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A5. Modification oxydative des lipides - Biologie

A5. Modification oxydative des lipides - Biologie


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Figure : Modification oxydative des lipides

Les stades initiaux des maladies cardiovasculaires semblent impliquer le développement de stries d'acides gras sous les parois des artères. Les macrophages, une cellule immunitaire, possèdent des récepteurs qui semblent reconnaître les lipoprotéines oxydées dans le sang, qu'ils captent. Les cellules deviennent alors des cellules spumeuses contenant de la graisse qui forment les stries. L'oxydation des acides gras dans les lipoprotéines (éventuellement par l'ozone) pourrait produire des peroxydes lipidiques et l'oxydation des protéines dans les lipoprotéines. Les neurones corticaux de patients atteints du syndrome de Down fœtal présentent des niveaux 3 à 4 fois plus élevés d'espèces O2 réactives intracellulaires et des niveaux accrus de peroxydation lipidique par rapport aux neurones témoins. Ces dommages sont prévenus par le traitement des neurones en culture avec des capteurs de radicaux libres ou de la catalase.

Figure : absorption des LDL oxydés

Une étude récente des peroxiredoxines par Neumann et al a montré l'importance de ces produits géniques chez la souris. Les peroxyrédoxines (qui catalysent la conversion des peroxydes et de la thiorédoxine en eau et en thiorédoxine oxydée) sont de petites protéines avec un site actif de cystéine et se trouvent dans la plupart des organismes. La transcription du gène de la peroxiredoxine 1 de mammifère est activée par le stress oxydatif. Ils ont inactivé le gène qui a produit une souris qui pouvait se reproduire et semblait vitale, mais qui avait une durée de vie raccourcie. Ces souris ont développé une anémie hémolytique sévère et plusieurs types de cancers. Des niveaux élevés d'espèces réactives de l'oxygène et des niveaux accrus de protéines oxydées qui en résultent ont été trouvés dans les globules rouges des souris knock-out atteintes d'anémie. Des niveaux élevés de 8-oxoguanine, résultant de dommages oxydatifs à l'ADN, ont été trouvés dans les cellules tumorales.


OP44 - Biologie des systèmes du stress oxydatif : premiers aperçus des interactions entre l'oxydation des lipides et la modification des protéines

Des recherches récentes indiquent que le stress oxydatif (OS) affecte tous les niveaux d'organisation cellulaire et induit des perturbations dans l'expression des gènes, la régulation épigénétique, les niveaux d'ARNm et de protéines et le métabolisme cellulaire. Les modifications oxydatives des protéines et des lipides représentent un autre niveau de complexité dans la régulation cellulaire soutenu par de nombreuses études démontrant comment ces modifications régulent l'expression des gènes et les voies de signalisation cellulaire. Cependant, il est presque impossible de spécifier l'entrée et les conséquences (patho)physiologiques de l'OS en utilisant les données d'un seul niveau de modification. De nos jours, il est clair que seule une approche holistique, telle que suggérée par la biologie des systèmes, fournira une vue intégrée sur la régulation cellulaire et les pathologies liées à l'OS en considérant tous les déterminants connus de l'OS, en en identifiant de nouveaux et en établissant des liens fonctionnels entre eux.

Dans un premier effort pour étudier l'OS via la biologie des systèmes redox, nous avons appliqué une approche multi-omique pour caractériser l'impact de l'OS sur les cardiomyocytes (CM) en utilisant un modèle dynamique de stress nitrosatif. Les lipides carbonylés réactifs, les phospholipides hydroxylés et tronqués, les acides gras nitrés et les oxystérols ont été quantifiés par rapport à un témoin dans des extraits lipidiques CM après 15, 30, 70 min et 16 h de SG. Simultanément, la fraction protéique a été analysée pour un large éventail de modifications post-traductionnelles, telles que la phosphorylation, la carbonylation, l'oxydation de la cystéine et la nitrosylation. Les données omiques ont été combinées et étayées par des études biochimiques et microscopiques sur la dynamique de l'oxydation, la distribution spatiale et les effets fonctionnels. Ainsi, la combinaison de la lipidomique, de la protéomique basée sur les données et de l'intégration de la biologie des systèmes a permis l'identification de plus de 200 protéines modifiées par des produits de peroxydation lipidique réactifs dont beaucoup étaient impliqués dans les voies de signalisation du calcium, la régulation du cytosquelette d'actine, l'adhésion focale et le phosphatidylinositol. système de signalisation. Des études biochimiques et microscopiques ont en outre confirmé l'altération dérivée de l'OS de la signalisation du Ca et de la distribution des protéines du cytosquelette.


Peroxydation lipidique

Mesure de la peroxydation lipidique

La peroxydation lipidique peut être déterminée quantitativement ou qualitativement par diverses méthodes. Elle peut être mesurée par les pertes d'acides gras, les quantités de produits de peroxydation primaires, les quantités de produits secondaires tels que les carbonyles et les gaz hydrocarbonés et la réduction de l'activité antioxydante. Certaines des méthodes couramment utilisées sont décrites ci-dessous. L'analyse des acides gras par chromatographie en phase gazeuse (GLC) ou chromatographie liquide à haute performance (HPLC) est utilisée pour mesurer la perte d'acides gras insaturés, conséquence de la peroxydation lipidique. Les hydroperoxydes lipidiques, le principal produit de la peroxydation, peuvent être mesurés directement par HPLC avec des détecteurs à chimiluminescence. Les méthodes de libération d'iode et de glutathion peroxydase sont souvent utilisées pour mesurer les peroxydes lipidiques. Les peroxydes lipidiques oxydent I − à I2 pour le titrage au thiosulfate et donc la consommation de thiosulfate indique indirectement la quantité de peroxydes lipidiques. Les peroxydes et hydroperoxydes d'hydrogène oxydent le GSH réduit en GSSG. L'ajout de glutathion réductase et de NADPH réduit le GSSG en GSH, ce qui nécessite une consommation de NADPH, qui peut être liée à la teneur en peroxyde. Les pièges à spin (phényl t-butylnitrone) sont fréquemment utilisés pour piéger les radicaux intermédiaires. Les produits de décomposition des peroxydes lipidiques, tels que les gaz d'hydrocarbures et les aldéhydes cytotoxiques, peuvent être mesurés par GLC ou HPLC. Les produits de peroxydation lipidique peuvent endommager l'ADN, et la formation de 8-oxo-2′-désoxyguanosine (8oxodG) est un marqueur des dommages oxydatifs de l'ADN. Le contenu de 8oxodG dans l'ADN peut être quantifié par HPLC avec un détecteur EC et par une méthode immunochimique (ELISA).

Les tests les plus populaires pour la mesure de la peroxydation lipidique sont le test à l'acide thiobarbiturique (TBA) et la détermination de la conjugaison diène. Dans le test TBA, les échantillons contenant des lipides sont chauffés avec du TBA et un produit LP, le malondialdéhyde (MDA) à faible pH pour permettre la formation d'un complexe de couleur rose (voir la réaction ci-dessous). La densité de la couleur est liée à l'étendue de la peroxydation lipidique. En raison de sa simplicité et de son économie, cette méthode est largement utilisée dans les in vivo et in vitro Les paramètres. Au cours du processus de peroxydation lipidique, des conjugaisons diènes (une structure à double liaison-simple liaison-double liaison) se forment (voir peroxydation catalysée par une enzyme), qui absorbent la lumière ultraviolette (UV) dans la gamme de longueurs d'onde de 230 à 235 nm. L'absorption de la lumière UV à cette longueur d'onde peut être liée au contenu des conjugués diènes dans les extraits lipidiques des tissus et, ainsi, à l'étendue de la peroxydation lipidique.

