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Clonage moléculaire - Endonucléases de restriction à extrémités franches

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Je travaille dans un laboratoire de microbiologie où nous faisons beaucoup de clonage. J'ai toujours utilisé des endonucléases de restriction pour cliver l'ADN afin d'avoir des extrémités collantes et non des extrémités franches. Je travaille actuellement sur un projet qui suggère d'utiliser une enzyme de restriction à extrémité franche, telle que EvoRV, puis d'effectuer une queue en T du plasmide, pl4440. Ma question est pourquoi je ne traite pas mon insert pcr'd avec une digestion de restriction comme je le ferais avec le plasmide comme le suggère le protocole ? Comment puis-je savoir que l'insert a des extrémités capables de se ligaturer dans le plasmide si je ne conçois pas les sites de restriction dans les amorces ?


Pour savoir si les extrémités sont compatibles, consultez les extrémités cohésives compatibles (isoschizomères) sur le site Web de NEB.

Si vous n'êtes pas sûr, faites une ligature à bout émoussé. Pour émousser une extrémité collante (D'après les commentaires):

Utilisez la polymérase Klenow ou Pfu (ou toute polymérase de relecture/haute fidélité).

Vous pouvez utiliser Taq si vous avez l'intention de faire un clonage TA.


Notions de base sur les enzymes de restriction

Que serait la recherche moderne en biologie moléculaire sans enzymes de restriction ? Ces chevaux de bataille du laboratoire sont à l'origine de bon nombre des progrès de la recherche biologique fondamentale et des applications commerciales depuis plus de 40 ans. Les enzymes de restriction (ou endonucléases de restriction) ont d'abord été identifiées dans des bactéries, mais ont ensuite été trouvées dans certaines archées. En général, les enzymes de restriction clivent l'ADN double brin. Chaque enzyme de restriction reconnaît des séquences d'ADN spécifiques, et le clivage peut se produire dans la séquence de reconnaissance ou à une certaine distance, selon l'enzyme. Les séquences de reconnaissance ont généralement une longueur de 4 à 8 paires de bases (pb) et le clivage peut produire des extrémités collantes (extrémités saillantes 5' ou 3') ou des extrémités franches (Figure 1).

Figure 1. Extrémités collantes ou saillantes (5' ou 3') ou extrémités franches produites par des enzymes de restriction spécifiques.

Aujourd'hui, environ 4 000 enzymes de restriction ont été caractérisées, et plus de 600 d'entre elles sont disponibles dans le commerce. REBASE est une ressource utile et consultable pour des informations complètes et à jour sur les enzymes de restriction, y compris la spécificité, la sensibilité et les sources commerciales [1].

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Clonage moléculaire - Endonucléases de restriction à extrémités franches - Biologie

La réaction en chaîne par polymérase (PCR) peut être utilisée pour générer rapidement des fragments d'ADN pour le clonage, à condition qu'une source appropriée d'ADN matrice existe et que des informations de séquence suffisantes soient connues pour permettre la conception d'amorces spécifiques pour l'amplicon souhaité. Contrairement au clonage traditionnel, la PCR offre la possibilité de cloner facilement des fragments d'ADN qui peuvent être peu abondants dans un échantillon complexe tel que l'ADN génomique ou des ADNc qui correspondent à des transcrits d'ARNm rares. Les produits PCR peuvent être digérés et ligaturés par des moyens traditionnels, ligaturés directement (extrémités franches ou TA) ou utilisés dans des applications de clonage indépendant de la ligature (LIC) ou de clonage sans couture, telles que Gibson Assembly ® ou NEBuilder HIFI DNA Assembly (NEBuilderHiFi.com).

Au cours d'une PCR typique, l'ADN matrice (contenant la région d'intérêt) est mélangé avec des désoxynucléotides (dNTP), une ADN polymérase et des amorces. Les amorces sont de courts segments d'ADN complémentaire qui s'apparient avec l'ADN matrice, en amont de la région d'intérêt, et servent de sites de recrutement pour la polymérase. La PCR implique une série de cycles de température qui sont contrôlés automatiquement par l'utilisation d'un thermocycleur qui contrôle avec précision à la fois la température de réaction et la durée de chaque étape de température, garantissant une amplification efficace (pour plus de détails sur la PCR, voir amplification de l'ADN).

Pour les réactions PCR de routine et robustesTaq L'ADN polymérase est le choix d'enzyme le plus courant. Cette polymérase laisse principalement des adénines simples indépendantes de la matrice (A) à l'extrémité 3&rsquo du produit de PCR. Pour la PCR haute fidélité, une ADN polymérase de relecture doit être utilisée. De telles enzymes ne créent pas de surplombs de base uniques, laissant des extrémités émoussées. Une considération des extrémités des produits PCR, y compris leur statut de phosphorylation, est importante pour les stratégies de clonage ultérieures (voir Modification finale). Lorsque les amorces PCR comprennent des sites d'enzymes de restriction, les produits PCR peuvent être digérés et ligaturés par des moyens traditionnels.

Des molécules vecteurs pour le clonage peuvent également être produites par PCR. Les sites de restriction inclus dans les amorces permettent la génération d'extrémités collantes (surplombs monocaténaires) pour faciliter le clonage des fragments de restriction. Sinon, un vecteur à extrémités franches peut être produit par PCR à l'aide d'une polymérase de relecture haute fidélité ou en émoussant le surplomb de base unique 3&rsquo produit par Taq polymérase. La transcription inverse de l'ARN en ADN complémentaire premier brin (ADNc) suivie d'une PCR (RT-PCR) permet le clonage de molécules d'ADN double brin qui correspondent aux transcrits de gènes (pour l'ARNm, voir la synthèse d'ADNc).

