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L'ARNm produit est-il constant dans le temps ?

L'ARNm produit est-il constant dans le temps ?



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Je fais une analyse statistique des données d'un ensemble de données de cellules de P. Furiosus exposées au rayonnement gamma.

Pour les échantillons exposés au rayonnement gamma, j'ai les valeurs des ARNm produits au cours du temps. Pour les échantillons non exposés aux rayonnements gamma (échantillons de référence), je n'ai pas l'heure à laquelle l'ARNm a été extrait.

Par conséquent, je me demandais : dans des conditions normales, généralement, l'ARNm produit est-il constant par rapport au temps ? J'ai pensé que peut-être le fait qu'il soit constant pourrait être la raison pour laquelle il n'y a pas les valeurs du temps.


L'ARNm produit est-il constant dans le temps ? - La biologie

L'ADN est copié en ARN dans un processus appelé transcription génétique. À transcrire signifie mettre quelque chose par écrit. L'information contenue dans l'ADN est transcrite - ou réécrite - dans une version plus petite (ARN) qui peut être utilisée par la cellule.

Objectifs d'apprentissage

  • Comprendre les étapes de base de la transcription de l'ADN en ARN
  • Décrire le rôle de l'ARN polymérase
  • Comprendre la différence entre le pré-ARN et l'ARNm
  • Décrire la modification post-traductionnelle de l'ARN et son objectif

La transcription a lieu dans le noyau. Il utilise l'ADN comme matrice pour fabriquer une molécule d'ARN (ARNm). Au cours de la transcription, un brin d'ARNm est formé qui est complémentaire d'un brin d'ADN. La figure 1 montre comment cela se produit.

Figure 1. Présentation de la transcription. La transcription utilise la séquence de bases dans un brin d'ADN pour former un brin complémentaire d'ARNm. Les triplets sont des groupes de trois bases nucléotidiques successives dans l'ADN. Les codons sont des groupes complémentaires de bases dans l'ARNm.


Introduction

Malgré la nature bruyante de l'expression des gènes 1,2,3,4,5,6, divers aspects de la dynamique cellulaire unique, tels que la croissance du volume, sont effectivement déterministes. Des mesures récentes de cellules individuelles montrent que la croissance du volume cellulaire est souvent exponentielle. Ceux-ci comprennent les bactéries 7,8,9,10, les archées 11, la levure bourgeonnante 10,12,13,14,15 et les cellules de mammifères 10,16. De plus, les nombres d'ARNm et de protéines sont souvent proportionnels au volume cellulaire tout au long du cycle cellulaire : l'homéostasie de la concentration en ARNm et en protéine est maintenue dans un volume cellulaire en croissance exponentielle avec un nombre de copies du génome variable 17,18,19,20,21, 22 . Les croissances exponentielles du nombre d'ARNm et de protéines indiquent des taux de transcription et de traduction dynamiques proportionnels au volume cellulaire, plutôt qu'au nombre de copies du génome. Cependant, les modèles d'expression génique actuels supposent souvent un taux de transcription constant par gène et un taux de traduction constant par ARNm (modèle à taux constant) 1,5,23,24,25. En supposant un taux de dégradation fini des ARNm et des protéines non dégradables, ces modèles conduisent à un nombre d'ARNm constant proportionnel au nombre de copies du gène et à une croissance linéaire du nombre de protéines 26,27,28, incompatible avec la proportionnalité de l'ARNm et du nombre de protéines à la volume cellulaire en croissance exponentielle.

Étant donné que le volume cellulaire, le nombre de copies de protéines et le nombre de copies d'ARNm croissent de façon exponentielle tout au long du cycle cellulaire, on peut s'attendre à ce qu'une condition suffisante pour atteindre une concentration constante soit de les laisser croître avec le même taux de croissance exponentiel. Cependant, l'analyse mathématique suggère que cela est insuffisant. Considérons le logarithme de la concentration en protéines c, qui peut s'écrire ln(c) = ln(p) − ln(V). Ici p est le nombre de protéines et V est le volume de la cellule. Si l'on suppose que le nombre de protéines et le volume cellulaire croissent de manière exponentielle mais indépendamment, avec des taux de croissance exponentiels dépendant du temps ??p(t) et ??v(t) respectivement, la dérivée temporelle du logarithme de concentration obéit alors ln(c)/dt

??p(t) − ??v(t). Même lorsque les taux de croissance moyennés dans le temps du nombre de protéines et du volume cellulaire sont égaux, (langle angle = langle angle) , toute fluctuation de la différence entre eux s'accumulera et conduira à un comportement de marche aléatoire du logarithme de concentration. L'homéostasie des concentrations de protéines et d'ARNm implique qu'il doit y avoir un mécanisme de régulation en place pour empêcher l'accumulation de bruit au fil du temps.

