, nous utilisons un in vitro méthode (fichier de support S23 : Lab 11 - In vitro Cas9 Assay et 8, voir également https://www.neb-online.de/wp-content/uploads/2015/06/LocusModificationDetectionCas9_Protocol_0515.pdf pour la base du test). Nous avons construit notre propre construction cible synthétique en concevant un ADNdb personnalisé contenant la cible de 20 nucléotides de chaque groupe suivie d'une séquence PAM. Le bloc d'ADNdb personnalisé est ligaturé dans le site de clonage multiple de pET28a(+). La cible synthétique à base de vecteur pET est d'abord linéarisée avec EcoRV pour fournir un substrat linéaire pour notre essai. En utilisant ce substrat cible synthétique, un clivage réussi par le duplex sgRNA-Cas9 se traduira par des produits de

4 ko et 1,5 ko (fichier d'accompagnement S24 : Réactifs et méthodes vérifiés par leçon et figure 4). Vraisemblablement, tout ADN double brin (plasmide, clone d'ADNc, produit PCR, etc.) contenant la séquence cible spécifique à 20 nucléides suivie de la séquence PAM pourrait être utilisé comme substrat pour ce dosage. L'utilisation de la cible synthétique a l'avantage de ne nécessiter qu'un seul substrat commun pour tous les groupes d'élèves au lieu de produire ou d'obtenir plusieurs cibles différentes. Nous vous recommandons d'utiliser un modèle linéarisé pour ce test afin de faciliter l'interprétation des résultats pour les étudiants. Les étudiants doivent maintenir un environnement sans nucléase pendant le test. Si le temps le permet, une fois que les étudiants ont démontré une conception réussie de leurs réactifs, la possibilité existe d'utiliser ces réactifs in vivo ou ex vivo.


Figure 4. Clivage de la cible spécifique au site dans un test Cas9 in vitro. Données d'étudiants représentatives du test Cas9 in vitro pour les sgRNA 1-4 contre un substrat cible synthétique. Aucun sgRNA et aucun sgRNA/aucun Cas9 n'ont été utilisés comme témoins. Un clivage réussi produit des produits de

4000 paires de bases et 1500 paires de bases.


Tableau 1. Calendrier d'enseignement CRISPR-Cas9 - Semaine 1


Tableau 1. Calendrier d'enseignement CRISPR-Cas9 - Semaine 2


Tableau 1. Calendrier d'enseignement CRISPR-Cas9 - Semaine 3


Tableau 1. Calendrier d'enseignement CRISPR-Cas9 - Semaine 4


Tableau 1. Calendrier d'enseignement CRISPR-Cas9 - Semaine 5


Tableau 1. Calendrier d'enseignement CRISPR-Cas9 - Semaine 6


Tableau 1. Calendrier d'enseignement CRISPR-Cas9 - Semaine 7


Tableau 1. Calendrier d'enseignement CRISPR-Cas9 - Semaine 8


Tableau 1. Calendrier d'enseignement CRISPR-Cas9 - Semaine 9


Tableau 1. Calendrier d'enseignement CRISPR-Cas9 - Semaines 10-12


Dysfonctionnement des cellules endothéliales induit par l'ischémie

L'absence ou la restriction de l'apport sanguin au tissu myocardique est essentielle à la promotion d'un dysfonctionnement cardiaque dans l'IC, avec une ischémie et une hypoxie spécifiquement associées à un dépôt accru de MEC, une inflammation et une mort cellulaire [93, 94]. Comme les CE sont très importantes dans le maintien de la perfusion myocardique, elles contribuent à toutes les manifestations cliniques de l'IC. Comme avec d'autres types de cellules cardiaques, les CE sont sensibles aux lésions ischémiques qui peuvent avoir un impact sur leur capacité fonctionnelle. L'hypoxie est connue pour altérer l'intégrité de la CE, entraînant une augmentation de la perméabilité vasculaire et de l'infiltration leucocytaire [95]. Plus important encore, dans le contexte de la reperfusion myocardique, les CE peuvent agir comme une arme à double tranchant en favorisant la circulation sanguine tout en potentialisant les dommages cardiaques ischémiques par le biais d'un stress oxydatif accru [96]. En effet, il est reconnu que l'hypoxie et les ROS peuvent favoriser des altérations de la méthylation de l'ADN dans les CE, entraînant des modifications du phénotype et de la fonction et une perturbation de l'homéostasie vasculaire.