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Stratégies de clonage, Partie 3 : Clonage direct

Le clonage à extrémités franches est l'une des méthodes les plus simples et les plus polyvalentes pour cloner l'ADNdb dans des vecteurs plasmidiques. C'est facile car l'insert à extrémité émoussée nécessite peu ou pas de préparation. Lisez un aperçu du clonage direct avec des conseils pour réussir cette approche de clonage.

Le clonage de molécules d'ADN double brin (ADNdb) dans des vecteurs plasmidiques est l'une des techniques les plus couramment utilisées en biologie moléculaire. La procédure est utilisée pour le séquençage, la construction de bibliothèques de molécules d'ADN, l'expression d'ARN codant et non codant, et de nombreuses autres applications. Les articles précédents de DECODED, disponibles en ligne sur www.idtdna.com/DECODED, ont passé en revue la méthode Gibson Assembly&trade et les techniques de clonage cohésif. Vous y trouverez également des informations supplémentaires sur les bases des plasmides dans l'article : stratégies de clonage, partie 2 : clonage cohésif, qui peut être utile aux lecteurs de cet article. Ici, nous discuterons du clonage à extrémités franches comme troisième méthode par laquelle des fragments d'ADN peuvent être clonés dans un vecteur plasmidique.

Présentation du clonage de bout en bout

Le clonage à extrémités franches implique la ligature de l'ADNdb dans un plasmide où l'insert et le plasmide linéarisé n'ont pas de bases en surplomb à leurs extrémités. Il ne bénéficie pas de la stabilisation des liaisons hydrogène associée aux bases complémentaires en surplomb utilisées dans le clonage d'extrémité cohésive, mais les associations transitoires des groupes 5 & rsquo phosphate et 3 & hydroxyle disponibles sont suffisantes pour produire des clones réussis en présence de T4 ligase [1] . Une illustration d'une expérience de clonage de base émoussée est présentée à la figure 1.

Le clonage à extrémités franches est également l'une des méthodes les plus simples et les plus polyvalentes pour cloner l'ADNdb dans des vecteurs plasmidiques. C'est facile parce que l'insert à extrémité émoussée nécessite peu ou pas de préparation et évite la digestion enzymatique et la purification ultérieure nécessaires pour le clonage cohésif. Il est polyvalent car l'insert et le vecteur ont moins de limitations de séquence que les autres méthodes. Cela signifie que le clonage à extrémités franches présente des avantages uniques, ainsi que des inconvénients, par rapport aux méthodes de clonage à extrémités cohésives et d'assemblage isotherme.

Considérations

Il existe plusieurs facteurs qui rendent difficile le clonage direct. Il est 10&ndash100X moins efficace que le clonage cohésif, ce qui entraîne moins de colonies et la moitié de ces colonies recombinantes ont des inserts incorporés dans la mauvaise orientation. De plus, il se produit beaucoup de recircularisation des plasmides. Il peut être réduit, mais n'est pas facilement éliminé, ce qui entraîne de nombreux vecteurs vides. Par conséquent, lorsque vous utilisez cette méthode, vous devez effectuer un dépistage par digestion de restriction ou PCR avant la vérification de la séquence.

Un avantage majeur du clonage à extrémités franches est que l'insert souhaité ne nécessite aucun site de restriction dans la séquence. Cela rend le clonage direct extrêmement polyvalent, simplifie la planification et évite les ajouts de séquences artificielles indésirables qui pourraient nuire à certaines applications. De plus, comme l'insert n'a pas besoin d'être préparé par digestion de restriction, le clonage à extrémités franches a le potentiel d'être significativement plus rapide.

Conseils pour réussir les ligatures à bouts francs

Préparation du vecteur. Le vecteur peut être préparé par digestion si le site de clonage multiple (MCS) contient un site de reconnaissance pour une enzyme de restriction qui produit des extrémités franches, comme EcoRV (figure 1). Des sites de restriction qui génèrent des surplombs de séquence peuvent également être utilisés, suivis d'une suppression ou d'un remplissage des surplombs pour créer des extrémités franches. Cependant, cette approche n'est pas recommandée car il n'y a pas de bonne méthode pour évaluer le succès de la réaction d'émoussement, ce qui rend difficile le dépannage des réactions infructueuses.

Alternativement, le plasmide linéarisé peut être préparé pour le clonage à extrémités franches par amplification avec une polymérase haute fidélité et PCR ultérieure en utilisant des amorces conçues avec leurs extrémités 5 & rsquo au site d'insertion souhaité. Le produit plasmidique linéarisé apparaît comme une bande distincte sur un gel d'agarose, par rapport à un frottis produit par le modèle plasmidique superenroulé, facilitant le dépannage. Le plasmide modèle circulaire est éliminé par digestion avec DpnI, ou une enzyme de restriction similaire, qui coupe le plasmide méthylé en laissant le produit PCR non méthylé

Le plasmide est typiquement déphosphorylé pour les méthodes de ligature et d'amplification. Cependant, il est possible d'éviter cette exigence (voir alternative ci-dessous).

Conception de l'insert. L'insert à extrémité émoussée doit être phosphorylé. Si vous prévoyez d'hybrider des oligonucléotides ou d'utiliser des fragments de gènes IDT gBlocks & reg comme insert, notez que ceux-ci ne sont pas synthétisés avec 5 & rsquo groupes phosphate sauf si demandé & mdash assurez-vous de sélectionner l'option 5 & rsquo phosphate lors de la commande de ces séquences pour le clonage à bouts francs. Alternativement, des phosphates peuvent être ajoutés aux extrémités 5&rsquo de l'ADNdb avec une simple réaction de kinase, par exemple en utilisant la polynucléotide kinase T4 disponible dans le commerce. Cependant, cette méthode est moins efficace, en particulier lorsque des bases autres que G sont des cibles de kinase.

