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1 : Préparation des milieux - Biologie

1 : Préparation des milieux - Biologie


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Objectifs d'apprentissage

  • Comprendre comment faire des médias, comment les stériliser et comment les distribuer dans différents formats.
  • Produire des plaques TSA, des pentes TSA et du TSB qui seront utilisés dans les périodes de laboratoire ultérieures.
  • Comprenez les bases d'un autoclave et comment il stérilise, y compris les paramètres.

Les bactéries et les champignons sont cultivés sur ou dans des milieux microbiologiques de divers types. Le milieu utilisé pour cultiver le micro-organisme dépend du micro-organisme que l'on essaie d'isoler ou d'identifier. Différents nutriments peuvent être ajoutés au milieu, le rendant plus riche en protéines ou en sucre. Divers indicateurs de pH sont souvent ajoutés pour différencier les microbes en fonction de leurs réactions biochimiques : les indicateurs peuvent prendre une couleur lorsqu'ils sont légèrement acides, une autre couleur lorsqu'ils sont légèrement basiques. D'autres ingrédients ajoutés peuvent être des facteurs de croissance, (ce{NaCl}) et des tampons de pH qui empêchent le milieu de s'éloigner trop de la neutralité pendant que les microbes se métabolisent.

Dans cet exercice, vous allez créer des supports tout usage appelés bouillon trypticase soja et gélose trypticase soja. Ces 2 milieux----l'un liquide et l'autre solide---sont exactement la même formule à l'exception de l'ajout d'agar agar (vraiment-agar agar), un extrait des parois cellulaires des algues rouges.

L'ancienne façon de faire des médias était la méthode du livre de cuisine --- en ajoutant chaque ingrédient petit à petit. Le seul moment où cela est fait aujourd'hui, c'est lors de la fabrication d'un milieu spécial pour faire pousser un certain organisme capricieux, où des facteurs de croissance particuliers, des nutriments, des vitamines, etc., doivent être ajoutés en certaines quantités. Ce milieu est appelé milieu chimiquement défini (synthétique). Heureusement, les bactéries les plus courantes que nous voulons cultiver s'adapteront bien aux milieux que nous utilisons couramment en laboratoire. Certains de nos supports sont achetés, mais la plupart sont produits dans la zone de préparation derrière le laboratoire. Étant donné que ce type de support contient des ingrédients inconnus, ou parfois des quantités inconnues, il est appelé support complexe.

Il est vraiment très simple de faire des médias complexes de nos jours :

  • réhydrater la forme poudreuse du milieu
  • remuer et faire bouillir le milieu gélosé pour obtenir la poudre de gélose dissoute (si vous faites un milieu gélosé plutôt qu'un milieu de bouillon)
  • répartir le milieu dans des tubes
  • autoclave pour stériliser le milieu du tube
  • autoclaver le milieu gélosé pour la production de plaques, puis verser dans des boîtes de Pétri stériles

STÉRILISATION ET AUTOCLAVE

Lorsque le milieu microbiologique a été fabriqué, il doit encore être stérilisé en raison de la contamination microbienne de l'air, de la verrerie, des mains, etc. En quelques heures, des milliers de bactéries se reproduiront dans le milieu, il doit donc être stérilisé rapidement avant les microbes. commencer à utiliser les nutriments. Le processus de stérilisation est une destruction à 100 % et garantit que le milieu restera stérile SAUF exposé à des contaminants par une technique aseptique moins qu'adéquate à l'exposition à l'air.

La stérilisation des médias est effectuée avec l'autoclave, essentiellement un énorme cuiseur à vapeur. La vapeur pénètre dans une enveloppe entourant la chambre. Lorsque la pression de la vapeur est à un certain point dans la chemise, une vanne permet à la vapeur d'entrer dans la chambre. La pression augmentera de plus de 15 livres par pouce carré (psi) : à ce stade, la minuterie commence à décompter --- généralement pendant 15 minutes, selon le type de support. La haute pression dans un récipient fermé permet à la température de dépasser la température la plus élevée que l'on puisse obtenir en faisant simplement bouillir, autour de 121⁰C. Par conséquent, les paramètres de stérilisation avec un autoclave sont de 121⁰C à >15 psi pendant 15 minutes. Quinze minutes est le temps de mort thermique pour la plupart des organismes (à l'exception de certains spores très résistants).

Les médias préparés sont distribués de différentes manières, selon la forme que l'on crée. Les bouillons et les profondeurs de gélose sont distribués dans des tubes puis stérilisés. Les tubes inclinés de gélose sont stérilisés, puis le support est incliné pour permettre à la gélose de se solidifier de manière inclinée. Le milieu gélosé à verser dans les plaques est stérilisé dans un flacon, puis versé par la suite. Tous les milieux ou solutions ne peuvent pas être stérilisés à l'autoclave. Certaines solutions riches en protéines telles que l'urée, les vaccins et le sérum se dénatureront dans la chaleur extrême, et il faudra donc peut-être les stériliser par filtre sans chaleur. Vous préparerez des milieux inclinés et en bouillon, mais pas des milieux en plaque dans ce laboratoire.

MATÉRIEL NÉCESSAIRE (par table)

  • 2 bateaux de pesée en plastique
  • 1 porte-tubes à essai
  • Fiole Erlenmeyer de 1 litre
  • 1 pompe pipette
  • 1 éprouvette graduée plusieurs pipettes en verre non stériles de 10 ml
  • 1 spatule
  • 28 tubes à essai moyens non stériles
  • 1 pot de poudre d'agar 15 capsules vertes
  • 1 pot de poudre de bouillon de soja trypticase nutritif
  • 15 casquettes jaunes
  • 1 barreau magnétique
  • 1 pot pour pipette

LA PROCÉDURE

Reportez-vous au schéma ci-dessous pour l'ensemble de la production :

  1. Commencez à préparer le TSB (bouillon) en versant 250 ml d'eau distillée dans un flacon de 500 ml ou 1 L. Mettez la barre d'agitation et allumez la plaque d'agitation de sorte que la surface soit juste perturbée. Ajoutez 3,25 grammes de poudre de TSB dans ce flacon et laissez-le se dissoudre (cela se produira rapidement). Pas de chaleur doivent être appliqués à ce stade.
  2. Une fois la poudre dissoute, pipeter 5 ml vert casquette.

Les capuchons verts sont toujours utilisés pour le TSB.

  1. Avec la solution restante (environ 100 ml) toujours en agitation, ajoutez 2 grammes de poudre d'agar.
  2. L'étape suivante vous demandera d'appliquer de la chaleur au mélange. Avant de faire cela, cependant, vous devez savoir que la gélose a une forte tendance à déborder lorsqu'elle atteint 100⁰C. Un membre de votre groupe devrait surveiller le flacon en tout temps une fois que vous voyez de la vapeur s'en échapper. Au premier signe que le mélange est proche de l'ébullition, SUPPRIMER de la plaque chauffante (essuie-tout autour du col du ballon). NE PAS éteignez simplement le feu, en laissant le flacon reposer là. La plaque métallique retient une quantité importante de chaleur, et éteindre la chaleur n'empêchera pas le ballon de déborder. Les serviettes en papier pliées vous permettent de saisir fermement le col du flacon sans vous brûler la main.
  3. Avez-vous lu l'étape 4 ? OK, alors vous pouvez allumer le chauffage au réglage 9 (pas élevé). Assurez-vous que la barre magnétique agite la solution.
  4. À ébullition, la gélose se dissout, elle deviendra claire et bronzée plus profonde. Retirez-le du feu et pipetez des aliquotes de 5 ml dans 15 tubes pour pentes (ne seront pas des pentes BE jusqu'à ce qu'elles soient retirées de l'autoclave et inclinées sur le côté pour se solidifier). Couvrir les tubes inclinés avec jaune casquettes. LE RESTE DE L'AGAR LE MILIEU DANS LE FLACON SERA VERSER DANS 1 GRAND FLACON POUR LA CLASSE.