De plus en plus de preuves suggèrent que les CE peuvent subir un changement phénotypique en réponse à l'hypoxie, connue sous le nom de transition endothéliale-mésenchymateuse (EndoMT), dans laquelle les cellules adoptent des propriétés de type fibroblaste. Par exemple, les macrovasculaires de l'artère coronaire humaine (HCAEC) et les HCMEC ont montré un phénotype mésenchymateux après 72 h dans 1% d'oxygène (changements morphologiques, CD31 réduit, escargot élevé, SLUG, TWIST, S100A4 et -actine musculaire lisse) . Ceci a été associé à la perte du phénotype EC et à une expression réduite de RASAL1 en raison de l'augmentation de la méthylation des CpG médiée par le DNMT3A dans la région du promoteur [67], comme précédemment montré dans le myocarde des patients atteints d'IC ​​en phase terminale [49]. La perte de soutien vasculaire dans le cœur due à l'EndoMT conduit finalement à une hypoxie myocardique accrue, favorisant ainsi davantage l'EndoMT, la perte vasculaire et le remodelage cardiaque pathologique. En tant que tel, conserver le phénotype EC en ciblant la méthylation de l'ADN peut représenter une nouvelle approche pour atténuer l'endoMT induite par l'hypoxie dans l'IC.

En réponse à l'hypoxie, l'activation de la signalisation EC dépendante de HIF facilite une réponse angiogénique adaptative à un faible niveau d'oxygène environnemental qui semble impliquer des changements de méthylation de l'ADN. Par exemple, les HUVEC cultivées sous hypoxie (0,5 % d'oxygène) pendant 2 jours ont démontré une augmentation des niveaux d'adénosine intracellulaire en raison de la réduction dépendante du HIF de l'adénosine kinase (ADK), enzyme métabolisant l'adénosine. Ceci était associé à une capacité angiogénique accrue et à une activité réduite de la DNMT et à une hypométhylation globale au niveau des régions promotrices des gènes clés de l'angiogenèse, y compris KDR, NOS3, GATA4 et SEMA5 [68]. En revanche, une autre étude sur les HUVEC maintenues en hypoxie pendant 16 h a signalé une augmentation de la méthylation de l'ADN dans la région flanquante 5′ de NOS3 qui contient 13 éléments CpG, conduisant au recrutement de MBD2 et à la répression de l'expression d'eNOS, qui a été inversée par une suppression ciblée de l'ARNsi ainsi qu'une expression améliorée de KDR [66]. Des analyses complémentaires en Mbd2Les souris déficientes ont démontré une expression vasculaire accrue de l'expression d'eNOS et de KDR et une récupération améliorée de l'ischémie expérimentale des membres postérieurs indiquée par une densité capillaire et artériole accrue par rapport aux témoins de type sauvage [66]. Cette observation pourrait au moins en partie expliquer pourquoi les patients atteints de maladie vasculaire répondent mal aux agents pro-angiogéniques, car les modifications de la méthylation de l'ADN induites par l'hypoxie, médiées par des protéines effectrices telles que MBD2, peuvent favoriser un dysfonctionnement de la CE. En effet, les CE cérébrales murines (MCEC) exposées à la fois à l'anoxie et à la privation de glucose ont démontré une méthylation accrue de l'ADN au niveau du promoteur de la thrombospondine-1 (Thbs1), une glycoprotéine matricellulaire qui favorise les actions anti-angiogéniques en inhibant la signalisation VEGF/NO et la migration/prolifération des CE, ce qui a entraîné une réduction de l'expression de Thbs1 aux niveaux de l'ARN et des protéines [69, 97, 98, 99]. Fait intéressant, la restauration ultérieure des conditions normales d'oxygène et de glucose pendant 4 h a conduit à la déméthylation au niveau de la Thbs1 promoteur et la restauration de l'expression des gènes, suggérant que ces changements dynamiques de méthylation sont intrinsèquement réversibles au niveau cellulaire [69]. Inversement, il a été démontré que la culture de CE microvasculaires cutanées humaines (CEMH) en hypoxie (1 % d'oxygène) pendant 24 h augmentait les niveaux de THBS1, tandis que le traitement des CE normoxiques avec des milieux hypoxiques conditionnés par les CE a réduit la prolifération des CE et induit l'apoptose [100]. Bien que cette étude n'ait pas examiné THBS1 changements de méthylation, il est probable que les conditions de culture et les temps d'exposition différentiels (par exemple, privation d'anoxie et de glucose pendant 4 h [69] versus 1% d'oxygène et glucose normal pendant 24 h [100]) et l'utilisation de différentes CE (MCEC primaires versus HDMEC immortalisées ) a pu expliquer des résultats contrastés. Bien qu'ils ne soient pas concluants, ces travaux suggèrent collectivement que la méthylation de l'ADN peut jouer un rôle important dans la régulation des facteurs pléiotropes, tels que le THBS1, dans des populations uniques de CE dans différentes circonstances environnementales.