Lorsque les extrémités de l'insert ne sont pas émoussées, une réaction de polissage ou de remplissage est nécessaire. Des exemples d'extrémités qui nécessitent un polissage ou un remplissage comprennent les inserts générés par cisaillement ou sonication, ou par la polymérase Taq, qui laisse préférentiellement un seul surplomb d'adénosine aux 3 extrémités des inserts produits par des digestions de restriction et certains inserts produits par recuit de plusieurs oligonucléotides pour créer des produits plus longs. Un certain nombre d'ADN polymérases enlèveront les surplombs d'ADN et/ou peuvent être utilisées pour remplir les bases manquantes s'il y a un 3&rsquo hydroxyle disponible pour l'amorçage. Les polymérases pour de telles réactions comprennent l'ADN polymérase T4, le PFU et le fragment de Klenow d'ADN polymérase I. De nombreuses options et kits sont disponibles, alors vérifiez auprès des fabricants pour déterminer celui qui convient le mieux à votre application.

Comme avec les autres méthodes de clonage, les inserts plus courts se ligatureront généralement plus efficacement que les plus longs. Les fabricants incluent généralement des recommandations de taille pour les inserts de plasmide dans la documentation de plasmide comme guide utile dans la planification de votre expérience de clonage.

Enfin, contrairement au clonage à extrémités cohésives, le clonage à extrémités franches ne recrée pas automatiquement un site de restriction après la ligature de l'insert, à moins que des bases ne soient ajoutées à la séquence d'insert pour compléter le site manquant (figure 1).

Conditions de ligature. Dans les ligatures à extrémités franches, l'association des groupes phosphate 5' et des groupes hydroxyle 3' est plus transitoire que dans les ligatures à extrémités cohésives. Parce qu'ils n'ont pas la stabilisation des liaisons hydrogène des extrémités cohésives, les ligatures des extrémités franches sont plus sensibles aux conditions de réaction, en particulier aux concentrations des composants de la réaction.

La probabilité qu'un insert s'associe à un plasmide linéarisé est augmentée en ayant une concentration élevée d'extrémités franches d'insert disponibles. Cependant, la circularisation intramoléculaire du plasmide, après qu'une extrémité de l'insert a été jointe, fonctionne mieux à des concentrations plus faibles. Des concentrations d'inserts trop élevées ou des concentrations globales d'ADN trop élevées peuvent donner lieu à des plasmides avec plusieurs inserts ou concatémères. Bien que cela ne soit pas toujours nécessaire, certains chercheurs effectuent une courte incubation d'une heure avec des concentrations élevées d'insert et de ligase, puis diluent la réaction 20X avec du tampon ligase et permettent à la ligature de se poursuivre pendant 4 heures supplémentaires afin de faciliter la deuxième étape de la ligature. réaction [1].

La qualité et la concentration de la ligase T4 sont également importantes. Les ligatures à extrémités franches ont généralement lieu en présence de concentrations plus élevées de ligase que les ligatures à extrémités cohésives. Par exemple, alors qu'une ligature d'extrémité cohésive peut utiliser 1 unité de réaction T4 ligase/20 & ul, une réaction franche peut utiliser jusqu'à 3 unités/20 & ul de réaction. Les ligases T4 disponibles dans le commerce indiquent généralement si elles sont optimisées pour les ligatures à extrémités franches ou non. Suivez les directives du fabricant pour déterminer quelle ligase est appropriée pour votre expérience de clonage et quelle concentration utiliser. Notez que la Taq ligase ainsi que plusieurs autres ligases ne ligaturent pas les extrémités franches.

Une méthode alternative à bout émoussé. Comme cela a été mentionné, à moins que l'insert soit conçu avec les bases nécessaires pour recréer le site de restriction, le site de restriction émoussé utilisé pour linéariser le vecteur n'est normalement pas recréé par la ligature de l'insert (figure 1). Cela permet une méthode de clonage alternative, moins courante, à extrémités franches qui ne nécessite pas que le vecteur soit déphosphorylé. Au lieu de cela, il s'appuie sur des réactions concurrentes de digestion et de ligature pour réduire le fond de vecteur vide.

Dans cette méthode, le plasmide circularisé et l'insert sont placés dans un mélange réactionnel contenant l'enzyme de restriction produisant des extrémités franches et moins, ainsi que la ligase T4. Le plasmide circulaire est coupé et l'insert ligaturé dans une réaction en tube unique. Le plasmide vide qui est produit par ligature de T4 est ensuite recoupé par l'enzyme de restriction. Tant que l'insert n'est pas conçu pour produire ce site de restriction spécifique, tous les plasmides circularisés doivent contenir l'insert souhaité. Les détails de cette méthode&mdashégalement décrits avec un composant d'enzyme de polissage&mdash peuvent être trouvés dans Sambrook et Russell [1]. L'une des raisons pour lesquelles les chercheurs peuvent vouloir éviter cette technique est qu'elle implique le mélange de plusieurs tampons enzymatiques optimisés, ce qui peut affecter négativement l'activité des enzymes individuelles. Vérifiez auprès du ou des fabricants d'enzymes pour déterminer si les enzymes que vous avez choisies sont compatibles avec cette méthode.