À partir de ce moment, des bouchons jaunes seront utilisés pour les géloses inclinées nutritives.

Noter

Si la gélose se solidifie dans la pointe de la pipette, jetez la pipette dans le pot de la pipette et récupérez-en une autre. Pour éviter cela, soit pipeter tous les tubes en même temps, soit laisser la pipette dans le flacon de gélose fondue.

  1. Placez tous les tubes que vous avez pipetés dans les supports d'autoclave en plastique sur la table de l'instructeur ainsi que le reste de votre gélose fondue. Toutes les géloses inclinées vont dans un rack, les bouillons dans un autre rack, etc.
  2. Jetez vos pipettes usagées dans le porte-pipette. Ces pipettes en verre sont réutilisables, ne les jetez donc pas à la poubelle.

Des questions

  1. Qu'est-ce qu'un médium complexe ?
  2. Pourquoi des tampons de pH sont-ils ajoutés aux milieux de croissance pour les microbes ?
  3. Comment la température dans l'autoclave peut-elle dépasser la température d'ébullition de 212 F ?
  4. Pourquoi faire bouillir la solution d'agar AVANT de la distribuer dans des tubes ?
  5. A quelle température la gélose se solidifie-t-elle ?

Culture de micro-organismes : 5 étapes

Les points suivants mettent en évidence les cinq étapes principales de la culture de micro-organismes. Les étapes sont les suivantes : 1. Préparation des milieux 2. Ajustement du pH des milieux 3. Préparation des piques et des pentes 4. Versement des plaques 5. Inoculation des bactéries dans les pentes nutritives et les plaques de gélose.

Étape # 1. Préparation des médias :

Lors de la préparation d'un milieu de culture pour tout micro-organisme, l'objectif principal est de fournir un mélange équilibré des nutriments nécessaires, à des concentrations qui permettront une bonne croissance. Aucun ingrédient ne doit être donné en excès car de nombreux nutriments deviennent inhibiteurs de croissance ou toxiques à mesure que la concentration augmente.

Un milieu composé entièrement de nutriments chimiquement définis est appelé milieu synthétique. Celui qui contient des ingrédients de composition chimique inconnue est appelé milieu complexe. À différentes fins en laboratoire, le milieu est utilisé soit ‘solid’, soit ‘liquid’.

A. Milieu liquide ou bouillon :

Le bouillon nutritif est la base de la plupart des milieux utilisés dans l'étude de différents types de microbes. C'est l'un des milieux liquides les plus importants utilisés à des fins bactériologiques.

(i) Flacon – Capacité 1000 ml.

(ii) Éprouvette graduée – 500 ml.

(iii) Extrait de boeuf, bactopeptone, eau distillée.

(iv) Balance et boîte de poids.

(v) papier pH, bloc comparateur, 0,1 (N) NaOH et 0,1 (N) HCl soln.

Pour faire 300 ml de bouillon nutritif : –

0,9 g. d'extrait de boeuf et 1,5 g de bactopeptone sont pesés séparément et prélevés dans une fiole conique. Puis 300 ml dist. de l'eau est ajoutée et les ingrédients sont bien mélangés. Le pH est ajusté en ajoutant un peu d'alcali (Solution NaOH). Le ballon est ensuite bouché avec du coton et autoclavé à 15 lbs. pression pendant 15 minutes.

2. Bouillon pomme de terre-dextrose :

C'est un type de médium semi-synthétique. Ceci est très souvent utilisé pour le milieu de croissance des champignons qui poussent mieux dans le bouillon pomme de terre-dextrose que dans le bouillon nutritif.

Pomme de terre fraîchement épluchée – 400 g. (40%)

(ii) Éprouvette graduée – 250 ml.

(iii) Pomme de terre, Dextrose et eau distillée.

(iv) Les autres exigences sont identiques à celles de la préparation de bouillon précédente.

Pour faire 200 ml de bouillon :

80 g de pomme de terre fraîchement épluchée et 5 g de Dextrose sont pesés et prélevés dans une fiole conique. 200 ml de dist. l'eau est versée dans le ballon et les ingrédients sont soigneusement mélangés par une tige de verre. (En fait, la pomme de terre épluchée est bouillie dans un ballon en utilisant 100 ml d'eau pendant 10 min et l'extrait est prélevé par décantation). Le ballon est bouché et autoclavé à 15 lbs. pression pendant 15 minutes.

B. Milieu solide ou gélose :

La gélose nutritive est un milieu important à des fins bactériologiques. Il s'agit simplement d'un bouillon nutritif solidifié par l'ajout d'agar. En raison de sa consistance solide, ce milieu est un bon appareil pour la culture de bactéries sur une surface solide.

Peptone bactériologique – 5 g. (0,5 %)

ii) Éprouvette graduée – 500 ml.

iii) Extrait de bœuf, bactopeptone, gélose et eau distillée.

iv) Balance et boîte de poids.

v) Papier pH, bloc comparateur 0,1 (N) HCl et 0,1 (N) NaOH soln.

Pour préparer 500 ml de gélose nutritive :

7,5 g. d'agar en poudre est pesé et prélevé dans un ballon contenant 250 ml d'eau distillée. Le contenu est ensuite chauffé au bain-marie pour permettre à la gélose de se dissoudre. Dans un autre ballon 1,4 g d'extrait de bœuf et 2,5 g de peptone sont dissous dans 250 ml d'eau distillée. Le pH est ensuite ajusté et contrôlé avec du papier pH.

Les deux solutions sont ensuite versées dans un ballon de 500 ml, bien agitées puis chauffées doucement. Ensuite, le milieu est distribué dans des tubes de culture et des flacons coniques (comme le milieu de culture stock est autoclavé à 15 lb de pression pendant 15 min après avoir bouché les tubes et le flacon).

2. Pomme de terre-Dextrose-Agar (P.D.A.) :

Le milieu pomme de terre-dextrose-agar est très souvent utilisé pour la culture de champignons. Il s'agit simplement d'un bouillon de dextrose de pomme de terre solidifié par ajout d'agar.

Pomme de terre fraîchement épluchée – 400 g. (40%)

(ii) Éprouvette graduée – 500 ml.

(iii) Extrait de bœuf, bactopeptone, gélose et eau distillée.

(iv) Balance et caisse de pesée.

(v) papier pH, bloc comparateur 0,1 (N) HCl et 0,1 (N) NaOH soln.

Pour faire 300 ml de P.D.A. : –

4,5 g d'agar sont prélevés dans un ballon contenant 150 ml d'eau distillée. Le contenu est chauffé au bain-marie pour dissoudre la gélose. 120 g de pomme de terre fraîchement épluchée sont prélevés dans un flacon et 150 ml d'eau y sont ajoutés. Il est bouilli pendant 10 minutes. Ensuite, cet extrait de pomme de terre est prélevé et son volume est porté à 150 ml par addition d'eau. À cet extrait, 7,5 g de dextrose sont ajoutés et soigneusement mélangés.