D'autres méthodes récemment développées et couramment utilisées sont le dosage du 4-hydroxynonénal et le dosage de la 8-iso-prostaglandine F2a. Les kits Elisa sont maintenant principalement utilisés pour détecter divers adduits de peroxydation lipidique. Ces kits sont facilement disponibles sur le marché, sont assez spécifiques et donnent des résultats précis. Étant donné que le MDA et l'hydroxynonénal (HNE) se sont avérés capables de se lier aux protéines et de former des adduits stables, ils sont également considérés comme des produits finaux avancés de peroxydation lipidique (ALE). L'éthanal, le propanal, l'hexanal, le glyoxal, le méthylglyoxal, le 4-hydroxy-2-hexénal, l'acroléine, le formaldéhyde et l'acétaldéhyde sont considérés comme des ALE. Ce sont des composés carbonylés réactifs (RCC) et des produits de glycoxydation du sucre (appelés produits finaux de glycation avancée) qui s'accumulent généralement avec le vieillissement et les maladies liées au stress oxydatif telles que l'athérosclérose, le diabète ou les maladies neurodégénératives. Les RCC induisent le « stress carbonyle » caractérisé par la formation d'adduits et de liaisons croisées sur les protéines, ce qui entraîne progressivement un dysfonctionnement des protéines et des dommages dans tous les tissus et des conséquences pathologiques, notamment la cytotoxicité, le dysfonctionnement cellulaire, l'inflammation et la mort cellulaire apoptotique. Une interaction supplémentaire avec les protéines par ces ALE peut provoquer des changements structurels et fonctionnels des protéines oxydées. Plus précisément, le 4-HNE peut réagir avec les résidus de lysine, d'histidine ou de cystéine dans les protéines pour former des adduits. Le dosage immunoenzymatique développé est destiné à la détection et à la quantification rapides de ces adduits. Dans ces dosages, la quantité d'adduit dans les échantillons de protéines est déterminée en comparant son absorbance avec celle d'un adduit connu - courbe standard BSA.

Le cholestérol LDL, généralement appelé mauvais cholestérol, est encore plus dangereux lorsqu'il s'oxyde. Le LDL oxydé (OxLDL) est plus réactif avec les tissus environnants et peut s'accumuler dans la paroi interne des artères. Les macrophages, le cholestérol et d'autres lipides peuvent s'accumuler sur le site (athérosclérose), formant finalement une plaque pouvant entraîner une crise cardiaque, un accident vasculaire cérébral ou la mort. L'oxydation des LDL affecte à la fois les composants lipidiques et protéiques des LDL. Les produits aldéhydes réactifs formés lors de l'oxydation des PFA, tels que le MDA et le 4-HNE, sont capables de se fixer de manière covalente aux groupes ε-amino des résidus lysine de l'ApoB-100 pour former des adduits MDA-Lys et HNE-Lys (MDA-LDL et HNE-LDL). Une glycosylation avancée telle que la formation de CML-LDL et CEL-LDL est également impliquée dans l'oxydation des LDL. Le dosage immunoenzymatique est développé pour la détection et la quantification des OxLDL humains dans des échantillons de plasma, de sérum ou d'autres fluides biologiques. Le kit, qui est facilement disponible, contient un standard LDL oxydé au cuivre.

Historiquement, la mesure de la MDA par dosage TBARS (substances réactives à l'acide thiobarbiturique) a été fréquemment utilisée pour déterminer l'étendue de la LP. Il est considéré comme non spécifique et est généralement médiocre lorsqu'il est appliqué à des échantillons biologiques. Des dosages récents sont basés sur la mesure des adduits MDA ou HNE-lysine. Ceux-ci sont susceptibles d'être plus applicables aux échantillons biologiques, car les adduits de ces aldéhydes réactifs sont relativement stables. La découverte des isoprostanes en tant que produits de peroxydation lipidique, mesurés par GCMS ou immunoessai, a ouvert une nouvelle voie pour la quantification indirecte de la peroxydation lipidique in vivo.


Corrélation entre lipoprotéine(a) et peroxydation lipidique dans le psoriasis : rôle de l'enzyme paraoxonase-1

Fond: Le psoriasis est une maladie cutanée inflammatoire chronique associée à un métabolisme anormal des lipides plasmatiques et à une fréquence élevée d'événements cardiovasculaires. Des modifications des lipides plasmatiques et une augmentation des taux de marqueurs biochimiques de la peroxydation lipidique ont été rapportées chez des sujets atteints de psoriasis, suggérant une relation entre le psoriasis, les lipoprotéines et les dommages oxydatifs.

Objectifs: Étudier plus avant la relation entre les lipoprotéines et le stress oxydatif dans le psoriasis.

Méthode: Les taux de lipides plasmatiques, de lipoprotéine(a) [Lp(a)] et de marqueurs de la peroxydation lipidique ont été évalués chez des sujets atteints de psoriasis (n=23) et chez des témoins (n=25). Chez les mêmes sujets, l'activité de la paraoxonase-1 (PON1), un antioxydant et une enzyme anti-inflammatoire associée aux lipoprotéines de haute densité, a été étudiée.

Résultats: Les résultats ont montré des niveaux plus élevés de Lp(a) dans le sérum des patients atteints de psoriasis par rapport aux témoins (P<0·001). Des taux plus élevés d'hydroperoxydes lipidiques (P<0,001) et une activité PON1 plus faible ont été observés dans le sérum des patients par rapport aux sujets sains, confirmant que le psoriasis est associé au stress oxydatif. Le déséquilibre entre le stress oxydatif et les enzymes antioxydantes, et l'augmentation des taux sériques de Lp(a) étaient liés à l'étendue et à la gravité du psoriasis. Enfin, nos résultats ont démontré que les niveaux de Lp(a) étaient positivement corrélés avec les marqueurs de la peroxydation lipidique et négativement liés à l'activité PON1, suggérant que les sujets ayant des niveaux plus élevés de Lp(a) sont plus exposés aux dommages oxydatifs.

Conclusion : Nos résultats fournissent une preuve supplémentaire que le stress oxydatif et l'altération du système antioxydant dans le plasma des patients peuvent jouer un rôle dans la pathogenèse et la progression du psoriasis et des complications associées.


Modification oxydative in vivo des protéines membranaires des érythrocytes dans la carence en cuivre

Le stress oxydatif a été postulé pour contribuer à la pathologie associée à une carence en cuivre alimentaire. In vivo, les érythrocytes sont des cibles probables de dommages oxydatifs car ils sont exposés à de fortes concentrations d'oxygène et contiennent du fer hémique qui peut s'auto-oxyder, ce qui entraîne la formation d'anions superoxydes. L'activité de l'enzyme antioxydante importante, le cuivre, la superoxyde dismutase de zinc, diminue considérablement dans les érythrocytes lors d'une carence en cuivre. L'effet d'une carence alimentaire en cuivre sur les indicateurs de stress oxydatif a été examiné dans les membranes érythrocytaires de rats soumis à un régime alimentaire pauvre en cuivre purifié pendant 35 jours après le sevrage. Les érythrocytes ont été séparés en populations jeunes et âgées sur un gradient de Percoll avant l'isolement membranaire et la quantification des peroxydes lipidiques et des carbonyles protéiques. Les carbonyles protéiques, déterminés par immunodosage Western blot, ont été détectés principalement dans les chaînes alpha et bêta de la spectrine. Les sous-unités alpha et bêta de la spectrine dans les membranes érythrocytaires de rats déficients en cuivre contenaient des quantités plus élevées de carbonyles que les témoins, quelle que soit la population d'érythrocytes étudiée. Cette étude suggère que la spectrine peut être une cible spécifique pour les dommages oxydatifs lorsque l'activité du cuivre érythrocytaire et de la superoxyde dismutase de zinc est réduite par une carence en cuivre.


Modifications et oxydation des lipides et des protéines dans le sérum humain détectées par thermochimiluminescence

La détection d'espèces excitées électroniquement (EES) dans les fluides corporels peut constituer un outil de diagnostic important dans diverses pathologies. Des exemples de tels produits sont les carbonyles excités par triplet (TEC), qui peuvent être une source d'émission de photons dans la plage de 400 à 550 nm. Le but de la présente étude était de déterminer la contribution réelle des composants lipidiques et protéiques (protéines carbonyles) à l'émission de photons générés par thermochimiluminescence (TCL) lors du chauffage de fluides biologiques. Dans cette étude, un nouveau dispositif photomètre TCL, conçu par Lumitest Ltd, Israël, a été utilisé. Les échantillons ont été chauffés à une température constante de 80 ± 0,5°C pendant 280 s et l'émission de photons a été mesurée à plusieurs moments. Afin de comparer les résultats des mesures TCL aux méthodes conventionnelles de détection de l'oxydation des lipides et des protéines, chaque échantillon examiné a également été chauffé dans un bain-marie à 80 °C pendant 10 à 280 s. L'oxydation des lipides et des protéines a ensuite été mesurée à l'aide de méthodes conventionnelles. Le TCL de quatre acides gras polyinsaturés (PUFA) avec trois à six doubles liaisons a été mesuré. L'élévation de l'amplitude des PUFA TCL est corrélée à l'augmentation du nombre de doubles liaisons des PUFA. Une corrélation entre l'augmentation de l'intensité du TCL et la production de protéine carbonyle dans la sérumalbumine bovine (BSA) a également été observée. Dans le sérum sanguin veineux, notre étude a montré qu'une augmentation de l'intensité du TCL lors du chauffage reflétait le clivage des TEC d'origine lipidique. Notre étude suggère que les molécules biologiques telles que les protéines, les lipides et d'autres molécules, qui peuvent devenir instables lors du chauffage, sont capables de générer des SEE. Nous avons démontré qu'une courbe TCL peut être utilisée comme modèle cinétique pour mesurer les processus oxydatifs, reflétant les modifications de différentes molécules impliquées dans les phénomènes de stress oxydatif. Copyright © 2003 John Wiley & Sons, Ltd.