En plus des niveaux d'oxygène, la perfusion vasculaire et la direction du flux sanguin sont connues pour réguler la méthylation de l'ADN et l'expression des gènes dans les CE, plusieurs groupes mettant en évidence un rôle important pour DNMT1 dans la modulation de la fonction CE en réponse au stress de cisaillement et au flux différentiel. Par exemple, une expression accrue de DNMT1 nucléaire ainsi que des niveaux accrus de 5MeC ont été signalés dans des CE soumises à un stress de cisaillement faible et oscillatoire en utilisant à la fois des systèmes in vitro et in vivo [70]. De même, les niveaux élevés de DNMT1 en réponse à un flux sanguin perturbé ont été atténués avec le traitement 5aza [71]. Other studies have also reported increased DNMT1-mediated DNA methylation in the context of both increased shear stress (induced in vivo by vascular occlusion or in vitro using cone and plate flow apparatus) and unidirectional flow, associated with global hypermethylation of genes associated with cellular metabolism, nucleic acid turnover and transcription [72]. Interestingly, and consistent with the previously described study, increased expression of DNMT1 observed under unidirectional flow resulted in reduced monocyte adhesion to ECs which was reversed by treatment with 5azadC in both in vitro and in vivo models [72]. Notably, when ECs maintained under shear stress were exposed to reversed flow, DNMT1 expression remained unaltered whilst monocyte adhesion to ECs was increased, prompting the authors to propose that hypermethylation under shear stress with unilateral flow may limit the arteriogenic capacity of ECs, thereby preventing hypertrophy/hyperplasia which may lead to impaired perfusion and tissue hypoxia [72]. In addition to DNMT1, other DNMT enzymes have been implicated in regulating EC function in response to altered blood flow. For example, increased DNMT3A levels are reported in HAECs subjected to disturbed flow for 2 days, linked with hypermethylation at the promotor of anti-inflammatory and anti-thrombotic, KLF4, and decreased binding and expression of myocyte enhancer factor-2 [73]. DNMT3A-mediated methylation negatively impacted on downstream functional targets of KLF4 such as NOS3, THBD et MCP1, which was rescued by treatment with pharmacological inhibitors of DNMT (RG108 and 5aza) [73].

Collectively, these studies highlight that both hypoxia and abnormal perfusion dynamics can influence DNA methylation in ECs resulting in changes to their normal physiology and behaviour, thereby promoting EC dysfunction. Whilst there is clear potential for specifically targeting this epigenetic process in ECs for treatment of HF, particularly in the context of ischaemic cardiomyopathy, further investigation is required to define underlying mechanisms.


Résumé

Termini often determine the fate of RNA molecules. In recent years, 3′ ends of almost all classes of RNA species have been shown to acquire nontemplated nucleotides that are added by terminal nucleotidyltransferases (TENTs). The best-described role of 3′ tailing is the bulk polyadenylation of messenger RNAs in the cell nucleus that is catalyzed by canonical poly(A) polymerases (PAPs). However, many other enzymes that add adenosines, uridines, or even more complex combinations of nucleotides have recently been described. This review focuses on metazoan TENTs, which are either noncanonical PAPs or terminal uridylyltransferases with varying processivity. These enzymes regulate RNA stability and RNA functions and are crucial in early development, gamete production, and somatic tissues. TENTs regulate gene expression at the posttranscriptional level, participate in the maturation of many transcripts, and protect cells against viral invasion and the transposition of repetitive sequences.