Maintenant, les deux solutions ci-dessus sont versées dans un flacon de 500 ml et bien agitées. Ce milieu est distribué dans des tubes et flacons de culture. Les tubes et flacons sont bouchés (Fig. 2.1.) et autoclavés.

(i) La gélose doit être liquéfiée correctement avant d'être mélangée au bouillon.

(ii) La gélose ne doit pas être trop chauffée, sinon elle perdra sa capacité à se solidifier.

(iii) La distribution doit être effectuée rapidement, sinon la gélose se solidifiera.

Une liste détaillée de la composition des différents milieux est donnée en annexe.

Étape # 2. Ajustement du pH des médias:

Principe:

La concentration en ions hydrogène des milieux de culture est d'une importance primordiale pour la réussite de la culture des bactéries. Certaines espèces poussent mieux en milieu acide, d'autres en milieu alcalin encore d'autres préfèrent des substrats neutres en réaction. La concentration en H + c'est-à-dire

Ainsi, pour la croissance d'un macro-organisme particulier, le milieu doit avoir un pH spécifique. Pour ajuster le pH, l'acide et l'alcali sont utilisés.

Conditions:

(ii) papier pH et étalon de couleur

(iv) 0,1 (N) NaOH et 0,1 (N) HCl solution.

Procédure:

La méthode la plus simple pour déterminer le pH d'un soln. consiste à utiliser du papier pH disponible dans le commerce qui est imprégné d'un indicateur. Ce dernier donne un changement de couleur sur une gamme de pH de 6,4 à 8,2. Une bande de papier pH est découpée en petits morceaux et chaque morceau est placé dans un puits sur le bloc comparateur.

À l'aide d'une tige de verre, une goutte de milieu est prélevée et placée sur le morceau de papier pH. La couleur résultante est comparée à la norme de couleur fournie.

Le pH du milieu, s'il s'avère acide, est amené au pH requis en ajoutant goutte à goutte 0,1 (N) de NaOH et en testant avec du papier pH après avoir soigneusement mélangé avec une tige de verre. A l'inverse, 0,1 (N) HCl est utilisé pour obtenir un pH acide du milieu.

Précautions:

(i) Pendant la neutralisation du bouillon, un acide ou un alcali doit être ajouté goutte à goutte.

(ii) Après avoir ajouté de l'acide ou de l'alcali, le milieu doit être agité pour assurer un mélange correct de l'acide ou de l'alcali ajouté.

(iii) A chaque étape, la réaction colorée doit être notée.

Étape # 3. Préparation des stabs et des slants :

Procédure:

Afin de préparer les stabs, le milieu est versé jusqu'à 1/2 du tube de culture (environ 20 ml), qui est ensuite bouché soigneusement et stérilisé en autoclave. Après stérilisation, le tube de culture est maintenu droit dans un support de tube à essai jusqu'à ce que le milieu se solidifie. Ensuite, ils sont collectés dans un panier en grillage et conservés.

Afin de préparer “pentes” le milieu est prélevé jusqu'à 1/4 d'un tube de culture (environ 7 ml) à l'aide d'une éprouvette et d'un entonnoir. Ensuite, les tubes de culture sont bouchés et autoclavés. Après stérilisation, avant que le médium ne durcisse, les tubes sont inclinés sur une paillasse en les appuyant contre une longueur d'un bâton de bois de 1/2&8243 d'épaisseur de telle manière que le médium ne touche pas le bouchon.

Les tubes de culture sont maintenus dans cette position jusqu'à ce que le milieu se solidifie. Après solidification du milieu, les « pentes » sont recueillies dans un panier grillagé et conservées avec une étiquette indiquant la date de préparation et la nature du milieu (Fig. 2.2).

Précautions:

(i) Les tubes de culture doivent être bouchés avec du coton non absorbant.

(ii) Il est à noter que lors de la distribution, le milieu ne colle pas aux parois des tubes de culture.

(iii) Pendant l'inclinaison, il faut veiller à ce que le milieu ne touche pas le bouchon.

(iv) Le poignardage ou l'inclinaison doit être effectué juste avant la solidification, c'est-à-dire à environ 47°C, sinon il y aura de l'eau à l'intérieur de l'inclinaison.

(v) Les stabs et les obliques ne doivent pas être perturbés avant que le milieu ne se solidifie.

Étape # 4. Coulage des assiettes:

Principe:

La culture sur plaque consiste en un organisme se développant sur un milieu solide contenu dans une boîte de Pétri. “Le versage des plaques” fait référence au processus consistant à verser de la gélose nutritive fondue dans des boîtes de Pétri. Par ce processus, une plus grande surface est créée pour la croissance des microbes dans toutes les directions.

Conditions:

(i) Gélose nutritive “stab” ou milieu en flacon.

(ii) Boîtes de Pétri stérilisées.

(iv) Coton absorbant, alcool rectifié, crayon à verre, etc.

Procédure:

Le milieu solide contenu dans des tubes ou flacons de culture est fondu au bain-marie. Une fois la gélose parfaitement fondue, le milieu est laissé refroidir aux alentours de 45°C. La table de travail est nettoyée et stérilisée avec du coton imbibé d'alcool rectifié. Les mains sont également stérilisées à l'alcool rectifié.

Le bouchon de coton du tube ou flacon fondu est ouvert à proximité d'une flamme et l'embouchure du tube/flacon est flambée dans une position semi-horizontale. Avec la main gauche, le couvercle d'une boîte de Pétri est soulevé assez loin pour permettre à l'embouchure du tube ou du flacon d'entrer sans toucher les côtés.

Environ 15 ml de milieu sont versés rapidement et avec précaution dans la boîte de Pétri, le tube/flacon est retiré et le couvercle ou le couvercle est remis en place. La boîte de Pétri est légèrement inclinée avec le mouvement du poignet pour permettre un étalement homogène du milieu (Fig. 2.3). Lorsque le milieu se solidifie, les plaques sont incubées à 30°C en position inversée c'est-à-dire à l'envers afin que la goutte d'humidité ne tombe pas sur le milieu.

Précautions:

(i) Tous les travaux doivent être effectués de manière aseptique.

(ii) Après solidification, les plaques doivent être maintenues à l'envers.

(iii) Pendant le versement, il convient de noter que l'embouchure du tube/flacon ne touche aucune partie de la boîte de Pétri.

Étape # 5. Inoculation de bactéries dans des pentes de nutriments et des plaques de gélose:

Matériaux nécessaires:

(i) Des pentes de nutriments et des plaques de gélose nutritive.

(iv) Inclinaison de la culture bactérienne :

Méthode:

Tout d'abord, l'aiguille d'ensemencement (Fig. 2.4) est stérilisée en chauffant fortement dans une flamme et refroidie en la maintenant à l'extérieur de la flamme. Après avoir refroidi davantage l'aiguille en la touchant sur le milieu « ? une manière en zigzag.

Chaque culture bactérienne est ensemencée en double. L'aiguille est ensuite flambée pour assurer la destruction des bactéries dans l'aiguille. (Fig. 2.5).

Pour les plaques à stries, l'inoculum est prélevé de la même manière que mentionné et touché sur le milieu solide dans une plaque. L'aiguille est flambée pour tuer les bactéries en excès et refroidie. L'inoculum est étalé en traçant un trait avec l'aiguille (Fig. 2.6). L'aiguille est à nouveau brûlée dans le même but et refroidie.