Clonage moléculaire : un manuel de laboratoire (Quatrième édition)

Clonage moléculaire a servi de fondement à l'expertise technique dans les laboratoires du monde entier pendant 30 ans. Aucun autre manuel n'a été aussi populaire, ni aussi influent. Clonage moléculaire, Quatrième édition, du célèbre auteur fondateur Joe Sambrook et du nouveau co-auteur, l'éminent enquêteur HHMI Michael Green, préserve les détails et la clarté très appréciés des éditions précédentes et comprend des chapitres et des protocoles spécifiques commandés pour le livre à des praticiens experts de Yale, U Mass, Rockefeller University, Texas Tech, Cold Spring Harbor Laboratory, Washington University et d'autres institutions de premier plan. Les fondements théoriques et historiques des techniques sont des éléments importants de la présentation tout au long de la présentation, des informations qui aident beaucoup à résoudre les problèmes expérimentaux.

Pour la quatrième édition de cet ouvrage classique, le contenu a été entièrement refondu pour inclure les méthodes basées sur les acides nucléiques sélectionnées comme les plus largement utilisées et les plus précieuses dans les laboratoires de biologie moléculaire et cellulaire.

Les principaux chapitres de la troisième édition ont été révisés pour présenter les stratégies et approches actuelles de la préparation et du clonage des acides nucléiques, du transfert de gènes et de l'analyse de l'expression. Ils sont complétés par 12 nouveaux chapitres qui montrent comment l'ADN, l'ARN et les protéines doivent être préparés, évalués et manipulés, et comment la génération et l'analyse des données peuvent être gérées.

Le nouveau contenu comprend des méthodes pour étudier les interactions entre les composants cellulaires, telles que les puces à ADN, les technologies de séquençage de nouvelle génération, l'interférence ARN et l'analyse épigénétique à l'aide de techniques de méthylation de l'ADN et d'immunoprécipitation de la chromatine. Pour donner un sens à la richesse des données produites par ces techniques, un chapitre de bioinformatique décrit l'utilisation d'outils analytiques pour comparer des séquences de gènes et de protéines et identifier des modèles d'expression communs parmi des ensembles de gènes.

S'appuyant sur trente ans de confiance, de fiabilité et d'autorité, la quatrième édition de Clonage moléculaire est le nouvel étalon-or, le manuel de laboratoire de biologie moléculaire indispensable et la source de référence.

Points forts de la nouvelle édition :

  • Nouveau contenu étendu : 12 chapitres entièrement nouveaux sont consacrés aux stratégies de recherche actuelles les plus passionnantes, notamment l'analyse épigénétique, l'interférence ARN, le séquençage du génome et la bioinformatique
  • Portée élargie : les techniques basées sur les acides nucléiques sélectionnées pour l'inclusion ont favorisé les avancées récentes dans le transfert de gènes, l'expression de protéines, l'analyse d'ARN et l'expression de gènes clonés
  • Contenu classique : 10 chapitres de base originaux ont été mis à jour pour refléter les développements et les innovations dans les techniques standard et pour introduire de nouveaux protocoles de pointe
  • Format facile à suivre : l'attention aux détails et à la précision des éditions précédentes sont entièrement conservées
  • Annexes essentielles : une collection à jour de réactifs, de vecteurs, de milieux, de systèmes de détection et de techniques couramment utilisées est incluse
  • Paternité élargie : les chapitres et les protocoles ont été spécifiquement commandés à des experts renommés dans des institutions de premier plan

Eloge pour l'édition précédente :

“Tout laboratoire de recherche fondamentale utilisant des techniques de biologie moléculaire bénéficiera d'un exemplaire en main de la troisième édition récemment publiée de Clonage moléculaire : un manuel de laboratoire. les deux premières éditions de ce livre ont été des agrafes de biologie moléculaire avec une réputation prouvée d'exactitude et de rigueur.” —Le scientifique

“Dans chaque cuisine, il y a au moins un livre de cuisine indispensable. Clonage moléculaire : un manuel de laboratoire remplit le même créneau dans le laboratoire (avec) des informations pour aider à la fois l'utilisateur inexpérimenté et l'utilisateur avancé. (Il) a une fois de plus établi sa primauté en tant que manuel de laboratoire moléculaire et est susceptible de se retrouver sur les paillasses de laboratoire. dans le monde.” ——Tendances en neurosciences

“Clonage moléculaire : un manuel de laboratoire a toujours été le pilier du laboratoire pour les protocoles et les techniques. Il a une ascendance de race pure et la nouvelle édition ne déçoit pas. (Il) comprend des panneaux d'information à la fin de chaque chapitre qui décrivent les principes derrière les protocoles. L'ajout de ces informations s'étend Clonage moléculaire d'une ressource de laboratoire essentielle à un nouveau domaine, fusionnant le prototype précédent avec une monographie moléculaire moderne. la prochaine génération de Clonage moléculaire non seulement perpétue le fier héritage des deux premières éditions, mais étend également admirablement cette tradition pour fournir un manuel de laboratoire vraiment essentiel.” —Tendances en microbiologie


Joindre l'ADN in vitro pour former des molécules recombinantes

Restriction endonucléasescoupé à des séquences définies de (généralement) 4 ou 6 pb. Cela permet à l'ADN d'intérêt d'être coupé à des endroits spécifiques. La fonction physiologique des endonucléases de restriction est de faire partie d'un système de protection des bactéries contre l'invasion par des virus ou d'autres organismes. (Voir chapitre 7)