1. Introduction

Parmi les nombreux vaccins COVID-19 en cours de développement, les deux vaccins qui ont montré les résultats les plus prometteurs dans la prévention de l'infection COVID-19 représentent une nouvelle classe de produits vaccinaux : ils sont composés de brins d'acide ribonucléique messager (ARNm) encapsulés dans des nanoparticules lipidiques ( LNP). L'efficacité de ces vaccins à ARNm développés par BioNTech/Pfizer et Moderna est d'environ 95 % (Baden et al., 2021 Polack et al., 2020) et ils ont été les premiers vaccins à ARNm à recevoir une autorisation d'utilisation d'urgence (par la FDA ) et 𠆊pprobation conditionnelle’ par l'EMA. Ces vaccins à ARNm COVID-19 codent pour la glycoprotéine virale Spike (S) du SRAS-CoV-2 qui comprend deux substitutions de proline (mutations K986P et V987P), afin de stabiliser la conformation de préfusion de la glycoprotéine ( Wrapp et al., 2020 ) . Lors de l'administration intramusculaire (IM), le système LNP permet l'absorption par les cellules hôtes et la délivrance d'ARNm à l'intérieur du cytosol, où la traduction de la séquence d'ARNm en protéine S se produit dans les ribosomes. Après le traitement post-traduction par les cellules hôtes, la protéine S est présentée comme un antigène lié à la membrane dans sa conformation de préfusion à la surface cellulaire, fournissant la cible antigénique pour les cellules B. De plus, une partie des protéines Spike produites dans le temps entrent dans les voies de présentation de l'antigène, fournissant une reconnaissance de l'antigène par les cellules T via la présentation MHC des épitopes des cellules T (Verbeke et al., 2021). Le rapport d'évaluation de l'EMA formule le mécanisme d'action des vaccins à ARNm au site d'injection comme suit : ‘L'administration de vaccins à ARN formulés par LNP IM entraîne une inflammation locale transitoire qui entraîne le recrutement de neutrophiles et de cellules présentatrices d'antigène (CPA) sur le site de livraison. Les APC recrutées sont capables d'absorber les LNP et d'exprimer des protéines et peuvent ensuite migrer vers les ganglions lymphatiques de drainage locaux où se produit l'amorçage des cellules T (EMA, 2020a). En raison de cette activité immunitaire innée inhérente, il n'est pas nécessaire de formuler l'ARNm vaccins avec des adjuvants supplémentaires. Fait intéressant, Pfizer/BioNTech et Moderna utilisent spécifiquement l'ARNm modifié par les nucléosides qui diminue (plutôt qu'augmente) l'immunogénicité inhérente de l'ARNm, soulignant la nécessité d'équilibrer correctement l'activité immunitaire innée des vaccins à ARNm (voir ci-dessous). Les in vivo post-administration de la production d'antigène qui peut être obtenue avec les vaccins à ARNm, ainsi que les propriétés auto-adjuvantes des vaccins à ARNm-LNP, conduisent finalement à la génération efficace de réponses d'anticorps neutralisants et d'immunité cellulaire, diminuant le risque de développer COVID-19 pour le receveurs de vaccins.

Les vaccins à ARNm présentent plusieurs avantages par rapport aux autres types de vaccins. Un avantage général des vaccins à ARNm est que leur développement est relativement rapide, car les ARNm-LNP sont une véritable plate-forme technologique. Après identification du ou des antigènes protéiques protecteurs et séquençage du ou des gènes correspondants, l'ARNm peut être fabriqué en quelques semaines ( Jackson et al., 2020 ). Comme les ARNm codant pour différents antigènes sont chimiquement et physiquement très similaires, les processus de conception de formulation et de fabrication de nouveaux vaccins à ARNm suivent les mêmes étapes ( Petsch et al., 2012 ). Par rapport aux vecteurs viraux déficients en réplication, les vaccins à ARNm peuvent être plus efficaces pour la prévention du COVID-19. Contrairement aux vaccins à base de vecteurs viraux, ils ne génèrent pas d'immunité contre le porteur. À cet égard, les vaccins à ARNm sont similaires aux vaccins à base d'acide désoxyribonucléique (ADN). Les vaccins à ADN, cependant, ont encore une chance infime d'intégration potentielle du génome. De plus, contrairement aux vaccins à ARNm, les vaccins à ADN ont montré une immunogénicité plutôt faible dans les premiers essais cliniques, peut-être parce que les vaccins à base d'ADN doivent accéder au noyau pour exercer leur action, ce qui complique une administration efficace. Dans l'ensemble, une conception flexible, des processus de production standardisés et une présence cytoplasmique relativement courte rendent les vaccins à ARNm très puissants, en particulier dans une situation de pandémie avec des virus à mutation rapide.

Cependant, l'un des plus grands défis rencontrés lors du développement de vaccins à ARNm est leur faible stabilité. Actuellement, la plupart des vaccins à ARNm sont administrés par voie IM, où l'ARNm qui est absorbé par les cellules hôtes conduit à l'expression de l'antigène (Hassett et al., 2019). Les premières recherches sur les vaccins à ARNm ont démontré que l'ARNm nu est rapidement dégradé après administration (Pardi et al., 2015, Wayment-Steele et al., 2020). Par conséquent, au cours des dernières années, des efforts ont été déployés pour améliorer la in vivo stabilité de l'ARNm après administration. Cela a conduit à des moyens d'optimiser la structure de l'ARNm en ralentissant sa dégradation (voir sous la section ‘mRNA stabilité’). Une autre approche réussie et actuellement largement utilisée consiste à encapsuler et protéger l'ARNm dans les LNP (Pardi et al., 2015). Cela réduit la dégradation prématurée de l'ARNm après l'administration et améliore la livraison au cytosol des cellules présentatrices d'antigène (Liang et al., 2017, Lindsay et al., 2019).

Bien que des progrès aient été accomplis pour renforcer la stabilité in vivo et l'efficacité des vaccins ARNm-LNP, beaucoup moins d'attention a été accordée à leur stabilité pendant le stockage ( Crommelin et al., 2021 ). Afin de distribuer efficacement un vaccin dans le monde entier, il doit avoir une durée de conservation suffisamment longue, de préférence à des températures de réfrigérateur (2𠄸 ଌ) ou plus. Actuellement, pratiquement aucune donnée n'est disponible dans le domaine public sur ce qui se passe lorsque les formulations d'ARNm-LNP sont stockées pendant de longues périodes. De plus, on ne sait pas dans quelle mesure le piégeage de l'ARNm dans les LNP influence la stabilité de stockage du vaccin à ARNm. De plus, on sait très peu de choses sur la structure et la morphologie des LNP formulés avec de l'ARNm, la stabilité chimique des composants LNP et la stabilité colloïdale du système ARNm-LNP. Ce que l'on sait maintenant, c'est que pour stocker les vaccins actuels contre le COVID-19 à ARNm pendant de plus longues périodes, ils doivent être congelés. Les vaccins ARNm COVID-19 actuels de Moderna et BioNTech/Pfizer doivent être conservés entre � et � ଌ et entre � et � ଌ, respectivement ( EMA, 2020a , EMA , 2021 ). À ce jour, les processus de dégradation et les raisons pour lesquelles les exigences de température de stockage diffèrent ne sont pas entièrement compris.

L'exigence de stocker les ARNm-LNP dans un état congelé entrave la distribution des vaccins. En particulier, la très basse température de � à � ଌ est un obstacle majeur en ce qui concerne le transport, le stockage et la distribution des vaccins parmi les utilisateurs finaux du monde entier. La plupart des autres vaccins peuvent être conservés à 2𠄸 ଌ. De toute évidence, il existe un besoin et une opportunité de trouver des moyens de stabiliser les vaccins à ARNm-LNP pour permettre un stockage non congelé. Cette revue donne un aperçu des approches pour rendre les vaccins à ARNm plus stables, afin qu'ils puissent être stockés plus longtemps à des températures moins extrêmes. Pour explorer le sujet, les caractéristiques des vaccins ARNm-LNP et leur influence sur la stabilité au stockage sont discutées. Ces informations sont utilisées pour identifier les raisons de l'instabilité du vaccin à ARNm et pour explorer les options technologiques pour l'amélioration de la stabilité.