  • RNA Interactions with Proteins and Other Molecules > Protein-RNA Recognition
  • RNA Processing > 3′ End Processing
  • RNA Turnover and Surveillance > Regulation of RNA Stability

Bruce A. Shapiro, Ph.D.

Dr. Shapiro directs research on computational and experimental RNA structure prediction and analysis and has pioneered research in the emerging field of RNA nanobiology. His work has led to several novel RNA folding and analysis algorithms, experimental techniques and discoveries in RNA biology. His interests include RNA nanobiology, nucleic acid structure prediction and analysis, the relationships between RNA structure and function. His has fostered a synergy between computational and experimental techniques, where computationally designed novel RNA based nanostructures have been shown to be able to self-assemble as predicted and be delivered to cell cultures and mouse models to control gene expression and thus show potential for use in RNA-based therapeutics. For additional information, please visit our web site at http://www-CCRNP.ncifcrf.gov/

1) RNA structure, 2) RNA folding, 3) RNA nanobiology – computational and experimental, 4) computational RNA structure prediction and analysis, 5) molecular dynamics, 6) RNA 3D modeling

Contact Info

A complete understanding of the function of RNA molecules requires knowledge of their higher order structures (2D and 3D) as well as the characteristics of their primary sequence. RNA structure is important for many functions, including regulation of transcription and translation, catalysis, transport of proteins across membranes and the regulation of RNA viruses. The understandings of these functions are important for basic biology as well as for the development of drugs that can intervene in cases where pathological functionality of these molecules occurs.

Our group does research and development of methodologies for improving RNA folding and analysis techniques to help further our understanding of the functional properties of these molecules. In addition, we are focusing on the emerging field of RNA nanobiology. RNA represents a relatively new molecular material for the development of biologically oriented nano devices. It is an interesting material because of its natural functionalities, its ability to fold into complex structures and self-assemble. We have developed computational and experimental methodologies that permit the design of RNA-based nanoparticles that potentially have a variety of uses. Thus, our research on RNA covers five highly related and integrated areas of research:

  1. Research in algorithms for RNA secondary structure prediction and analysis
  2. RNA biology and its relationship to sequence and secondary structure folding characteristics
  3. Research in algorithms for RNA 3D structure prediction and analysis and their application to RNA biology
  4. Research in algorithms for the design and analysis of RNA nanoparticles
  5. Experimental design, synthesis and delivery of RNA-based nanoparticles.

What is learned in one area is applied to the other areas, enhancing our understanding of RNA structure, function, and RNA nanobiology and self-assembly.

Parallel Computational Biology and RNA Structure
Revolutionary changes in computational paradigms are required to maintain the necessary computational power to solve problems in molecular biology. Methodologies based on sequential computer architectures could not be expected to continually keep pace with the needed computational speeds. In order to accommodate the high speeds that are necessary, highly parallel computational techniques are now employed. Our group was one of the pioneers in the area of computational biology and the use of parallel high performance computer architectures for this endeavor.

Computational Techniques for RNA Secondary Structure Prediction and Analysis
We were the first to develop an RNA folding technique that uses concepts from genetic algorithms. Our algorithm, MPGAfold, was originally developed to run on a massively parallel SIMD supercomputer, a MasPar MP-2 with 16384 processors. This algorithm was modified and now runs on parallel high performance Linux clusters. Exceptional scaling characteristics are obtained with the ability to run the algorithm with hundreds of thousands of population elements. RNA pseudoknot prediction is part of the genetic algorithm, resulting in its ability to predict tertiary interactions. Other features include simulation of co-transcriptional folding, the ability to incorporate different energy rules, and the forced inhibition and embedding of desired helical stems. In addition, STRUCTURELAB, our heterogeneous bioinformatical RNA analysis workbench, can be used in conjunction with MPGAfold and RNA2D3D to produce predicted 3D atomic coordinates of RNA structures along with the visualization of these structures. Also, we developed a novel interactive visualization methodology that is part of STRUCTURELAB. This technique enables the comparison and analysis of multiple sequence RNA folds from a phylogenetic point of view, thus allowing improvement of predicted structural results across a family of sequences.