Tableau 3.1. Liste des endonucléases de restriction et de leurs sites de clivage. A' signifie que la nucléase coupe entre ces 2 nucléotides pour générer un 3' hydroxyle et un 5' phosphate.
Enzyme Placer Enzyme Placer
Aluje AG'CT Pasje GC'GGCCGC
BamSALUT G'GATCC TVPje CTGCA'G
BglII A'GATCT PvuII CAG'CTG
ÉcoIR G'AATTC Salje G'TCGAC
HaeIII GG'CC Sau3IA 'GATC
Hhaje GCG'C Smaje CCC'GGG
HincII GTY'RAC Spéje A'CTAGT
HindIII A'AGCTT Taqje T'CGA
HinFi G'ANTC Xbaje T'CTAGA
HpaII C'CGG Xhoje C'TCGAG
Kpnje GGTAC'C Noëlje C'CCGGG
Mboje 'GATC

une. Extrémités collantes

(1) Puisque les séquences de reconnaissance pour les endonucléases de restriction sont des pseudopalindromes, un clivage décentré dans le site de reconnaissance générera soit un débord 5' soit un débord 3' avec des extrémités auto-complémentaires (ou "collantes").

par exemple. 5' surplomb EcoRI G'AATTC

(2) Lorsque les extrémités des fragments de restriction sont complémentaires,

les extrémités peuvent se recuire. Deux fragments quelconques, quelle que soit leur origine (animale, végétale, fongique, bactérienne) peuvent être joints in vitro pour former des molécules recombinantes (Figure 3.3).

b. Bouts émoussés

(1) L'endonucléase de restriction clive au centre du site de reconnaissance pseudopalindromique pour générer des extrémités franches (ou flush).

ADN ligase T4 est utilisé pour lier ensemble des fragments d'ADN (figure 3.4). Notez que les extrémités "collantes" recuites des fragments de restriction ont entailles(généralement 4 pb d'intervalle). Les coupures sont des cassures dans le squelette du phosphodiester, mais tous les nucléotides sont présents. Lacunesdans un brin manque une chaîne de nucléotides.

L'ADN ligase T4 utilise l'ATP comme source de groupe adénylyle attaché à l'extrémité 5' de l'entaille, qui est un bon groupe partant après l'attaque par le 3' OH. (Voir le chapitre 5 sur la réplication).

À forte concentration d'extrémités d'ADN et de ligase, l'enzyme peut également ligaturer ensemble des fragments d'ADN à extrémités franches. Ainsi, deux fragments à extrémité émoussée peuvent être ligaturés ensemble. Remarque : Tout fragment avec un surplomb de 5' peut être facilement converti en une molécule à extrémité émoussée par une synthèse de remplissage catalysée par une ADN polymérase (souvent le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I). Ensuite, il peut être ligaturé à un autre fragment émoussé.

Liens sont des oligonucléotides duplex courts qui contiennent un site de clivage par endonucléase de restriction. Ils peuvent être ligaturés sur n'importe quelle molécule à extrémité franche, générant ainsi un nouveau site de clivage de restriction aux extrémités de la molécule. La ligature d'un lieur sur un fragment de restriction suivie d'un clivage avec l'endonucléase de restriction est l'une des nombreuses manières de générer une extrémité qui est facile à ligaturer à un autre fragment d'ADN.

recuit de homopolymère queues sont une autre façon de joindre deux molécules d'ADN différentes.

L'enzyme désoxynucléotidyle terminal transférasecatalysera l'ajout d'une chaîne de nucléotides à l'extrémité 3' d'un fragment d'ADN. Ainsi en incubant chaque fragment d'ADN avec le dNTP approprié et la désoxynucléotidyl transférase terminale, on peut ajouter des homopolymères complémentaires aux extrémités des ADN que l'on veut combiner. Par exemple, on peut ajouter une chaîne de G aux extrémités 3' d'un fragment et une chaîne de C aux extrémités 3' de l'autre fragment. Maintenant, les deux fragments vont se rejoindre via les queues homopolymères.

Graphique 3.5. Utilisation de lieurs (à gauche) et de queues homopolymères (à droite) pour fabriquer des molécules d'ADN recombinant.


APPLICATIONS ET IMPORTANCE DES ENZYMES UTILISÉES DANS LES EXPÉRIENCES DE BIOLOGIE MOLÉCULAIRE

RESTRICTION ENDONUCLEASE : Les endonucléases de restriction sont des enzymes qui coupent les acides nucléiques (y compris les molécules d'ADN et d'ARN) à des sites spécifiques. Avec des enzymes de restriction ou des endonucléases, les biologistes moléculaires peuvent couper ou entailler l'ADN d'une manière précise et reproductible, ce qui est crucial pour les techniques de clonage de gènes et d'autres expérimentations de biologie moléculaire. Les endonucléases de restriction sont des enzymes coupant l'ADN spécifiquement trouvées et isolées des bactéries et qui coupent des sites spécifiques sur une séquence nucléotidique connue sous le nom de sites de restriction. Sites de restriction sont les différents sites sur une molécule d'ADN qui est entaillé par une enzyme de restriction particulière. Plusieurs types d'enzymes de restriction existent, et elles proviennent principalement de micro-organismes (en particulier de bactéries) mais elles peuvent également être synthétisées chimiquement. Les enzymes de restriction ou endonucléases sont généralement divisées en trois (3) groupes, à savoir : Type I, Type II, et Type III enzymes de restriction (ER). Les ER de type I et de type III se lient à la molécule d'acide nucléique au niveau de leurs séquences de reconnaissance, mais ils coupent spécifiquement la molécule d'ADN à une distance considérable des sites de restriction. Cependant, les ER de type II sont beaucoup plus applicables pour une variété de manipulations de biologie moléculaire car elles coupent les molécules d'ADN exactement à leurs sites de restriction.