Introduction

Les espèces réactives de l'oxygène (ROS) sont des produits métaboliques obligatoires des cellules aérobies. Ils sont maintenus à de faibles niveaux par un système antioxydant qui comprend des enzymes telles que la superoxyde dismutase (SOD), la catalase (CAT), les glutathion peroxydases (GPX), les thiorédoxines (TRX) et les peroxyrédoxines (PRDX) et d'autres molécules ayant des propriétés de piégeage telles que comme le glutathion (GSH), l'ubiquinol, les vitamines C et E, etc. Cependant, lorsque le système antioxydant est dérégulé et que la production de ROS est exacerbée, alors ces molécules actives deviennent des sous-produits nocifs du métabolisme cellulaire [1].

Les spermatozoïdes de mammifères sont sensibles aux ROS, comme l'anion superoxyde (O2 •− ), le peroxyde d'hydrogène (H2O2), l'oxyde nitrique (NO • ), l'hydroxyle (HO • ) et l'anion peroxynitrite (ONOO − ). Lorsque les niveaux de ROS sont augmentés, la fonction des spermatozoïdes est affectée, entraînant l'infertilité [ 2– 6]. Cette augmentation des niveaux de ROS est appelée stress oxydatif et résulte d'une production excessive de ROS et/ou d'une diminution du système de défense antioxydant [ 7, 8]. Les dommages oxydatifs ciblent tous les composants cellulaires, réduisant la motilité des spermatozoïdes et l'activité mitochondriale [ 5, 9, 10]. La première preuve d'une relation entre les dommages oxydatifs et l'infertilité masculine a été démontrée par les travaux pionniers de Thaddeus Mann et Bayard Storey [11, 12].

La population infertile a augmenté au cours des dernières décennies [13]. Cependant, l'efficacité du traitement est faible car la cause est inconnue dans 40 à 50 % des cas [14]. Plusieurs facteurs sont liés à l'infertilité, tels que l'exposition aux polluants environnementaux, aux produits chimiques, aux médicaments, à la fumée, aux toxines, aux radiations et même aux maladies [15-18]. Une caractéristique commune de ce qui précède est la production de stress oxydatif. Dans de telles conditions, les composants cellulaires vitaux (protéines, lipides et ADN) sont oxydés, compromettant la fonction et la survie des cellules [ 8, 19]. Dans au moins 25 % des cas, des niveaux élevés de ROS sont détectés à la fois dans le sperme et les spermatozoïdes de patients infertiles [ 2– 5]. Dans certains cas d'infertilité masculine, le système antioxydant présent dans le sperme [20, 21] n'est pas suffisant pour protéger les spermatozoïdes des dommages dépendants des ROS. Les spermatozoïdes de patients infertiles présentent une peroxydation des lipides membranaires [22], une fragmentation de l'ADN et une oxydation des bases [23, 24], un faible potentiel membranaire mitochondrial [25, 26] et une inactivation des enzymes associées à la motilité [27, 28].

Modifications des protéines dans les spermatozoïdes dues aux espèces réactives de l'oxygène

Les protéines du sperme sont la cible de modifications redox-dépendantes qui conduiront, selon les niveaux de ROS, soit à l'activation/inactivation de voies de signalisation importantes pour la physiologie du sperme, soit à des dommages oxydatifs et une altération des fonctions vitales (tableaux 1 et 2). Certaines de ces modifications sont réversibles, permettant ainsi une régulation étroite des processus cellulaires impliqués dans la signalisation redox [29, 30]. Une représentation schématique des principales modifications des protéines redox est illustrée à la figure 1.

Modifications protéiques dépendantes de l'oxydoréduction. Selon le type de ROS produits, différentes modifications protéiques sont produites soit pour contrôler les processus cellulaires, soit, lorsque ces ROS sont à des niveaux élevés, pour favoriser les dommages par inactivation de la fonction des protéines (c'est-à-dire activité enzymatique, altération de la structure conformationnelle, etc.). Peroxyde d'hydrogène (H2O2) et d'autres peroxydes favorisent différentes modifications des protéines en fonction des niveaux auxquels ils sont présents dans la cellule. Un léger stress oxydatif favorisera principalement l'oxydation des thiols et la S-glutathionylation. Ces modifications dépendantes de l'oxydoréduction sont facilement inversées par les antioxydants (composés non enzymatiques). Un fort stress oxydatif conduit à la sulfonation, modification plus difficile à inverser (elle nécessite une réaction enzymatique avec consommation d'énergie). Le 4-HNE forme des adduits protéiques qui inactivent de manière irréversible des enzymes telles que la succinate déshydrogénase dans les spermatozoïdes. Superoxyde (O2 •− ) spontanément ou par activité superoxyde dismutase se dismute en H2O2 ou il pourrait être combiné avec de l'oxyde nitrique (NO • ) pour donner ONOO − . L'oxyde nitrique et ONOO − favorisent la S-nitrosylation et la nitration de la tyrosine qui pourraient participer aux processus physiologiques et pathologiques.

Modifications protéiques dépendantes de l'oxydoréduction. Selon le type de ROS produits, différentes modifications protéiques sont produites soit pour contrôler les processus cellulaires, soit, lorsque ces ROS sont à des niveaux élevés, pour favoriser les dommages par inactivation de la fonction des protéines (c'est-à-dire activité enzymatique, altération de la structure conformationnelle, etc.). Peroxyde d'hydrogène (H2O2) et d'autres peroxydes favorisent différentes modifications des protéines en fonction des niveaux auxquels ils sont présents dans la cellule. Un léger stress oxydatif favorisera principalement l'oxydation des thiols et la S-glutathionylation. Ces modifications dépendantes de l'oxydoréduction sont facilement inversées par les antioxydants (composés non enzymatiques). Un fort stress oxydatif conduit à la sulfonation, modification plus difficile à inverser (elle nécessite une réaction enzymatique avec consommation d'énergie). Le 4-HNE forme des adduits protéiques qui inactivent de manière irréversible des enzymes telles que la succinate déshydrogénase dans les spermatozoïdes. Superoxyde (O2 •− ) spontanément ou par l'activité superoxyde dismutase se dismute en H2O2 ou il pourrait être combiné avec de l'oxyde nitrique (NO • ) pour donner ONOO − . L'oxyde nitrique et ONOO − favorisent la S-nitrosylation et la nitration de la tyrosine qui pourraient participer aux processus physiologiques et pathologiques.

Modifications protéiques dépendantes de l'oxydoréduction associées aux processus physiologiques dans les spermatozoïdes.

Modification . Processus physiologiques. Espèce. Référence .
Oxydation des thiols Liaison du spermatozoïde avec l'épithélium oviductal Bovine [ 142, 143]
Motilité des spermatozoïdes Hamster, humain, rat [ 144– 147]
Capacité de sperme Humain, bovin [ 120, 123, 143, 148]
Remodelage de la chromatine du sperme Humain, souris, équin, lapin, rat [ 36, 37, 39, 149– 151]
S-nitrosylation Motilité des spermatozoïdes Humain [ 76, 152]
Nitratation de la tyrosine Capacité de sperme Humain [ 83, 153]
Modification . Processus physiologiques. Espèce. Référence .
Oxydation des thiols Liaison du spermatozoïde avec l'épithélium oviductal Bovine [ 142, 143]
Motilité des spermatozoïdes Hamster, humain, rat [ 144– 147]
Capacité de sperme Humain, bovin [ 120, 123, 143, 148]
Remodelage de la chromatine du sperme Humain, souris, équin, lapin, rat [ 36, 37, 39, 149– 151]
S-nitrosylation Motilité des spermatozoïdes Humain [ 76, 152]
Nitratation de la tyrosine Capacité de sperme Humain [ 83, 153]

Modifications protéiques dépendantes de l'oxydoréduction associées aux processus physiologiques dans les spermatozoïdes.