We developed KNetFold, a novel and powerful algorithm for RNA structure prediction from sequence alignments. The algorithm uses a unique hierarchical classification network based on mutual information, thermodynamics and Watson-Crick base-pairedness to predict structures. In addition, we have developed a web-based application, CorreLogo, that uses mutual information derived from RNA sequence alignments to determine covariations amongst base-paired positions. The algorithm includes a unique error measure and depicts results in 3D.

We developed, CyloFold, a unique algorithm for predicting, from a single sequence, RNA secondary structures that may include pseudoknots. This algorithm utilizes a novel technique that approximates the potential for 3D steric clashes in the predicted structures, thus filtering out those structures from consideration. The algorithm has been shown to have high accuracy when compared to other algorithms of its type.

We developed web software based on a Bayesian statistical approach that estimates the accuracy of base pair formation from data derived from SHAPE (Selective 2' - Hydroxyl Acylation analyzed by Primer Extension) experiments. The statistical/probabilistic results were derived by analyzing known RNA 3D structures having various types of known base interactions, and correlating them with SHAPE values. It was shown that low SHAPE values correlate well with Watson-Crick base pairing and stacking interactions while high SHAPE values indicate single stranded regions. Improvements could be seen if a 2 or 3 base context was also taken into account. We also showed that other types of known interactions did not correlate well. This type of information is helpful in ultimately determining the secondary structure of RNAs.

Computational Studies of RNA Folding Pathways
RNA folding pathways are proving to be quite important in the determination of RNA function. Studies indicate that RNA may enter intermediate conformational states that are key to its functionality. These states may have a significant impact on gene expression. It is known that the biologically functional states of RNA molecules may not correspond to their minimum energy state, that kinetic barriers may exist that trap the molecule in a local minimum, that folding often occurs during transcription, and cases exist in which a molecule will transition between one or more functional conformations before reaching its native state. Thus, methods for simulating the folding pathways of an RNA molecule, including co-transcriptional folding, and locating significant intermediate states are important for the prediction of RNA structure and its associated function. Several biological RNA folding pathways have been successfully studied using MPGAfold and STRUCTURELAB. Examples include the potato spindle tuber viroid, the host-killing mechanism of Escherichia coli plasmid R1, the hepatitis delta virus, HIV, and the dengue virus. These computational results are consistent with those derived from biological experiments. In addition, novel structural interactions and important functional intermediate and native states have been predicted. These have led to further successful confirmatory experiments.

Computational Prediction of RNA Interaction Networks
We have also developed programs CovaRna and CovStat to explore long-range co-varying RNA interaction networks using whole genome alignments. This new methodology, which was applied to Drosophile genomes, is currently being applied to other genomes. A parallel version of the program was devised to speed-up processing and the algorithms also rely on fast indexing schemes and conservative statistical methods to determine highly significant interactions. The methodology has found interesting interactions that are related to endogenous siRNAs, gene transport and genes related to morphogenesis.

Computational Studies of Three-Dimensional RNA Structures
Some structural elements of RNA molecules have been studied using molecular mechanics and molecular dynamics simulations. The structures examined include an RNA tetraloop where temperature-dependent denaturation of the tetraloop and the subsequent refolding to the original crystal structure were performed. A three-way junction from the core central domain of the 30S ribosomal subunit from Thermus thermophilus was explored. It has been experimentally determined that the intermolecular interactions between the three-way junction and the S15 ribosomal protein initiate the process of the assembly of the 30S ribosomal subunit. By using molecular dynamics simulations we obtained insights into the conformational transitions of the junction associated with the binding of S15. We determined using, molecular dynamics simulations, the structural effects of utilizing new types of modified RNA nucleotides containing carbocyclic sugars that are constrained to north or south conformations (C2' or C3' exo). In addition, we showed using molecular dynamics simulations, how ions and flanking bases play a very important role in human immunodeficiency virus (HIV) kissing loop monomer conformations. These results correlate well and may explain in detail, experimental studies that indicate the importance of ions for HIV-1 dimerization.