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Quelques exemples d'enzymes de restriction sont ÉcoIR (de E. coli), HaeIII (de Haemophilus aegyptius), BamSALUT (de Bacillus amyloliquefaciens), Pvuje (de Proteus vulgaris), De derrièreII (de Haemophilus influenzae)et Sau3A (de S. aureus) entre autres. La nomenclature des endonucléases de restriction est assez simple. Les enzymes de restriction sont généralement nommées d'après les bactéries dont elles ont été réellement isolées. Les trois premiers alphabets du nom d'une enzyme de restriction représentent le nom générique et le nom de l'espèce de la bactérie, tandis que les autres alphabets ou nombres attachés au nom représentent l'ordre de découverte des enzymes dans cet organisme particulier. Ces derniers alphabets ou nombres (généralement en chiffres romains) peuvent également représenter la souche désignée des endonucléases de restriction et le type. Par exemple, ÉcoRI est E. coli enzyme de restriction I. Les endonucléases de restriction sont appliquées dans de nombreuses techniques de biologie moléculaire, y compris, mais sans s'y limiter, le clonage de gènes, l'amplification de gènes, le séquençage d'ADN et les techniques de transfert.

PHOSPHATASE ALCALINE: La phosphatase alcaline est une enzyme produite par des organismes tels que E. coli et le tissu intestinal du veau, et qui élimine le groupe phosphate présent à l'extrémité 5 & 8242 d'une molécule d'ADN. Il élimine spécifiquement les groupes phosphate de l'extrémité 5'8242 de l'ADN pour donner l'extrémité 5'8242-OH qui peut se joindre à l'extrémité 3'8242 du vecteur qui transporte un ADN exogène dans une cellule hôte receveuse. Ainsi, empêchant la re-ligature ou la réassemblage non désirée de molécules d'ADN déjà entaillées ou coupées.

ADN LIGASE: L'ADN ligase est une enzyme qui relie spécifiquement les molécules d'ADN coupées (entailles). Ils réparent et joignent deux fragments d'ADN simple brin individuels (c'est-à-dire le vecteur de clonage et la molécule d'ADN à cloner) coupés par la même endonucléase de restriction. La ligature réalisée par l'enzyme ADN ligase est généralement la dernière étape de la technique de clonage de gènes avant la transformation de la cellule bactérienne receveuse. La jonction de la molécule d'ADN à cloner avec le vecteur conduit à la formation d'une nouvelle molécule connue sous le nom de molécule d'ADN recombinant (ADNr). Molécule d'ADN recombinant est une molécule d'ADN qui est créée par la ligature d'un vecteur avec une molécule d'ADN coupée, et cela se produit normalement dans un tube à essai où l'ADN coupé, le vecteur et les enzymes ADN ligase sont mélangés pour que la réaction se produise. Dans la technique de clonage de gènes par exemple, la même enzyme de restriction utilisée pour couper l'ADN d'intérêt doit être utilisée pour couper le véhicule ou le vecteur destiné à transporter le gène d'intérêt dans la cellule hôte receveuse. L'utilisation de la même enzyme de restriction pour effectuer l'entaille ou la coupe garantira qu'une partie n'est pas anormalement coupée, mais qu'elle est également entaillée afin qu'elle puisse être correctement ligaturée ou jointe par l'enzyme ADN ligase, qui provient principalement d'un produit génétiquement modifié. E. coli.

Taq POLYMÉRASE: L'enzyme Taq polymérase est une enzyme ADN polymérase thermostable qui est isolée d'une bactérie thermostable (en particulier Thermus aquatique), et qui est utilisé dans les techniques de PCR pour étendre les amorces le long de la molécule d'ADN simple brin dans la direction 5′-3′.

ADN POLYMÉRASE I: L'ADN polymérase I est une enzyme qui synthétise des molécules d'ADN complémentaires à une matrice d'ADN dans le sens 5'8242-3'8242. Il synthétise généralement l'ADN sur une matrice d'ADN ou d'ARN. L'ADN polymérase I commence généralement à partir d'une amorce oligonucléotidique avec une extrémité 3 & 8242 OH et est utilisée pour étendre les amorces oligonucléotidiques le long des molécules d'ADN simple brin. Les ADN polymérases sont synthétisées par E. coli, et ils exercent une activité similaire à celle de l'enzyme polymérase Taq. Ils s'apparient et polymérisent les brins d'ADN en croissance jusqu'à ce que le site de terminaison soit atteint.

RNase ENZYME : L'enzyme RNase est une enzyme nucléase qui digère l'ARN.

DNase ENZYME : L'enzyme DNase est une enzyme nucléase qui digère l'ADN.

NUCLÉAS : Les nucléases sont des enzymes de dégradation qui coupent, raccourcissent et dégradent les acides nucléiques (y compris l'ADN et l'ARN). Ils sont généralement utilisés dans la réaction PCR et d'autres expérimentations de biologie moléculaire pour digérer les molécules d'acide nucléique.

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Sambrook, J., Russell, D.W. (2001). Clonage moléculaire : un manuel de laboratoire, 3e éd. Presse de laboratoire Cold Spring Harbor, New York.

Tamarin Robert H (2002). Principes de la génétique. Septième édition. Tata McGraw-Hill Publishing Co Ltd, Delhi.

Twyman R.M (1998). Biologie Moléculaire Avancée : Une Référence Concise. Bios Scientific Publishers. Oxford, Royaume-Uni.


Quelle est la différence entre les pointes collantes et les pointes émoussées ?

Les enzymes de restriction coupent l'ADN double brin en deux. Selon l'enzyme de restriction, la coupure peut entraîner soit une extrémité collante ou une bout émoussé. Extrémités collantes sont plus utiles dans le clonage moléculaire car ils garantissent que le fragment d'ADN humain est inséré dans le plasmide dans la bonne direction.

A côté de ci-dessus, à quoi servent les bouts émoussés ? Bouts émoussés n'ont pas de surplomb. Ils ne peuvent pas correspondre aussi précisément que l'ADN avec prend fin cependant, ils peuvent être utiles lorsqu'ils sont collants prend fin ne peut pas être utilisé. SmaI est une enzyme de restriction qui rend extrémités émoussées.