Modification . Processus physiologiques. Espèce. Référence .
Oxydation des thiols Liaison du spermatozoïde avec l'épithélium oviductal Bovine [ 142, 143]
Motilité des spermatozoïdes Hamster, humain, rat [ 144– 147]
Capacité de sperme Humain, bovin [ 120, 123, 143, 148]
Remodelage de la chromatine du sperme Humain, souris, équin, lapin, rat [ 36, 37, 39, 149– 151]
S-nitrosylation Motilité des spermatozoïdes Humain [ 76, 152]
Nitratation de la tyrosine Capacité de sperme Humain [ 83, 153]
Modification . Processus physiologiques. Espèce. Référence .
Oxydation des thiols Liaison du spermatozoïde avec l'épithélium oviductal Bovine [ 142, 143]
Motilité des spermatozoïdes Hamster, humain, rat [ 144– 147]
Capacité de sperme Humain, bovin [ 120, 123, 143, 148]
Remodelage de la chromatine du sperme Humain, souris, équin, lapin, rat [ 36, 37, 39, 149– 151]
S-nitrosylation Motilité des spermatozoïdes Humain [ 76, 152]
Nitratation de la tyrosine Capacité de sperme Humain [ 83, 153]

Modifications protéiques redox-dépendantes associées à des effets délétères sur les spermatozoïdes.

Modification . Résultat associé. Espèce. Référence .
Oxydation des thiols Infertilité masculine Humain [ 38, 39, 42]
Altération de la motilité des spermatozoïdes Hamster, humain, rat [ 42, 154, 155]
Blocage de la fusion spermatozoïde-ovule Souris [ 156, 157]
Adduits de protéine 4-HNE Altération de la motilité des spermatozoïdes Humain, équidé [ 62, 158, 159]
S-Glutathionylation Altération de la motilité des spermatozoïdes Humain [ 34]
Altération de la capacité des spermatozoïdes Humain [ 34]
Nitratation de la tyrosine Altération de la motilité des spermatozoïdes Humain [ 34, 80]
Altération de la capacité des spermatozoïdes Humain [ 34]
Sulfonation Altération de la motilité des spermatozoïdes Humain, rat [ 42, 60, 154]
Altération de la maturation épididymaire Rat [ 154]
Modification . Résultat associé. Espèce. Référence .
Oxydation des thiols Infertilité masculine Humain [ 38, 39, 42]
Altération de la motilité des spermatozoïdes Hamster, humain, rat [ 42, 154, 155]
Blocage de la fusion spermatozoïde-ovule Souris [ 156, 157]
Adduits de protéine 4-HNE Altération de la motilité des spermatozoïdes Humain, équidé [ 62, 158, 159]
S-Glutathionylation Altération de la motilité des spermatozoïdes Humain [ 34]
Altération de la capacité des spermatozoïdes Humain [ 34]
Nitratation de la tyrosine Altération de la motilité des spermatozoïdes Humain [ 34, 80]
Altération de la capacité des spermatozoïdes Humain [ 34]
Sulfonation Altération de la motilité des spermatozoïdes Humain, rat [ 42, 60, 154]
Altération de la maturation épididymaire Rat [ 154]

Modifications protéiques redox-dépendantes associées à des effets délétères sur les spermatozoïdes.

Modification . Résultat associé. Espèce. Référence .
Oxydation des thiols Infertilité masculine Humain [ 38, 39, 42]
Altération de la motilité des spermatozoïdes Hamster, humain, rat [ 42, 154, 155]
Blocage de la fusion spermatozoïde-ovule Souris [ 156, 157]
Adduits de protéine 4-HNE Altération de la motilité des spermatozoïdes Humain, équin [ 62, 158, 159]
S-Glutathionylation Altération de la motilité des spermatozoïdes Humain [ 34]
Altération de la capacité des spermatozoïdes Humain [ 34]
Nitratation de la tyrosine Altération de la motilité des spermatozoïdes Humain [ 34, 80]
Altération de la capacité des spermatozoïdes Humain [ 34]
Sulfonation Altération de la motilité des spermatozoïdes Humain, rat [ 42, 60, 154]
Altération de la maturation épididymaire Rat [ 154]
Modification . Résultat associé. Espèce. Référence .
Oxydation des thiols Infertilité masculine Humain [ 38, 39, 42]
Altération de la motilité des spermatozoïdes Hamster, humain, rat [ 42, 154, 155]
Blocage de la fusion spermatozoïde-ovule Souris [ 156, 157]
Adduits de protéine 4-HNE Altération de la motilité des spermatozoïdes Humain, équidé [ 62, 158, 159]
S-Glutathionylation Altération de la motilité des spermatozoïdes Humain [ 34]
Altération de la capacité des spermatozoïdes Humain [ 34]
Nitratation de la tyrosine Altération de la motilité des spermatozoïdes Humain [ 34, 80]
Altération de la capacité des spermatozoïdes Humain [ 34]
Sulfonation Altération de la motilité des spermatozoïdes Humain, rat [ 42, 60, 154]
Altération de la maturation épididymaire Rat [ 154]

Oxydation des thiols

La cystéine, un acide aminé soufré, est un puissant nucléophile dans des conditions physiologiques. Cette réactivité remarquable est due au groupe thiol (-SH). La formation de ponts disulfure (-SS-) par oxydation du thiol est une stratégie courante pour replier une protéine générant une structure assurant, par exemple, une activité enzymatique ou une interaction avec des récepteurs, des composants de la membrane plasmique, etc. Un rapport spécifique -SS-/ –SH dans une molécule de protéine est essentiel pour assurer sa fonction, et ce taux peut être affecté par les ROS. Un stress oxydatif va oxyder le -SH libre, empêchant ainsi la formation de -SS- là et quand il est nécessaire au cours d'un processus physiologique et se traduira par une altération de la fonction protéique. Un bon exemple de cette situation est les effets de niveaux élevés de ROS sur la production d'ATP par les spermatozoïdes humains. Il a été observé que des niveaux élevés de ROS, générés par l'ajout direct de H2O2 soit en ajoutant un système xanthine-xanthine oxydase (générateur d'O2 •− et de H2O2) au milieu d'incubation, réduisent la motilité des spermatozoïdes humains de manière dose-dépendante et temporelle [ 31]. Cette réduction était corrélée à une diminution de la production d'ATP par le spermatozoïde [32], suggérant ainsi que l'altération de la motilité des spermatozoïdes était un épuisement énergétique. Les spermatozoïdes humains dépendent de l'oxydation aérobie du glucose accomplie par la conjonction de la glycolyse, du cycle de Krebs et de la phosphorylation oxydative par la chaîne de transport d'électrons. In 1992, de Lamirande and Gagnon [ 32] suggested that one possible target of ROS could be the glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, which is linked to the fiber sheath explaining the drop in ATP production observed in ROS-treated spermatozoa. Recently, it was demonstrated that the glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, a key enzyme of the glycolytic pathway, can be inactivated by oxidation of the –SH in its active site by exogenous H2O2 [ 33].

An appropriate level of thiol oxidation in proteins is necessary for sperm motility [ 144– 147]. However, the machinery that makes the spermatozoon to move is very sensitive to ROS [ 42, 154, 155] levels that decrease motility significantly do not impair the viability of these spermatozoa [ 34]. But most importantly, ROS alter motility differently for instance, 100 μM H2O2 promotes a significant decrease in motility and inhibits capacitation of human spermatozoa compared to nontreated controls. However, 100 μM DA-NONOate, a NO • donor, do not affect sperm motility and even stimulate capacitation [ 34]. It is also important to highlight that 200–500 μM DA-NONOate inhibits sperm capacitation without impairing motility or viability [ 34]. Altogether, these findings indicate that there is a need to identify which specifics ROS are at high levels in infertile men to better find treatment strategies to avoid their toxic effects.

Another possible target of ROS is tubulin, a structural protein of the sperm flagellum. We found that increasing concentrations of H2O2 promoted an increase in thiol oxidation levels of α-tubulin in human spermatozoa [ 1]. Thiol oxidation of α-tubulin impaired microtubule polymerization and thus affecting the appropriate functioning of the flagellum [ 35].

Sperm chromatin remodeling is completed during epididymal maturation [ 36, 37]. During this process, an appropriate balance of thiol oxidation in protamines assures a healthy sperm chromatin structure. Both reduction and over oxidation of protamine thiols are associated with male infertility [ 38, 39].