Des lignes continues et en zigzag sont striées de manière à réduire progressivement le nombre de cellules le long de la ligne et à obtenir des colonies isolées isolées après incubation. Toute l'opération d'ensemencement est réalisée de manière aseptique devant une flamme forte. Les pentes et plaques inoculées (en position inversée) sont incubées une nuit à 37°C.


PRINCIPE DU MILIEU NUTRITIONNEL AGAR (NAM)

Les bactéries sont régulièrement cultivées dans un milieu solide, c'est-à-dire du milieu gélosé nutritif (NAM) pour obtenir les colonies discrètes des bactéries présentes dans l'échantillon ou pour obtenir des informations sur les caractéristiques de culture des bactéries sur un milieu solide, la morphologie des colonies et les schémas de croissance, etc. Le milieu de base solide, utilisé en laboratoire de bactériologie constitue les 4 composants essentiels –

Extrait de boeuf – C'est le dérivé de bœuf qui est une riche source de carbone organique, d'azote, de vitamines et de sels inorganiques qui favorise la croissance rapide des bactéries en laboratoire à une température, un pH et une pression osmotique optimaux.

Peptone – C'est une protéine semi-digérée qui est soluble dans l'eau et facilement métabolisée par la cellule bactérienne, fournit la riche source de protéines à la cellule bactérienne de la croissance rapide.

Chlorure de sodium – Il maintient la pression osmotique dans le milieu gélosé afin que le mouvement des molécules s'effectue dans et hors de la cellule bactérienne. Il doit être présent dans les bonnes proportions sinon il conduira à la lyse de la cellule bactérienne.

Agar-Agar – Il est souvent appelé Agar, est un polysaccharide complexe, un glucide composé de 3, 6-Anhydro-L-galactose et D-galactopyranose, sans azote, produit à partir de diverses algues rouge-violet appartenant à Gelidium, Gracilaria, Gigastina etc. Il se liquéfie en chauffant à 96 °C et durcit en gelée en refroidissant à 40-45 °C.

La méthodologie expliquée dans cet article est basée sur le milieu HiMedia Labs Sabouraud Dextrose Broth que vous pouvez consulter ici

Les composants mentionnés ci-dessus peuvent être modifiés en ajoutant les diverses substances de diverses manières selon les exigences de la bactérie afin que la croissance rapide et satisfaisante de la cellule bactérienne ait lieu.


Préparation du stock 5X

Ajouter les réactifs suivants dans un flacon de 2 litres :

  • 10 g (NH4)2DONC4
  • 68 g KH2Bon de commande4
  • 2,5 mg de FeSO4.7H2O
  • 1 litre d'eau distillée de haute qualité

Une fois les ingrédients ajoutés, chauffer sous agitation jusqu'à dissolution complète des composants. Ajuster à pH 7 avec KOH. Verser la solution dans des bouteilles plus petites avec des bouchons desserrés et l'autoclave à 15 lb/in 2 pendant 15 min. Si vous souhaitez ajouter des antibiotiques ou des suppléments nutritionnels, ne le faites qu'une fois le cycle d'autoclavage terminé, car la température élevée peut détruire ces composants. Attendez que le flacon soit à moins de 50°C (il doit être chaud au toucher), puis ajoutez les composants. Une fois les flacons refroidis à moins de 40°C, les bouchons peuvent être serrés et le milieu concentré conservé indéfiniment à température ambiante.


1 : Préparation des milieux - Biologie

Résumé de l'article:

Milieux de culture de tissus végétaux : types, constituants, préparation et sélection
Auteur: Cornélius Onye Nichodème

INTRODUCTION

La culture de tissus végétaux est un milieu de croissance végétale utilisé en laboratoire pour la culture de cellules végétales. Il s'agit généralement d'un milieu solide, liquide ou semi-solide conçu pour favoriser la croissance de parties de plantes (explants), de cellules ou de micro-organismes. Dans la culture de tissus végétaux, différents types de milieux de culture sont utilisés pour cultiver diverses plantes. Par conséquent, chaque plante a un milieu de culture spécifique idéal pour sa croissance et son développement. Les milieux de culture de tissus végétaux (milieu) sont également appelés milieux de croissance, milieu de culture, substrat, etc. En général, tout comme le milieu de culture de tissus végétaux du sol, joue trois rôles principaux

1. Soutenir physiquement la croissance des plantes

2. Permettre une croissance maximale des racines

3. Fournissez à la racine les nécessités telles que l'eau, l'air et les nutriments.

Les milieux de culture sont en grande partie responsables de la croissance et de la morphogenèse in vitro des tissus végétaux. Le succès de la culture de tissus végétaux dépend du choix du milieu nutritif. Car les cellules de la plupart des plantes peuvent être cultivées dans un milieu de culture. Fondamentalement, les milieux de culture de tissus végétaux doivent contenir les mêmes nutriments que ceux requis par la plante entière. On peut noter que les plantes dans la nature peuvent synthétiser leur propre matière alimentaire. Cependant, les plantes qui poussent in vitro sont principalement hétérotrophes, c'est-à-dire qu'elles ne peuvent pas synthétiser leur propre nourriture.

COMPOSITION DES MÉDIAS

La composition des milieux de culture dépend principalement de deux facteurs :

1. L'espèce particulière de la plante.

2. Le type de matériel utilisé pour la culture, c'est-à-dire cellules, tissus, organes, protoplastes.

Ainsi, la composition d'un milieu est formulée en tenant compte des exigences spécifiques d'un système de culture donné. Les milieux utilisés peuvent être de nature solide (milieu solide) ou liquide (milieu liquide). Le choix du milieu solide ou liquide dépend du type de plante à cultiver.

PRINCIPAUX TYPES DE MÉDIAS

Il existe essentiellement cinq (5) types de milieux de culture de tissus végétaux. Elles sont:

1. Milieu blanc : c'est l'un des premiers milieux de culture de tissus végétaux qui a été développé pour la culture des racines.

2. Milieu MS : Murashige et Skoog (MS) ont initialement formulé un milieu pour induire l'organogenèse et la régénération des plantes dans les tissus cultivés. Aujourd'hui, le milieu MS est largement utilisé pour de nombreux types de systèmes de culture.

3. Milieu B5 : Il a été développé par Gamborg, le milieu B5 a été conçu à l'origine pour les cultures de suspensions cellulaires et de cals. Actuellement avec certaines modifications, ce milieu est utilisé pour les cultures de protoplastes.

4. Milieu N6 : Chu a formulé ce milieu et il est utilisé pour la culture d'anthères de céréales, en plus d'autres cultures de tissus.

5. Milieu Nitsch’s : Ce milieu a été développé par Nitsch et Nitsch et fréquemment utilisé pour les cultures d'anthères.

Parmi les milieux expliqués ci-dessus, le milieu MS est le plus fréquemment utilisé dans les travaux de culture de tissus végétaux en raison de son succès avec plusieurs espèces végétales et systèmes de culture. Fait intéressant, chacun des milieux énumérés ci-dessus diffère les uns des autres en termes de composition (présence ou absence de certains nutriments et également quantité de nutriments en mg/l)

Médias synthétiques et naturels

Lorsqu'un milieu est composé de composants chimiquement définis, il est appelé milieu synthétique. En revanche, si un milieu contient des composés chimiquement non définis (ex : extrait végétal, jus de fruit, extrait végétal), il est considéré comme un milieu naturel. Les milieux synthétiques ont presque remplacé les milieux naturels pour la culture tissulaire.