Justement, quelle est la différence entre les bouts émoussés et les bouts collants quizlet ?

Extrémités collantes sont quand les enzymes font des coupes échelonnées dans le deux brins. Coupes qui ne sont pas directement opposées les unes aux autres. Extrémités collantes sont les plus utiles dans l'ADNr car ils peuvent être utilisés pour joindre deux différent morceaux d'ADN qui ont été coupés par la même enzyme de restriction.

Comment convertir les pointes émoussées en pointes collantes ?

Cru et extrémités collantes peut être inter converti soit en ajoutant des sites cognitifs de restriction, soit en supprimant certains d'entre eux. Bout émoussé sommes converti dans extrémité collante avant le clonage.


Méthodes

Lignées cellulaires et milieux

Les E. coli HB101 a été utilisé pour la préparation d'ADN plasmidique. Les bactéries ont été cultivées dans des milieux Luria-Bertani (LB). Des cellules T 293 de rein embryonnaire humain (HEK) ont été cultivées dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) additionné de 10 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (FBS), 1 mM de pyruvate de sodium, 0,1 mM d'acides aminés non essentiels, 2 mM de L-glutamine, 100 mg/ml de streptomycine et 100 unités/ml de pénicilline. Une lignée cellulaire de leucémie myéloïde C1498 [52], a été cultivée dans le milieu 1640 du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) complété avec les mêmes réactifs que ceux utilisés pour le DMEM. Les cellules ont été divisées tous les deux jours pour les maintenir en phase logarithmique.

Plasmides, amorces, PCR et séquençage

Un plasmide contenant la séquence codante du gène tdTomato, un plasmide contenant un vecteur alpha-rétroviral et des plasmides contenant gag/pol alpha-rétroviral à codons optimisés [53] ont été aimablement fournis par Axel Schambach (MHH Hannover, Allemagne). Une amorce directe (5'-ACCGGTGCCACCATGGCCACAACCATGGTG-3') et une amorce inverse (5'-GTCGACTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3') utilisées pour l'amplification du gène tdTomato ont été synthétisées par Eurofins Genomics (Ebersberg, Allemagne).

Les tampons optimaux pour les enzymes ou autres réactifs ont été fournis par les fabricants avec les enzymes correspondantes ou à l'intérieur des kits. Si disponible par les fabricants, le pH et les ingrédients des tampons sont mentionnés. Les amorces ont été dissoutes dans de l'eau ultrapure à une concentration mère de 20 pmol/μl. Le plasmide matrice a été dilué dans de l'eau à une concentration mère de 50 ng/μl. For PCR, the following reagents were mixed and filled up with water to a total volume of 50 μl: 1 μl plasmid DNA (1 ng/μl final concentration), 1.25 μl of each primer (0.5 pmol/μl final concentration for each primer), 1 μL dNTP (10 mM each), 10 μl of 5X Phusion HF buffer (1X buffer provides 1.5 mM MgCl2), and 0.5 μl Phusion DNA polymerase (2U/μl, Thermo Scientific).

PCR was performed using a peqSTAR thermocycler (PEQLAB Biotechnologie) at: 98°C for 3 minutes 25 cycles at 98°C for 10 seconds, 66°C for 30 seconds, 72°C for 30 seconds and 72°C for 10 minutes. To prepare a 0.8% agarose gel, 0.96 g agarose (CARL ROTH) was dissolved in 120 ml 1X TAE buffer (40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA, pH of 50X TAE: 8.4) and boiled for 4 minutes. Then 3 μl SafeView nucleic acid stain (NBS Biologicals) was added to the solution and the mixture was poured into a gel-casting tray.

DNA was mixed with 10 μl loading dye (6X) (Thermo Scientific) and loaded on the agarose gel (CARL ROTH) using 80 V for one hour in TAE buffer. The separated DNA fragments were visualized using an UV transilluminator (365 nm) and quickly cut to minimize the UV exposure. DNA was extracted from the gel slice using Zymoclean™ Gel DNA Recovery Kit (Zymo Research). The concentration of DNA was determined using a NanoDrop 2000 spectrophotometer (Thermo Scientific).

For sequence validation, the PCR product was subcloned using CloneJET PCR cloning kit (Thermo Scientific). 1 μl of blunt vector (50 ng/μl), 50 ng/μl of the PCR product, and 10 μl of 2X reaction buffer (provided in the kit) were mixed and filled with water to a total volume of 20 μl. 1 μl of T4 DNA ligase (5 U/μl) was added to the mixture, mixed and incubated at room temperature for 30 minutes. For bacterial transfection, 10 μl of the mixture was mixed with 100 μl of HB101 E. coli competent cells and incubated on ice for 45 minutes. Then the mixture was heat-shocked (42°C/2 minutes), put on ice again (5 minutes), filled up with 1 ml LB medium and incubated in a thermomixer (Eppendorf) for 45 minutes/37°C/450RPM. Then the bacteria were spun down for 4 minutes. The pellet was cultured overnight at 37°C on an agarose Petri dish containing 100 μg/mL of Ampicillin. The day after, colonies were picked and cultured overnight in 3 ml LB containing 100 μg/mL of ampicillin.

After 16 hours (overnight), the plasmid was isolated from the cultured bacteria using the QIAprep spin miniprep kit (QIAGEN) according to the manufacturer’s instructions. 720 to 1200 ng of plasmid DNA in a total of 12 μl water were sent for sequencing (Seqlab) in Eppendorf tubes. The sequencing primers pJET1.2-forward (5′-CGACTCACTATAGGGAG-3′), and pJET1.2-reverse (5′-ATCGATTTTCCATGGCAG-3′), were generated by the Seqlab Company (Göttingen, Germany). An ABI 3730XL DNA analyzer was used by the Seqlab Company to sequence the plasmids applying the Sanger method. Sequence results were analyzed using NCBI Blast as explained in the Results and discussion section.