Peroxiredoxins are selenium-free enzymes with one (PRDX6) or two cysteines (PRDX1 to 5) in their active site that are highly reactive with H2O2 and other peroxides. They compose the primary antioxidant system in ejaculated human spermatozoa since the amount of reduced GSH is insufficient (∼0.1 mM), the absence of CAT, and inactivation of mitochondrIal GPX4 as ROS scavenger [ 40, 41]. They are considered essential elements of the antioxidant defense of spermatozoa since infertile men have low amounts of PRDXs with high levels of thiol oxidation. This modification promotes the inactivation of their enzymatic activity and thus generating an increase of oxidative stress and DNA damage [ 42]. Mouse spermatozoa lacking PRDX6 display low motility and high levels of lipid peroxidation (a marker of oxidative stress) and poor sperm quality. This poor sperm quality is associated with subfertility which is exacerbated with age [ 2, 3]. The absence of PRDX4 also leads to loss of spermatogenic cells and increase of apoptosis in the testis without a significant reduction of fertility of the knockout males [ 43]. Although not measured, the authors concluded that the spermatogenic cell loss and the increase in apoptosis are due to an oxidative stress generated by the absence of PRDX4.

Peroxiredoxins are highly sensitive to ROS, and an active reductant system must be taken in place to maintain active their peroxidase activity [ 44]. In the case of 2-Cys PRDXs, this re-activation is done by the TRX/TRX reductase/NADPH system. The functional deletion of thioredoxin domain-containing proteins Txndc2 and Txndc3 in mouse spermatozoa correlated with an increase of age-related oxidative stress [ 45]. The thiol oxidized PRDX6 cannot be reduced by the TRXs and requires the presence of reduced GSH and glutathione-S-transferase pi (GSTpi) [ 46]. Ascorbate can also reduce PRDX6 as it was reported in yeast [ 47]. However, later studies using yeast and mammalian somatic cells revealed that the GSH/GSTpi system is the physiological mechanism to reduce PRDX6 [ 48– 50]. Since the GSH content is very low in spermatozoa [ 51], it is possible that ascorbate may be necessary to maintain the peroxidase activity of PRDX6. In mouse, we demonstrated that PRDX6 is important to protect the paternal genome from oxidative damage [ 52, 53]. The fact ascorbic acid protected human sperm DNA against oxidative damage [ 54] supports the hypothesis yet to be proven that PRDX6 may be reduced by ascorbate rather than by the GSH/GST system in spermatozoa.

Rat epididymal spermatozoa, collected after 24 h of the end of treatment for 2 weeks with tert-BHP, a compound that generates an oxidative stress in vivo, showed increasing levels of thiol oxidation of PRDX1 and PRDX6, the most abundant PRDXs in the rat spermatozoa [ 4]. This treatment was meant to generate the oxidative stress during the epididymal maturation, and this PRDXs oxidation reflects the scavenging activity of these enzymes in an attempt to fight against the oxidative stress caused. Moreover, the total amount of PRDX1, PRDX4, and PRDX6 increased in the treated spermatozoa, suggesting an active transfer of these enzymes from the epididymal epithelium to the maturing spermatozoa [ 4]. This active transfer of antioxidant enzymes has also been reported for other proteins including GPX5 and TRX [ 55–59].

Infertile men have a lower quantity of PRDXs in seminal plasma and spermatozoa than healthy donors [ 42]. Sperm PRDX6 was low in 67% and 39% varicocele and idiopathic infertile patients, respectively. Sperm PRDX1 was only low in 42% of varicocele patients [ 42]. In most of the cases of infertility, higher levels of thiol oxidation of PRDX1 and PRDX6 were observed in sperm from these infertile men. The thiol oxidation ratio (thiol oxidized PRDX/reduced PRDX) negatively and positively correlated with sperm motility and DNA damage and lipid peroxidation, respectively [ 42]. Interestingly, sperm levels of high molecular mass complexes of hyperoxidized PRDX6 were greater in both infertile men groups than in donors and the PRDX6 thiol oxidation ratio correlated positively with lipid peroxidation in spermatozoa [ 42]. These higher molecular mass complexes contain the sulfonated form of PRDXs (PRDX-SO2) a kind of redox-dependent modification that occurs when a strong oxidative stress is established [ 60].

Another significant modification of thiol groups by ROS is the formation of protein adducts with electrophiles such as aldehyde 4-hydroxynonenal (4-HNE) and acrolein, products of lipid peroxidation [ 61]. Both electrophiles promoted an increase in mitochondrial ROS production and reduction, DNA damage and reduction of motility in spermatozoa [ 62, 63]. The 4-HNE-dependent protein modification promotes the inactivation of succinate dehydrogenase and dynein heavy chain, both important proteins of the motility machinery of human spermatozoa. The modification of heat shock protein A2 by 4-HNE promoted its degradation by the proteasome system in male germ cells [ 64]. The recent evidence that the inhibition of arachidonate 15-lipoxygenase prevented the 4-HNE-induced protein damage in male germ cells [ 65] supports the potential advantage of pharmacological inhibition of this enzyme to protect germ cells from oxidative damage. Acrolein is capable of forming adducts with proteins and DNA and thus promoting its deleterious effects observed in spermatozoa [ 62, 63] that may include enzyme inactivation and mutagenesis [ 66, 67]. It has been reported that acrolein impairs the activity of the TRX/TRD system and PRDX [ 68].

S-Glutathionylation

Glutathione is a water-soluble tripeptide ubiquitously distributed in tissues. It is the predominant nonprotein source of intracellular SH groups (∼1–10 mM in most of the mammalian cells) present in the cytosol (∼90% of the total GSH), mitochondria, endoplasmic reticulum, and possibly in the nucleus [ 69, 70]. Protein S-glutathionylation occurs when GSH reacts with protein SH groups, often resulting in enzyme inactivation [ 71–74]. This mechanism may appear detrimental for the cell, but it is protective because it prevents further protein oxidation and it is reversible [ 8, 75].

Mammalian spermatozoa have a little amount of GSH (1–13 nmoles GSH/10 9 spermatozoa) and particularly in humans is approximately 0.3 mM [ 51] compared to the 10 mM found in most somatic cells [ 5]. Thus, the contribution of this antioxidant compound in the defense against oxidative stress is limited. This restriction will impact on antioxidant enzymes, for instance, PRDXs that require GSH for reduction of their thiol groups after ROS oxidized them. This particular topic will be discussed later in this review.

Human and mouse sperm proteins are subjected to S-glutathionylation we observed that mouse spermatozoa, lacking PRDX6, show higher levels of this modification compared to wild-type controls [ 34]. Human spermatozoa treated with H2O2 or tet-butyl hydroperoxide (tert-BHP) showed higher levels of glutathionylated proteins than nontreated controls [ 34]. Although the increase of S-glutathionylation was an antioxidant response, it was not sufficient as the oxidative stress generated either by lacking PRDX6 or by exogenously increasing the levels of ROS severely affected sperm motility.

The response of human spermatozoa to high levels of H2O2 or tert-BHP depended on the concentration of each ROS H2O2 generates S-glutathionylation at lower concentrations than tert-BHP, indicating a more reactive molecule capable of damaging the spermatozoon. Interestingly, this significant reduction in total and progressive motility was observed in viable spermatozoa [ 34]. This observation highlights the differential effects of ROS on sperm functions.

S-Glutathionylation was observed in the cytosolic and Triton X-100-insoluble fractions in human spermatozoa treated with high concentration of H2O2 [ 34]. Members of the human sperm antioxidant system may be inactivated by S-glutathionylation and therefore trigger a strong oxidative stress associated with the impairment of sperm motility and capacitation. PRDX1, PRDX5, and PRDX6 are found in the Triton X-100-soluble fraction, and PRDX6 is also found in the cytosolic and Triton X-100 soluble fractions [ 60]. We then can hypothesize that S-glutathionylation also contributes with the inactivation of these PRDXs, explaining the high oxidative stress associated with poor sperm quality observed in infertile men [ 42].

S-Nitrosylation and tyrosine nitration

Nitric oxide (NO • ) or its derivatives (e.g. ONOO − ) generate S-nitrosylation in proteins. High levels of NO • and ONOO − can modify structural proteins and enzymes, thus altering cellular function. However, low levels of these ROS are involved in redox signaling [ 6, 7]. About 240 s-nitrosylated proteins were identified in human spermatozoa treated with the NO • donor nitrosocysteine [ 76]. Enzymes involved in energy production, motility, ion channels, and in antioxidant defense were identified as modified by s-nitrosylation, indicating that this modification may be involved in redox regulation of sperm physiological processes. Of interest, PRDX1, GST, and thioredoxin domain-containing protein 3 and 11 carried this modification (for a complete list of s-nitrosylated proteins, see Lefièvre et al. [ 76]).