Expression des concentrations dans les milieux

Les concentrations de constituants inorganiques et organiques dans les milieux de culture sont généralement exprimées en valeurs massiques (mg/l ou ppm).

CONSTITUANTS DES MÉDIAS

De nombreux éléments sont nécessaires à la nutrition des plantes et à leurs fonctions physiologiques. Ainsi, ces éléments doivent être fournis dans le milieu de culture pour soutenir une croissance adéquate des cultures in vitro. Les milieux de culture contiennent généralement les constituants suivants :

2. Carbone et sources d'énergie

Les nutriments inorganiques sont constitués de macronutriments (concentration >0,5 mmol/l ) et de micronutriments (concentration <0,5 mmol/l ). Une large gamme de sels minéraux (éléments) fournit les macro et micronutriments. Les sels inorganiques dans l'eau subissent une dissociation et une ionisation. Par conséquent, un type d'ion peut être apporté par plus d'un sel. Par exemple, dans le milieu MS, les ions K sont apportés par KNO3 et KH2PO4 tandis que les ions NO2 proviennent de KNO3 et NH4 NO3.

Éléments de macronutriments : Les six éléments, à savoir l'azote, le phosphore, le potassium, le calcium, le magnésium et le soufre, sont les macronutriments essentiels pour la culture tissulaire. La concentration idéale d'azote et de potassium est d'environ 25 mmol I tandis que pour le calcium, le phosphore, le soufre et le magnésium, elle se situe entre 1 et 3 mmol I . Pour l'apport d'azote dans le milieu, les nitrates et les sels d'ammonium sont utilisés ensemble.

Micronutriments : Bien que leurs besoins soient en quantités infimes, les micronutriments sont essentiels pour les cellules et les tissus végétaux. Ceux-ci comprennent le fer, le manganèse, le zinc, le bore, le cuivre et le molybdène. Parmi les microéléments, le besoin en fer est très critique. Les formes chélatées de fer et de cuivre sont couramment utilisées dans les milieux de culture.

2. CARBONE ET SOURCES D'ÉNERGIE

Les cellules végétales et les tissus dans le milieu de culture sont hétérotrophes et, par conséquent, dépendent du carbone externe pour l'énergie. Parmi les sources d'énergie, le saccharose est le plus préféré. Au cours de la stérilisation (par autoclavage) du milieu, le saccharose s'hydrolyse en glucose et fructose. Les cellules végétales en culture utilisent d'abord le glucose puis le fructose. En effet, le glucose ou le fructose peuvent être directement utilisés dans les milieux de culture. On peut noter que pour l'approvisionnement énergétique, le glucose est aussi efficace que le saccharose tandis que le fructose est moins efficace.

C'est une observation commune que les cultures se développent mieux sur un milieu avec du saccharose autoclavé que sur un milieu avec du saccharose stérilisé par filtre. Ceci indique clairement que les produits hydrolysés du saccharose (en particulier le glucose) sont des sources d'énergie efficaces. L'utilisation directe de fructose dans le milieu soumis à l'autoclavage, s'avère préjudiciable à la croissance des cellules végétales. Outre le saccharose et le glucose, d'autres glucides tels que le lactose, le maltose, le galactose, le raffinose, le tréhalose et le cellobiose ont été utilisés dans les milieux de culture mais avec un succès très limité.

Les suppléments organiques comprennent des vitamines, des acides aminés, des acides organiques, des extraits organiques, du charbon actif et des antibiotiques.

je. Vitamines : Les cellules et tissus végétaux en culture (comme les plantes naturelles) sont capables de synthétiser des vitamines mais en quantités sous-optimales, insuffisantes pour soutenir la croissance. Par conséquent, le milieu doit être complété par des vitamines pour obtenir une bonne croissance des cellules. Les vitamines ajoutées aux milieux comprennent la thiamine, la riboflavine, la niacine, la pyridoxine, l'acide folique, l'acide pantothénique, la biotine, l'acide ascorbique, le myo&#inositol, l'acide para-aminobenzoïque et la vitamine E.

ii. Acides aminés : Bien que les cellules végétales cultivées puissent synthétiser des acides aminés dans une certaine mesure, les milieux complétés par des acides aminés stimulent la croissance cellulaire et aident à l'établissement de lignées cellulaires. De plus, l'azote organique (sous forme d'acides aminés tels que la L-glutamine, la L-asparagine, la L-arginine, la L-cystéine) est plus facilement absorbé que l'azote inorganique par les cellules végétales.

iii. Acides organiques : L'ajout d'intermédiaires du cycle de Krebs tels que le citrate, le malate, le succinate ou le fumarate permettent la croissance des cellules végétales. Le pyruvate améliore également la croissance des cellules en culture.

iv. Extraits organiques : Il est d'usage de compléter les milieux de culture avec des extraits organiques tels que la levure, l'hydrolysat de caséine, le lait de coco, le jus d'orange, le jus de tomate et l'extrait de pomme de terre. Il est cependant préférable d'éviter l'utilisation d'extraits naturels en raison des fortes variations qualitatives et quantitatives des facteurs de croissance qu'ils contiennent. Ces dernières années, les extraits naturels ont été remplacés par des composés organiques spécifiques, par exemple le remplacement de l'extrait de levure par la L-asparagine, le remplacement des extraits de fruits par la L-glutamine.

v. Charbon actif : La supplémentation du milieu en charbon actif stimule la croissance et la différenciation de certaines cellules végétales (carotte, tomate, orchidée). Certains composés toxiques/inhibiteurs (par exemple les phénols) produits par les plantes cultivées sont éliminés (par adsorption) par le charbon activé, ce qui facilite une croissance cellulaire efficace dans les cultures. L'ajout de charbon actif à certaines cultures (tabac, soja) s'avère inhibiteur, probablement en raison de l'adsorption de stimulants de croissance tels que les phytohormones.

vi. Antibiotiques : Il est parfois nécessaire d'ajouter des antibiotiques au milieu pour empêcher la croissance de micro-organismes. A cet effet, de faibles concentrations de streptomycine ou de kanamycine sont utilisées. Dans la mesure du possible, l'ajout d'antibiotiques au milieu est évité car ils ont une influence inhibitrice sur la croissance cellulaire.

Les hormones végétales ou phytohormones sont un groupe de composés organiques naturels qui favorisent la croissance, le développement et la différenciation des plantes. Quatre grandes classes de régulateurs de croissance ou d'hormones sont utilisées pour la culture de cellules végétales : les auxines, les cytokinines, les gibbérellines et l'acide abscissique. Ils favorisent la croissance, la différenciation et l'organogenèse des tissus végétaux dans les cultures.

je. Auxines: Les auxines induisent la division cellulaire, l'allongement cellulaire et la formation de cals dans les cultures. À faible concentration, les auxines favorisent la formation de racines tandis qu'à forte concentration, la formation de cals se produit. Des exemples d'auxines couramment utilisées sont : l'acide indole 3-acétique (IAA), l'acide indole 3-butyrique (IBA), l'acide 1-naphtylène acétique (NAA), l'acide 2, 4-dichlorophénoxy acétique (2,4-D) etc. Parmi les auxines, l'acide 2, 4-dichlorophénoxy acétique est le plus efficace et est largement utilisé dans les milieux de culture.

ii. Cytokinines : Chimiquement, les cytokinines sont des dérivés d'une purine, à savoir l'adénine. Ces dérivés d'adénine sont impliqués dans la division cellulaire, la différenciation des pousses et la formation d'embryons somatiques. Les cytokinines favorisent la synthèse d'ARN et stimulent ainsi les activités protéiques et enzymatiques dans les tissus. Des exemples de cytokinines couramment utilisées sont la 6-benzylaminopurine (BAP), la benzyladénine (BA), la kinétine, la zéatine, etc. Parmi les cytokinines, la kinétine et la benzylaminopurine sont fréquemment utilisées dans les milieux de culture.