We have also examined the pseudoknot domain of telomerase. Molecular modeling and molecular dynamics of the pseudoknot domain, including its hairpin loop, were performed. Results indicated how the hairpin loop dynamics affected the opening and closing of the non-canonical U-U base pairs found in the stem. The opening suggested nucleation points for the formation of the pseudoknot. We have also examined the effect of dyskeratosis congenita (DKC) mutations in the loop and how they reduced the propensity for the opening of the stem by forming a relatively stable hydrogen bond network in the hairpin loop. We modeled the pseudoknot itself using our RNA2D3D software combined with phylogenetic analysis. We studied the dynamical impact of the DKC mutations on the pseudoknot with the result that the pseudoknot became unstable while the hairpin form became more stable.

We discovered and elucidated the 3D structures of new types of translational enhancers that are found in the 3' UTRs of the Turnip Crinkle Virus (the first of its kind found) and the Pea enation Mosaic Virus. The discovery of these structural elements has brought to light new mechanisms for translational enhancement in eukaryotic plant viruses that may have broader implications for understanding translational mechanisms in general. This was accomplished with the combined use of MPGAfold, our 3D molecular modeling software RNA2D3D, and close interactions with our experimental collaborators. We also modeled a novel pseudoknot found in the CCR5 mRNA. This pseudoknot is involved in frameshifting and appears to be stabilized by a microRNA, a novel function for a microRNA.

In addition, we have employed methods based on elastic network interpolation to reduce the computational costs related to RNA 3D dynamics. Three-dimensional dynamics trajectories can be determined using a reduced atom representation and given conformational states. Compute time can be reduced from weeks to hours using this approach.

Computational RNA Nanobiology
RNA nanobiology represents a new modality for the development of nanodevices that have the potential for use in a number of areas, including therapeutics. Building on our experience as outlined above, we developed several computational and experimental techniques (see below) that provide a means to determine a set of nucleotide sequences that can assemble into desired nano complexes. One of these tools is a relational database called RNAJunction. The database contains structure and sequence information for known RNA helical junctions and kissing loop interactions. These motifs can be searched for in a variety of ways, providing a source for RNA nano building blocks. Another computational tool, NanoTiler, permits a user to construct specified RNA-based nanoscale shapes. NanoTiler provides a 3D graphical view of the objects being designed and provides the means to work interactively or with computer scripts on the design process even though the precise RNA sequences may not yet be specified, and an all-atom model is not available. NanoTiler can use the 3D motifs found in the RNAJunction database with those derived from specified RNA secondary structure patterns to build a defined RNA nano shape. Also, a combinatorial search can be applied to enumerate structures that would not normally be considered.

Another web-based software tool for RNA nanostructure design is NanoFolder, which is one of the few software tools that are capable of predicting the structure and sequence attributes of multi-stranded RNA constructs. With this software it is possible to specify the desired secondary structure motifs and have the software predict the set of sequences that generate these desired motifs with the correct intra- and inter-strand folding characteristics.

Experimental RNA Nanobiology
Based on the above described computational approaches to RNA nanodesign we have demonstrated the ability to experimentally self-assemble and functionalize several RNA-based nanoparticles. This was accomplished with close interactions between the experimental and computational approaches leading to enhancements to both sets of methodologies. Examples include the self-assembly of 6 and 10 stranded cubes the self-assembly of hexagonal rings of various sizes and double rings utilizing an RNA motif extracted from nature the modification of sequences in the motif to improve yield while also maintaining appropriate geometries and the self-assembly of triangular structures. We also developed techniques that define self-assembly protocols and that allow for co-transcriptional assembly of constructs that can also include modified bases to increase the chemical stability of these nanoparticles. In addition, we have functionalized these particles with up to six different siRNAs to enable controlled stoichiometry and gene silencing, and showed that these particles do indeed silence the designated genes when transfected into various cell lines.

We have also been exploring another paradigm based on the use of RNA/DNA hybrid nanoconstructs containing split functionalities. This allows, for example, the splitting of a Diceable siRNA into two DNA/RNA hybrid components with DNA toeholds, which when transfected into cells reassembles into a DNA duplex and a Diceable siRNA. This hybrid approach has been incorporated in our hexagonal nanorings and nanocubes. The utility of this approach permits, amongst other things, controlled activation of functionalities, incorporation of molecular beacons on the DNA strands without intefering with RNA functionality and resistance to nuclease degradation. This approach has been tried successfully in cell cultures and xenograph tumor mouse models.


Voir la vidéo: 5-3. 세포내정보의흐름 (Août 2022).