Peroxiredoxins are susceptible to NO • or ONOO − attack for instance, S-nitrosylation impairs the ability of PRDX2 to reduce peroxide, thus promoting neuronal cell oxidative stress [ 77] and, as mentioned above, PRDX1 was identified as one of the S-nitrosylated proteins due to nitroso-cysteine treatment in human spermatozoa [ 76].

Tyrosine (Tyr) nitration is also a protein modification promoted by NO • and ONOO − . A Tyr residue reacts with these ROS producing a nitro (-NO2) group. This modification will alter protein function leading to either a physiological or pathological effect, depending on the protein target and the level of ROS generated [ 78, 79]. It has been reported that spermatozoa from asthenozoospermic patients had high levels of Tyr nitration determined by immunocytochemistry [ 80]. Human spermatozoa treated with DA-NONOate show increased levels of Tyr nitration in a dose-dependent manner, a modification associated with the impairment of sperm motility [ 34]. Tyr-nitrated proteins were located in the Triton X-100-insoluble fraction of human spermatozoa. Immunocytochemistry studies showed that these modified proteins were mainly found in the flagellum in nonpermeabilized spermatozoa but also in the head when the sperm cells were permeabilized with methanol [ 34, 81].

Protein targets for NO • and ONOO − that display Tyr nitration and may account for impairment of sperm motility are enzymes belong to glycolysis (glyceraldehyde 3-P- dehydrogenase and enolase) and the Krebs cycle (aconitase, α-ketoglutarate dehydrogenase, malate dehydrogenase, and dihydro lipoamide dehydrogenase) (see references in Morielli and O’Flaherty [ 34]). By inactivating these enzymes by Tyr nitration, the production of ATP is severely diminished leading to an impairment of sperm motility. α-tubulin also can be modified by Tyr nitration [ 82], interfering with appropriate microtubule polymerization in the sperm flagellum.

Tyrosine nitration was found mostly in the Triton X-100-insoluble fraction [ 34], where PRDX1, PRDX5, and PRDX6 were found [ 60]. It is possible then that PRDXs are the target of NO • or ONOO − and be inactivated by Tyr nitration, leading to an increase in ROS levels that will impair sperm motility and capacitation.

Tyrosine nitration is also associated with sperm capacitation. Levels of Tyr nitration increased in spermatozoa exposed to ONOO − in a dose-dependent manner but at concentrations that do not affect sperm motility [ 34, 83]. The prevention of the time-dependent Tyr nitration by SOD (O2 •− scavenger) or L-NMMA (inhibitor of nitric oxide synthase (NOS)) that prevent capacitation in spermatozoa under capacitating conditions strongly suggests that ONOO − is endogenously produced during human sperm capacitation [ 84].

Redox signaling during sperm capacitation

Phosphorylation of proteins (e.g. enzymes, receptors and transcription factors) [ 85–92] and the redox regulation (which involves the oxidation of a signaling molecule) [ 93–96] represent two primary mechanisms regulating cell function. In essence, they resemble on–off switches for proteins [ 93, 96]. Under physiological conditions, the reversibility of these reactions is spontaneous or assured by reductive pathways or are catalyzed by enzymes [ 93, 97].

Growing evidence highlights the importance of H2O2 signaling in cell physiology [ 98– 100].

The redox regulation is essential for sperm capacitation [ 101–104]. Low levels of ROS trigger early, intermediate, and late phosphorylation events [ 105–109] that culminate with the increased capacitation-associated Tyr phosphorylation [ 101, 102]. Catalase, GPXs, and PRDXs are recognized scavengers of H2O2, but PRDXs are more versatile with a dual action as antioxidant and as modulators of H2O2-dependent signaling [ 44, 98, 100, 110–114]. This dual action of PRDXs is necessary for mammalian spermatozoa because these cells lack CAT (peroxisomes, containing the enzyme, are eliminated from germ cells during spermatogenesis [ 115, 116], and GPX4 is a structural protein involved in the mitochondrial sheath without antioxidant capacity in the ejaculated spermatozoa [ 117]. Other GPXs such as GPX2, 3, and 5 are not present in human spermatozoa [ 118, 119], and inhibition of either CAT or the GPX system did not increase the levels of lipid peroxidation in human spermatozoa [ 40]. Thus, the highly abundant and reactive PRDXs with different ROS become major players not only in the protection against oxidative damage but the regulation of the redox signaling in human spermatozoa [ 40–42, 60, 101–103].

We observed differential subcellular localization of the six PRDX isoforms in human spermatozoa and that PRDX1, PRDX4, PRDX5, and PRDX6 react with different concentrations of H2O2 [ 60]. Interestingly, PRDX6 is highly abundant and the only member of the family present in all the subcellular compartments of human spermatozoa and to react with H2O2 at levels (50 μM) that promote CAP, as well as with other ROS [ 60].

The thiol oxidation is also associated with physiological functions in human spermatozoa, a temporal inhibition of PRDXs by thiol oxidation allows the increase of ROS at levels that will not promote damage but will trigger the capacitation-associated phosphorylation events such as phosphorylation of PKA substrates and Tyr residues [ 120]. The inhibition of 2-Cys PRDXs with thiostrepton promoted the prevention of sperm capacitation and the establishment of oxidative stress. Thus, PRDX1–5 are important to assure the acquisition of fertilizing ability by the human spermatozoon [ 120].

PRDX6 is the only member of the family with phospholipase A2 activity which is important to remove lipid peroxides from the membranes [ 121, 122]. When 1-Hexadecyl-3-(trifluoroethyl)-sn-glycero-2-phospho-methanol lithium (MJ33) was present in the capacitation medium, spermatozoa not only were unable to undergo capacitation but also they displayed higher levels of lipid peroxidation compared to those capacitated without the inhibitor. These results indicate that PRDX6 is dominant in the protection of human spermatozoa against lipid peroxidation to assure normal function as the other 2-Cys PRDXs were not inhibited by MJ33 [ 120].

Human sperm capacitation is associated with rapid and reversible changes in protein -SH groups that appear to be redox regulated [ 123, 124]. This shift in the redox status of thiol groups is a very dynamic mechanism of switching on or off protein activity. The increases or decreases in -SH content were prevented by exogenous addition of SOD or CAT to the capacitating medium [ 124]. Some sperm proteins, with molecular mass and isoelectric point similar to those of PRDX1, PRDX4, and PRDX6 [ 125, 126], are oxidized by H2O2 during capacitation. This evidence supports the findings that thiol oxidation of PRDXs allows the redox signaling necessary to trigger phosphorylations events occurring during sperm capacitation [ 105, 107–109, 127].


INTESTINAL Lipid Metabolism and Chylomicron Assembly

Intestinal Lipid Absorption

Through absorption of dietary lipids, the intestine is a key regulator of stored and circulating lipids. Primarily it is enterocytes in the small intestine that actively regulate the release of dietary lipids into circulation (503-505). The predominant lipids derived from diet are triglycerides, phospholipids and cholesteryl esters. In the intestinal lumen, ingested lipids are emulsified by bile salts to enhance their hydrolysis by lipases (Figure 9) (506-509). Triglycerides make up the largest percentage of the intestinal lipids. Lipolysis of triglycerides releases free fatty acids (non-esterified fatty acids) and monoacylglycerides (Figure 9). These are absorbed on the luminal surface of the enterocytes both by free diffusion and actively by protein-mediated transport into the enterocyte cytosol (Figure 9) (508-510). The principal transporters identified to date are CD36 (now known as SR-B2 (511)) and several fatty acid binding and transport proteins (512-514).

Graphique 9.