Rapport des auxines et des cytokinines : Les concentrations relatives des facteurs de croissance à savoir les auxines et les cytokinines sont cruciales pour la morphogenèse des systèmes de culture. Lorsque le rapport des auxines aux cytokinines est élevé, l'embryogenèse, l'initiation du cal et l'initiation des racines se produisent. En revanche, pour la prolifération axillaire et des pousses, le rapport des auxines aux cytokinines est faible. À toutes fins pratiques, on considère que la formation et le maintien des cultures de cals nécessitent à la fois de l'auxine et de la cytokinine, tandis que l'auxine est nécessaire pour la culture des racines et la cytokinine pour la culture des pousses. Les concentrations réelles des régulateurs de croissance dans les milieux de culture sont variables selon le type d'explant de tissu et l'espèce végétale.

iii. Gibbérellines : Environ 20 gibbérellines différentes ont été identifiées comme régulateurs de croissance. Parmi celles-ci, la gibbérelline A (GA3 ) est la plus couramment utilisée pour la culture tissulaire. GA favorise la croissance des cellules cultivées, améliore la croissance des cals et induit l'allongement des plantules naines. Les gibbérellines sont capables de favoriser ou d'inhiber les cultures tissulaires, selon les espèces végétales. Ils inhibent généralement la formation de racines adventives et de pousses.

iv. Acide abscissique (ABA) : La croissance des cals des cultures peut être stimulée ou inhibée par l'ABA. Cela dépend en grande partie de la nature de l'espèce végétale. L'acide abscissique est un important régulateur de croissance pour l'induction de l'embryogenèse.

Pour la préparation de milieux de culture tissulaire semi-solides ou solides, des agents solidifiants ou gélifiants sont nécessaires. En fait, les agents solidifiants étendent le support aux tissus en croissance dans les conditions statiques.

Agar : L'agar, un polysaccharide obtenu à partir d'algues, est le plus couramment utilisé comme agent gélifiant pour les raisons suivantes.

1. Il ne réagit pas avec les constituants des médias.

2. Il n'est pas digéré par les enzymes végétales et est stable à température de culture.

La gélose à une concentration de 0,5 à 1 % dans le milieu peut former un gel.

Gelatin: It is used at a high concentration (10%) with a limited success. This is mainly because gelatin melts at low temperature (25°C), and consequently the gelling property is lost.

Other gelling agents: Bio-gel (polyacrylamide pellets), phytagel, gelrite and purified agarose are other solidifying agents, although less frequently used. It is in fact advantageous to use synthetic gelling compounds, since they can form gels at a relatively low concentration (1.0 to 2.5 g l ).

The optimal pH for most tissue cultures is in the range of 5.0-6.0. The pH generally falls by 0.3-0.5 units after autoclaving. Before sterilization, pH can be adjusted to the required optimal level while preparing the medium. It is usually not necessary to use buffers for the pH maintenance of culture media.

At a pH higher than 7.0 and lower than 4.5, the plant cells stop growing in cultures. If the pH falls during the plant tissue culture, then fresh medium should be prepared. In general, pH above 6.0 gives the medium hard appearance, while pH below 5.0 does not allow gelling of the medium.

PREPARATION OF MEDIA

The general methodology for a medium preparation involves preparation of stock solutions (in the range of 10x to 10Ox concentrations) using high purity chemicals and demineralized water. The stock solutions can be stored (in glass or plastic containers) frozen and used as and when required. Most of the growth regulators are not soluble in water. They have to be dissolved in NaOH or alcohol.

Dry powders in Media Preparation: The conventional procedure for media preparation is tedious and time consuming. Now a days, plant tissue culture media are commercially prepared, and are available in the market as dry powders. The requisite medium can be prepared by dissolving the powder in a glass distilled or demineralized water. Sugar, organic supplements and agar (melted) are added, pH adjusted and the medium diluted to a final volume (usually 1 litre).

Sterilization of Media: The culture medium is usually sterilized in an autoclave at 121°C and 15 psi for 20 minutes. Hormones and other heat sensitive organic compounds are filter-sterilized, and added to the autoclaved medium.

SELECTION OF A SUITABLE MEDIUM

In order to select a suitable medium for a particular plant culture system, it is customary to start with a known medium (e.g. MS medium, B5 medium) and then develop a new medium with the desired characteristics. Among the constituents of a medium, growth regulators (auxins, cytokinins) are highly variable depending on the culture system.

In practice, 3-5 different concentrations of growth regulators in different combinations are used and the best among them are selected. For the selection of appropriate concentrations of minerals and organic constituents in the medium, similar approach referred above, can be employed.

Medium-utmost Important for Culture: For tissue culture techniques, it is absolutely essential that the medium preparation and composition are carefully followed. Any mistake in the preparation of the medium is likely to do a great harm to the culture system as a whole.

À propos de l'auteur / Informations supplémentaires :
I am a First Class graduate of Plant Science and Biotechnology from University of port Harcourt.

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Research Benefits from an Online Presence

In the age of the internet, social media tools offer a powerful way for scientists to boost their professional profile and act as a public voice for science. Although the type of online conversations and shared content can vary widely, scientists are increasingly using social media as a way to share journal articles, advertise their thoughts and scientific opinions, post updates from conferences and meetings, and circulate information about professional opportunities and upcoming events. Google searches now represent the standard approach for discovering information about a topic or person—whether it be search committees collecting information about faculty candidates, graduate students searching out prospective labs, or journalists on the hunt for an expert source. Consequently, in today's technology-driven world, lack of an online presence can severely limit a researcher's visibility, and runs the risk that undesirable search results appear before desirable ones (however, this scenario is easily rectified see Box 2). A growing body of evidence suggests that public visibility and constructive conversation on social media networks can be beneficial for scientists, impacting research in a number of key ways.

Box 2. Advice for New Users

In academia, there is often a particular stigma attached to online activities. Actively maintaining an online profile and participating in social media discussions can be seen as a waste of time and a distraction from research and teaching duties. We believe this perception is misguided and based on incorrect interpretations of what scientists are actually doing online. When used in a targeted and streamlined manner, social media tools can complement and enhance a researcher's career. When exploring online tools for the first time, new users can maximize their reach by considering the following points:


Travaux pratiques pour l'apprentissage

La capacité de fabriquer différents milieux de culture pour cultiver différents micro-organismes est un élément essentiel de toute enquête microbiologique.

La gélose fournit une matrice de gelée de soutien pour les nutriments dissous. Différents nutriments sont appropriés pour la culture de différents micro-organismes.

Appareils et produits chimiques

Ajoutez différents nutriments à la gélose de base en fonction des organismes que vous envisagez de cultiver.

Santé et sécurité et notes techniques

Reportez-vous à la carte de recette CLEAPSS 1 pour plus de détails sur la manipulation de la gélose. Le danger identifié est lié à l'inhalation de la poudre lors de la préparation de la gelée d'agar – la mesure de contrôle consiste à peser la poudre dans une hotte. Le risque de brûlures lors de la manipulation de liquide chaud est réduit en portant des gants de cuisine.