Manipulation of DNA fragments

For viewing plasmid maps, Clone Manager suite 6 software (SciEd) was used. Restriction endonuclease enzymes (Thermo Scientific) were used to cut plasmid DNA. 5 μg plasmid DNA, 2 μl buffer O (50 mM Tris–HCl (pH 7.5 at 37°C), 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1 mg/mL BSA, Thermo Scientific), 1 μl SalI (10 U), and 1 μl AgeI (10 U) were mixed in a total of 20 μl water and incubated (37°C) overnight in an incubator to prevent evaporation and condensation of water under the tube lid. The next day, DNA was mixed with 4 μl loading dye (6X) (Thermo Scientific) and run on a 0.8% agarose gel at 80 V for one hour in TAE buffer. The agarose gel (120 ml) contained 3 μl SafeView nucleic acid stain (NBS Biologicals). The bands were visualized on a UV transilluminator (PEQLAB), using a wavelength of 365 nm, and quickly cut to minimize the UV damage. DNA was extracted from the gel slices using the Zymoclean™ gel DNA recovery kit (Zymo Research). The concentration of DNA was determined using a NanoDrop 2000 spectrophotometer (Thermo Scientific).

For the ligation of vector and insert fragments, a ligation calculator was designed (the Excel file available in the Additional file 1) for easy calculation of the required insert and vector volumes. The mathematical basis of the calculator is inserted into the excel spreadsheet. The size and concentration of the vector and insert fragments and the molar ratio of vector/insert (normally 1:3) must be provided for the calculation. Calculated amounts of insert (tdTomato) and vector (alpha-retroviral backbone) were mixed with 2 μl of 10X T4 ligase buffer (400 mM Tris–HCl, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 5 mM ATP (pH 7.8 at 25°C), Thermo Scientific), 1 μl of T4 ligase (5 U/μl, Thermo Scientific), filled up to 20 μl using ultrapure water and incubated overnight at 16°C. The day after, HB101 E. coli was transfected with the ligation mixture as mentioned above. The clones were picked and consecutively cultured for one day in LB medium containing ampicillin. Plasmid DNA was isolated using Zyppy™ plasmid miniprep kit (Zymo Research) and digested with proper restriction enzymes for screening. Digested plasmids were mixed with the loading dye and run on an agarose gel as mentioned above. The separated DNA fragments were visualized using a Gel Doc™ XR+ System (BIO-RAD) and analyzed by the Image Lab™ software (BIO-RAD). The positive clone was cultured overnight in 450 ml LB medium containing ampicillin. Plasmid DNA was isolated using QIAGEN plasmid maxi kit (QIAGEN), diluted in ultrapure water and stored at −20°C for later use.

Production of viral supernatant and transduction of cells

HEK293T cells were thawed, split every other day for one week and grown in log phase. The day before transfection, 3.5 × 10 6 cells were seeded into tissue culture dishes (60.1 cm 2 growth surface, TPP). The day after, the cells use to reach about 80% confluence. If over confluent, transfection efficiency decreases. The following plasmids were mixed in a total volume of 450 μl ultrapure water: codon-optimized alpharetroviral gag/pol (2.5 μg), VSVG envelope (1.5 μg), and the alpharetroviral vector containing the tdTomato gene (5 μg). Transfection was performed using calcium phosphate transfection kit (Sigma-Aldrich). 50 μl of 2.5 M CaCl2 was added to the plasmid DNA and the mixture was briefly vortexed. Then, 0.5 ml of 2X HEPES buffered saline (provided in the kit) was added to a 15 ml conical tube and the calcium-DNA mixture was added dropwise via air bubbling and incubated for 20 minutes at room temperature. The medium of the HEK293T cells was first replaced with 8 ml fresh medium (DMEM containing FCS and supplement as mentioned above) containing 25 μM chloroquine. Consecutively the transfection mixture was added. Plates were gently swirled and incubated at 37°C. After 12 hours, the medium was replaced with 6 ml of fresh RPMI containing 10% FCS and supplements. Virus was harvested 36 hours after transfection, passed through a Millex-GP filter with 0.22 μm pore size (Millipore), and used freshly to transduce C1498 cells. Before transduction, 24 well plates were coated with retronectin (Takara, 280 μl/well) for 2 hours at room temperature. Then, retronectin was removed and frozen for later use (it can be re-used at least five times) and 300 μl of PBS containing 2.5% bovine serum albumin (BSA) was added to the wells for 30 minutes at room temperature. To transduce C1498 cells, 5 × 10 4 of cells were spun down and resuspended with 1 ml of fresh virus supernatant containing 4 μg/ml protamine sulfate. The BSA solution was removed from the prepared plates and plates were washed two times with 0.5 ml PBS. Then cells were added to the wells. Plates were centrifuged at 2000RPM/32°C/90 minutes. Fresh medium was added to the cells the day after.

Flow cytometry and fluorescence microscope

For flow cytometry assessment, cells were resuspended in PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA and were acquired by a BD FACSCanto™ (BD Biosciences) flow cytometer. Flow cytometry data were analyzed using FlowJo software (Tree Star). Imaging was performed with an Olympus IX71 fluorescent microscope equipped with a DP71 camera (Olympus). Images were analyzed with AxioVision software (Zeiss). Fluorescent images were superimposed on bright-field images using adobe Photoshop CS4 software (Adobe).



Commentaires:

  1. Faumuro

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