Intestinal Triglyceride and Cholesterol Metabolism. In the intestinal lumen, dietary triglyceride (TG) and cholesterol are emulsified by bile salts which enhance their uptake. Lipases in the intestinal lumen digest triglycerides to free fatty acids (FFA) and monoacylglycerides (MAG). These are absorbed into the enterocyte where they are used in the synthesis of TG, phospholipid and cholesteryl ester (CE). Much of the synthesized TG in enterocytes is packaged, along with phospholipids, cholesterol and proteins into chylomicrons, which are secreted at the basolateral surface of the enterocyte and enter the lymphatic system. The assembly of chylomicrons begins in the endoplasmic reticulum. During the synthesis of apolipoprotein B48 (apoB48), the protein acquires phospholipid from the endoplasmic reticulum membrane and also cholesterol and TG to form a primordial chylomicron. Continued acquisition of TG and CE and smaller, exchangeable proteins (e.g. apolipoprotein A-IV and apolipoprotein C-III) in the endoplasmic reticulum enlarges the particle to form a prechylomicron. Prechylomcirons are transported to the Golgi apparatus in specialized COPII vesicles. In the Golgi apparatus, the prechylomicron matures into a chylomicron. The maturation process includes the glycosylation of apoB48, the acquisition of additional proteins (e.g. apolipoprotein A-I) and lipid. Secretory vesicles formed from the Golgi carry the mature chylomicrons to the basolateral surface of the enterocyte. Fusion of the secretory vesicle membrane with the plasma membrane releases the chylomicron into the extracellular space where it is taken up into lacteals near the enterocyte and, thus, enters the lymphatic circulation. Dietary cholesterol in the intestinal lumen is taken into the enterocyte by a process involving Niemann-Pick C1-like protein 1 (NPC1L1). Enterocyte cholesterol and CE can be incorporated into chylomicrons and secreted with TG. In addition, enterocyte cholesterol can be directly excreted into the intestinal lumen using the heterodimer ATP-binding cassette transporter G5 and G8 (ABCG5/G8). Enterocyte cholesterol can also be transported to and incorporated into the basolateral membrane for efflux into the circulation.

Chylomicron Assembly and Secretion

In the enterocyte, the free fatty acids and monoacylglycerides are used to synthesize triglycerides, phospholipids, and cholesteryl esters (Figure 9) (508,509,513,515-517). The majority of the triglycerides formed in the enterocytes are repackaged into large, buoyant lipoproteins, called chylomicrons, and secreted from the basolateral surface of the cell (Figure 9). These particles play a central role in the transport of triglycerides and fat-soluble vitamins to the rest of the body (518).

The assembly of the chylomicron particle from precursors is a complex process. Each particle contains a single copy of apolipoprotein B48 and assembly begins with the synthesis of this protein in the rough endoplasmic reticulum. Apolipoprotein B48 is a truncated form of apolipoprotein B100 that is formed by posttranscriptional editing (519,520). As apolipoprotein B48 is synthesized and translocated across the endoplasmic reticulum membrane, it becomes lipidated to form a phospholipid-rich, dense primordial chylomicron in the lumen of the endoplasmic reticulum (Figure 9). The primordial chylomicron contains apolipoprotein B48, phospholipid, cholesterol and minor amounts of cholesteryl ester and triglyceride (513,521,522). The assembly process requires microsomal triglyceride transfer protein (523). In the absence of sufficient lipid, or if microsomal triglyceride transfer protein function is impaired, apolipoprotein B48 is ubiquitinated and targeted for proteasome degradation (524). The importance of this initiating assembly step is seen in patients with a defect in the MTP gene leading to the rare recessive disorder abetalipoproteinemia. Individuals with abetalipoproteinemia have almost undetectable levels of apoB or and very low total cholesterol levels in their plasma because of the inability to assemble apoB-containing lipoproteins in their enterocytes or hepatocytes. Among the sequelae experienced by these patients are accumulation of triglycerides in their intestines and livers and a deficiency of lipid-soluble vitamins in their plasma (525,526). If untreated, these patients develop severe neurological problems mostly related to vitamin E and A deficiency.

After formation, the initial primordial particle expands by the acquisition of additional triglyceride and cholesteryl ester (Figure 9). The additional lipid is acquired by fusion with non-apolipoprotein B48 containing particles that are rich in triglyceride and cholesteryl ester. The exact origin of these lipid particles and their precise composition is currently actively debated (504,505,513,527,528), but the fusion of the primordial chylomicron with the apolipoprotein B48-free particles occurs in the endoplasmic reticulum (513). The resulting particle is a prechylomicron (Figure 9). In addition to apolipoprotein B48, the prechylomicron surface can contain multiple copies of other small, exchangeable apoproteins including apolipoprotein A-IV and apolipoprotein C-III. Exchangeable apoproteins are soluble proteins that are not as tightly adherent to the particle surface and so can be exchanged between lipid particles.

Prechylomicrons are transported out of the endoplasmic reticulum and delivered to the Golgi apparatus for further processing (Figure 9). Transport occurs in specialized vesicles that can accommodate their large size. The unique vesicles contain a number of specific proteins necessary for the transport and docking process. Vesicle-associated membrane protein-7, coatomer protein II and Sar1b, a small GTPase component of the coatomer protein II vesicle assembly machinery (Figure 9) are among the specialized proteins on the lipid transport vesicles (505,529-531). The maturation of the particle in the Golgi apparatus includes further glycosylation of apolipoprotein B48 and the addition of apolipoprotein A-I to the surface (505,532,533). After processing, the mature chylomicron is packaged into Golgi-derived secretory vesicles and transported to the basolateral surface and exocytosed into the lymph (Figure 9) (527,534,535).

The assembly of chylomicrons in enterocytes is a complex process requiring a number of coordinated steps and specific factors to work in unison. A failure in any of these can lead to lipid-related disease states. For instance, mutations in the SAR1B gene lead to retention of prechylomicrons within membrane-bound structures in the enterocytes (529). The condition is marked in childhood by decreased blood cholesterol levels, lipid accumulation in the enterocytes, chronic fat malabsorption with steatorrhea, and deficiencies in fat-soluble vitamin and essential fatty acids.

Chylomicron Cholesterol

Although chylomicrons are triglyceride-rich, they also carry substantial amounts of cholesterol (536,537). The cholesterol in chylomicrons comes from the general pool of enterocyte cholesterol. Enterocytes acquire cholesterol by uptake at the luminal surface, acquisition from lipoproteins at the basal lateral surface, and by de novo synthesis within the enterocyte. Niemann-Pick C1-Like 1 protein is a key component of the luminal acquisition machinery (Figure 9) (538), while the low density lipoprotein receptor appears to be a major mediator of cholesterol acquisition at the basolateral surface (539,540). The incorporation of cholesterol into chylomicrons contributes to the circulating levels of cholesterol, and increases in intestinal synthesis of chylomicrons due to increased dietary lipids contributes to cardiovascular risk and atherosclerosis, albeit by complex mechanisms (516,541,542).

Non-Chylomicron Intestinal Lipid Metabolism

Enterocytes can also regulate circulating lipids by means other than chylomicron secretion. In the presence of excess fatty acids or cholesterol, the enterocyte can store excess lipid in their esterified forms (triglycerides and cholesteryl esters, respectively) within cytoplasmic lipid droplets (543-545). The neutral lipids in the droplets can subsequently be mobilized by hydrolysis as needed by the cell. The free fatty acids liberated from storage droplets can be incorporated into the chylomicron production pathway to become part of secreted chylomicrons.

Finally, the intestine also regulates circulating cholesterol levels by taking up excess circulating cholesterol and excreting it into the intestinal lumen for clearance in the feces. This process is known as trans-intestinal cholesterol excretion. It acts as an adjunct to liver biliary secretion and can account for as much as 30% of neutral sterol excretion (546). Trans-intestinal cholesterol excretion occurs at the luminal surface of the enterocytes by a process that primarily utilizes the ATP-binding cassette transporter pair ABCG5/G8 (Figure 9) but can use other pathways as well (547).

Sommaire

It is clear that intestinal lipid processing is a key contributor to the circulating levels of both triglyceride and cholesterol. Dietary, genetic and metabolic factors that disrupt the process of enterocyte lipid metabolism potentially can alter lipid homeostasis and produce disease states.


Résumé

Oxidative stress is known to play an important role in the pathogenesis of a number of diseases. In particular, it is linked to the etiology of Alzheimer’s disease (AD), an age-related neurodegenerative disease and the most common cause of dementia in the elderly. Histopathological hallmarks of AD are intracellular neurofibrillary tangles and extracellular formation of senile plaques composed of the amyloid-beta peptide (Aβ) in aggregated form along with metal-ions such as copper, iron or zinc. Redox active metal ions, as for example copper, can catalyze the production of Reactive Oxygen Species (ROS) when bound to the amyloid-β (Aβ). The ROS thus produced, in particular the hydroxyl radical which is the most reactive one, may contribute to oxidative damage on both the Aβ peptide itself and on surrounding molecule (proteins, lipids, …). This review highlights the existing link between oxidative stress and AD, and the consequences towards the Aβ peptide and surrounding molecules in terms of oxidative damage. In addition, the implication of metal ions in AD, their interaction with the Aβ peptide and redox properties leading to ROS production are discussed, along with both in vitro et in vivo oxidation of the Aβ peptide, at the molecular level.


Voir la vidéo: Structure simplifiée des lipides (Mai 2022).