1 gélose basique Mélanger 1,5 g d'agar avec 10 cm 3 d'eau en une pâte. Ajouter lentement de l'eau en remuant jusqu'à ce que le volume soit de 100 cm 3 . Chauffer le mélange au bain-marie bouillant à 95 °C dans le récipient requis. Ce chauffage préliminaire peut être omis si la gélose est ensuite stérilisée, à moins qu'il ne soit nécessaire de décanter la gélose dans des récipients plus petits avant l'autoclavage.

2 Gélose nutritive pour bactéries Mélanger 2 g de Bovril, 0,5 g de chlorure de sodium et 1,5 g d'agar avec 10 cm 3 d'eau en une pâte. Ajouter petit à petit de l'eau en remuant jusqu'à ce que le volume soit de 100 cm 3 . Chauffer au bain-marie bouillant à 95 °C dans le récipient requis.

3 Gélose au malt pour champignons Mélanger 2 g d'extrait de malt avec 2 g d'agar avec 10 cm 3 d'eau en une pâte. Ajouter lentement de l'eau en remuant jusqu'à ce que le volume soit de 100 cm 3 . Chauffer au bain-marie bouillant à 95 °C dans le récipient requis.

4 Gélose à l'amidon Faire une pâte contenant 1 g d'amidon soluble dans 10 cm 3 d'eau chaude. Ajouter 1,5 g d'agar, bien mélanger et ajouter lentement de l'eau en remuant jusqu'à ce que le volume soit de 100 cm 3 . Chauffer au bain-marie bouillant à 95 °C dans le récipient requis.

5 Gélose au malt d'amidon pour la croissance des champignons et la digestion de l'amidon Mélangez 3 g de poudre de malt léger (cristal ou spraymalt) (en provenance des brasseries artisanales) et 0,5 g de peptone (pour favoriser la croissance) dans 20 ml d'eau. Réalisez également une pâte contenant 1 g d'amidon soluble dans 10 cm 3 d'eau chaude. Ajouter ces deux solutions à 1,5 g d'agar en agitant, et ajouter lentement de l'eau en agitant jusqu'à ce que le volume soit de 100 cm 3 . Remuer avant de décanter dans des récipients plus petits (si nécessaire) et de stériliser.

6 Gélose à l'extrait de levure mannitol (MYEA) Pour 1 litre de gélose à l'extrait de levure mannitol (MYEA) suspendre 10 g de gélose dans 1 litre d'eau. Chauffer pour dissoudre. Ajouter 0,5 g de K2HPO4 (Hazcard 95C), 0,2 g de MgSO4.7 heures2O (Hazcard 59B), 0,2 g de NaCl (Hazcard 47B), 0,2 g de CaCl2.6H2O (Hazcard 19A), 10 g de mannitol et 0,4 g d'extrait de levure. K2HPO4, MgSO4.7 heures2O et NaCl sont décrits comme étant à faible risque. CaCl2.6H2O est un irritant sous forme de poudre, mais pas dans le milieu final.

7 Gélose aux sels minéraux sans azote Pour 500 cm 3 , dissoudre d'abord 0,05 g de FeCl3.6H2O dans 500 cm 3 d'eau distillée. Ajouter 2 g K2HPO4, 0,25 g de MgSO4.7H2O et 10 g de glucose. Dissoudre et vérifier le pH, en ajustant à 8,3 si nécessaire avec 0,1 M de NaOH (voir CLEAPSS Hazcard 91 : Irritant à cette concentration). Verser dans un flacon contenant 1 g de CaCO3 et 7,5 g de gélose. Autoclave à 121°C. Mélanger pour disperser le CaCO3 avant de verser. Vous pouvez acheter de la gélose aux sels minéraux sans azote prête à l'emploi. K2HPO4 (Hazcard 95C), MgSO4.7H2O (Hazcard 59B), glucose (Hazcard 40C) et CaCO3 (Hazcard 19B) sont tous répertoriés comme étant à faible risque. FeCl3.6H2O est nocif sous forme solide, mais pas à la faible concentration de la gélose finale.

Procédure

La section 15.2.7 du Manuel de laboratoire CLEAPSS contient plus d'informations sur la gestion de la gélose et la préparation des plaques. Ou vous pouvez acheter des supports préparés en bouteilles ou en assiettes (voir Fournisseurs ci-dessous).

une Calculez la quantité nécessaire et préparez juste assez de gélose pour l'enquête - environ 15 cm 3 pour une profondeur normale dans une boîte de Pétri de 90 mm. Tout surplus se conservera pendant 6 à 12 mois dans des flacons à bouchon à vis hermétiquement fermés s'ils sont stériles.

b Peser la poudre de milieu gélosé contenant le gel et les nutriments choisis, ajouter de l'eau et stériliser le mélange pendant le temps, et à la température, spécifié par le fabricant.

c Chauffer la gélose et l'eau à 95 °C pour dissoudre la gélose. Utilisez toujours un bain-marie pour faire bouillir la gélose et n'ajoutez jamais de gélose à l'eau bouillante.

Flacons à bouchon avec un bouchon bien ajusté en coton non absorbant. Couvrir de papier sulfurisé ou de papier aluminium avant de stériliser par autoclavage.

e Après autoclavage, transférer dans un bain-marie pour équilibrer à 50 ° C. Empilez les assiettes après le versement pour minimiser la condensation, sauf dans les assiettes supérieures.

f Réchauffez les boîtes de Pétri avant de verser pour minimiser la condensation.

g Conservez les plaques versées dans un sac en plastique scellé jusqu'à ce que vous en ayez besoin pour réduire la déshydratation du support.

h Divisez la gélose dans des bouteilles McCartney stériles individuelles si vous voulez que les élèves versent leurs propres plaques (voir Verser une plaque de gélose).

Liens web

Ressources pour les enseignants de microbiologie
Society for General Microbiology - source of Basic Practical Microbiology, un excellent manuel de techniques de laboratoire et de microbiologie pratique pour les écoles secondaires, une sélection de pratiques éprouvées utilisant des micro-organismes.

Microbiologie en ligne
MiSAC (Microbiology in Schools Advisory Committee) est soutenu par la Society for General Microbiology (voir ci-dessus) et leurs sites Web incluent plus d'informations sur la sécurité et un lien pour demander des conseils par e-mail.

(Sites Web consultés en octobre 2011)

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How to Make a Cell Lysis Solution

The precise components and procedure required for making a cell lysis solution depends on several factors, including the type of cells and the objective of the experiment. This BiologyWise article explains how to make cell lysis solution with respect to the major ingredients, and how they vary with different experimental setups.

The precise components and procedure required for making a cell lysis solution depends on several factors, including the type of cells and the objective of the experiment. This BiologyWise article explains how to make cell lysis solution with respect to the major ingredients, and how they vary with different experimental setups.

Sodium dodecyl sulfate (SDS), the most commonly used detergent for cell lysis and protein denaturation, is also widely used in several soaps, shampoos, laundry detergents, and toothpastes.

Aimeriez-vous écrire pour nous? Eh bien, nous recherchons de bons écrivains qui veulent faire passer le mot. Contactez-nous et nous discuterons.

A cell lysis solution is a detergent-based buffer solution used to break open the desired cells and further isolate a particular cellular component of interest. It is also referred to as a cell lysis buffer or simply, lysis buffer. This process of lysing cells using chemical agents is termed as chemical disruption.

Apart from detergent and buffering agents, additional agents are added that aid the lysing process, eliminate unwanted cellular components, and/or protect the desired cellular component. These additions depend on the cell type involved, the cellular component to be studied, and the precise techniques that need to be performed on the lysate.

Given below is the basic procedure to prepare a cell lysis solution, followed by a description of the components required to prepare the solutions, and their variations with respect to the commonly followed protocols for different experiments.

Procedure to Make a Cell Lysis Solution

Given below is the procedure to prepare a lysis solution containing 10mM Tris-HCl buffer, 1mM EDTA as the chelating agent, and 0.5% SDS as the detergent.

Dissolve 121 g Tris-HCL (molecular weight = 157.60 g) in 800 ml distilled water, adjust the pH to 8 using HCl solution, and make up the volume to 1 L using distilled water.

Step 2: Preparation of 500 ml of 0.5 M EDTA stock solution

Dissolve 93.0 g of EDTA [EDTA.Na2.2H2O] (molecular weight = 372.24 g)] in 400 ml of distilled water, add 10 g (approx.) NaOH pellet to adjust pH to 8, and make up the volume to 500 ml using distilled water.

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Step 3: Preparation of 10% SDS stock solution

Dissolve 10 g of SDS in 90 ml distilled water, and make up the volume to 100 ml using distilled water.

Step 4: Preparation of 500 ml of the Tris-EDTA SDS lysis buffer

Choosing the Reagents for a Cell Lysis Buffer

All cell lysis solutions are prepared using a suitable buffer solution, so as to maintain the appropriate pH. Disruption of the cells will disturb the internal pH of the cell, which alters the structural integrity of proteins and other macromolecules. In order to avoid this, generally a buffer solution adjusted at a pH equal to the normal intracellular pH is used.

A buffer solution comprises a weak base and its conjugate acid, or a weak acid and its conjugate base. Each buffering agent can work as an effective buffer only within a specific pH range called the buffer range. The choice of buffering agent depends on this buffer range. Generally, the buffers are used at a concentration of 10 – 50 mM and are adjusted to pH 7.4 – 8.

The two commonly used buffers for making cell lysis solutions, and their buffer range are as follows:

Cell membranes are made up of phospholipid layers which are held together through polar interactions. A detergent serves as an emulsifier and disrupts these polar interactions. It also forms complexes with the lipid molecules and protein molecules embedded in the membrane, and precipitates them out of the solution.

Detergents can be grouped as ionic or non-ionic, depending on the nature of the hydrophilic group, or as mild or strong depending on their ability to solubilize membranes and proteins. Ionic detergents with positively charged groups are termed cationic detergents, and those with negatively charged groups are termed anionic detergents.

Mild detergents are used when cells need to be lysed for purifying and/or studying cellular proteins, so as to avoid denaturation of the desired proteins. On the other hand, strong detergents that denature cellular proteins are used while lysing cells for DNA isolation.

Given below are some of the commonly used detergents, their application as cell lysing agents, and usual concentrations in which they are used for cell lysis.

1) SDS (sodium dodecyl sulfate) [anionic]

General use: DNA isolation from any cell type, protein isolation under denaturing conditions
Concentration: 1 – 10 %

2) Sodium Deoxycholate [anionic]

General use: Purification of membrane proteins
Concentration: 0.5 %

3) CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) [cationic]

1) NP-40 (nonyl phenoxypolyethoxylethanol)

General use: Nuclei isolation
Concentration: 0.1 – 1.0 %

2) Triton X-100

General use: Purification of membrane proteins, DNA isolation
Concentration: 0.1 – 5.0 %

3) Polysorbate 20

General use: Purification of membrane proteins, immunoprecipitation
Concentration: 0.05 – 0.5 %

Role: The chelating agent is a chemical that sequesters divalent cations, like Mg ++ , and Ca ++ , which are required for membrane stability. Due to such chelation, these cations are no longer associated with the membrane, thereby, weakening it. Moreover, the lysing of membrane results in exposing the nucleic acids to nucleases, which are otherwise sequestered inside the lysosomes. These nucleases are inactive in the absence of divalent ions. Thus, chelating agents protect the DNA and RNA molecules from degradation by these nucleases.

Osmotic Stabilizers: Glucose, sucrose, sorbitol, and glycerol may be added for osmotic stability, and preventing the cellular components from osmotic shock that may occur during the sudden rupturing of cell membrane. In addition, they also help stabilize lysosomal membranes, thereby, reducing the release of degradative enzymes from the lysosomal lumen.

Salts: Disruption of cells and the release of cellular components into the medium, may alter the ionic strength of the medium. In order to deal with this and maintain ionic strength, salts, like sodium chloride [NaCl], potassium chloride [KCl], and ammonium sulfate [(NH4)2DONC4] may be added.

Enzymes: Depending on the target macromolecules to be isolated from cells, lytic enzymes may be added to either protect them from the action of other enzymes, or degrade the remaining macromolecules that may contaminate the lysate.

Cell lysis solutions are used for the chemical disruption of cells, and may also be used in a combination with other methods, like homogenization, sonication, grinding, freeze-thaw techniques, etc. This is especially useful for lysis of fungal cells and plant cells, since they have strong cell walls around the cell membranes.

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How do you guys prepare 10% FBS Medium? - (Nov/27/2008 )

The people in my lab just add 50ml of FBS and 5 ml Pen Strep in 500ml DMEM. They say that the difference in cell growth is minimal. But i was taught to keep using the same lot of FBS throughout my whole experiment. But if the effect of different concentration of FBS on cell growth is minimal, what is the point of keep using the same lot of serum?

The people in my lab just add 50ml of FBS and 5 ml Pen Strep in 500ml DMEM. They say that the difference in cell growth is minimal. But i was taught to keep using the same lot of FBS throughout my whole experiment. But if the effect of different concentration of FBS on cell growth is minimal, what is the point of keep using the same lot of serum?

If a bottle of DMEM/RPMI is 500ml and you need to make up a 10% FBS/FCS solution . then you need to add 55mls of FBS/FCS to the 500ml of media. If you do not then you are adding a 10% error into your experiment straight away.

You need to batch test serum. this is extremely important as there is MASSIVE batch variation . and MASSIVE differences in FBS/FCS origins.

NZ>Austalian>North American>European>South American>British

If you look at Vaibility and growth then there will be no differences between the above. HOWEVER these are insensitive methods for looking at the "health of the cells". If you look at other cell markers, then you will see massive variations:

Oxygen Consumption
Enzyme Induction
Receptor Expression
Cytochrome C contant
Electron transport chain complexes

Rhombus, that is a damn fine answer, especially as I am a Kiwi!

I am glad you like the answer. NZ serum has always been the best in the world. I do not know why. However experimentally it is vital for us to have good cells. For an example, we have HEK cells Sodium channel expression. with NZ serum as the only varaible, we find 60% greater expression in cells grown in NZ serum compared to other sources of serum. IMPORTANT when you are doing patch clamp work


Voir la vidéo: Préparation des milieux de culture (Juillet 2022).


Commentaires:

  1. Kajimuro

    "Ma hutte est en bordure, mon bureau est au centre !" C'était une nuit tranquille de la Saint-Barthélemy. L'élève ne sait pas dans deux cas : soit il ne l'a pas encore réussi, soit il l'a déjà réussi.

  2. Redamann

    Je suis d'accord, c'est un message drôle.



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