L'objectif principal de ce travail est d'identifier un tel mécanisme en développant un modèle à gros grains prenant en compte explicitement la croissance du volume cellulaire. En particulier, nous ne considérons que les cellules en prolifération continue et ne prenons pas en compte les cellules non en croissance, par exemple les cellules bactériennes en phase stationnaire 29 . L'ubiquité de l'homéostasie suggère que la machinerie globale de l'expression des gènes, les ARN polymérases (RNAP) et les ribosomes, devrait jouer un rôle central dans le modèle. Sur la base de l'hypothèse que le nombre de ribosomes est le facteur limitant de la traduction, nous constatons que la croissance exponentielle du volume cellulaire et du nombre de protéines provient de la nature auto-catalytique des ribosomes 30,31,32,33. Le fait que les ribosomes fabriquent toutes les protéines garantit que les concentrations en protéines ne divergent pas. Partant de l'hypothèse que le nombre d'ARNm est le facteur limitant de la transcription, nous constatons que le nombre d'ARNm croît également de façon exponentielle et que la concentration d'ARNm est indépendante du nombre de copies du génome en raison de la compétition entre les gènes pour cette ressource globale 18,19, 20 . Nous étudions également les effets de la réplication du génome. En raison du calendrier hétérogène de la réplication des gènes, le taux de transcription d'un gène dépend du cycle cellulaire. Dans notre modèle, il double immédiatement après la réplication du gène et diminue progressivement au fur et à mesure que d'autres gènes sont répliqués. Néanmoins, nous constatons que cela conduit à un petit effet sur les niveaux de protéines. Enfin, nous étendons notre modèle à des situations plus générales dans lesquelles un excès de RNAP (ribosome) conduit à la saturation de l'ADN (ARNm). Nous proposons un diagramme de phase de l'expression des gènes et de la croissance cellulaire contrôlé par le rapport protéine/ADN. Nous prédisons une transition d'une croissance exponentielle à une croissance linéaire du volume cellulaire lorsque le rapport protéine/ADN dépasse un seuil.


Vous avez vraiment besoin de comprendre comment les vaccins à ARNm sont conçus et exécutés : vous n'allez pas l'aimer

Mais d'abord, pouvons-nous nous mettre d'accord sur la définition du « vaccin ? » Supposons que nous parlons d'un vaccin traditionnel tout à fait légitime, qui existe depuis des années et qui est sûr et efficace. Au fond, qu'est-ce que c'est ? Pouvons-nous convenir qu'un vaccin est une substance fabriquée à partir d'une version affaiblie ou morte de l'agent pathogène qui est introduite dans la circulation sanguine pour induire une réponse immunitaire ?

Alors maintenant, comprenez ceci : les vaccins à ARNm "ne sont pas des vaccins" Non. Ce dont nous parlons ici, c'est de la biotechnologie et de la bio-ingénierie. Bref, c'est une modification génétique. Imaginez l'exubérance des pharmas lucifériennes financées par Gates, sans parler de Gates lui-même, dans leur quête d'être Dieu.

Alors, comment ça marche? Lorsque les cellules se divisent, les brins d'ADN sont répliqués et l'ARN messager (ARNm) joue un rôle vital dans les processus connus sous le nom de transcription et traduction. Renseignez-vous ICI. Cette chose que Moderna/Pfizer/Gates ont mis au point est un brin synthétique d'ARNm, qui pénètre la membrane des cellules humaines saines et détourne le processus normal de réplication. La cellule humaine auparavant saine sera maintenant transformée pour produire un fragment du virus réel, la soi-disant «protéine de pointe». Cette molécule sera reconnue comme un agent pathogène, provoquant une réponse immunitaire.

La cellule humaine auparavant saine sera maintenant transformée pour produire un fragment du virus réel. Vous avez bien lu. Ce qui suit est tiré du premier paragraphe de l'entrée wiki sur cette technologie :

Un Vaccin à ARN ou Vaccin à ARNm (ARN messager) est un nouveau type de vaccin qui transfecte des molécules d'ARN synthétique dans des cellules humaines. Une fois à l'intérieur des cellules, l'ARN fonctionne comme un ARNm, reprogrammant les cellules pour fabriquer la protéine étrangère qui serait normalement produite par l'agent pathogène (par exemple un virus). Ces molécules protéiques stimulent ensuite une réponse immunitaire adaptative qui apprend au corps à détruire tout agent pathogène La molécule d'ARNm est recouverte d'un véhicule d'administration de médicament, généralement des nanoparticules lipidiques pégylées, [2] pour protéger les brins d'ARNm fragiles et faciliter leur absorption dans les cellules humaines. [3] [4]

« On sait peu de choses sur les effets secondaires à moyen et à long terme [8]

Si vous allez sur le wiki ICI et cliquez sur Afficher l'historique en haut de la page, puis faites défiler vers le bas et cliquez sur Le plus ancien, que cet article a été créé pour la première fois le 17 février 2020. Comme c'est frais. Vous noterez également que pas plus tard qu'en janvier 2020, cette technologie n'était même pas encore considérée comme expérimentale. Il a été jugé théorique. Wow.

Tant de questions. La foule bio végétalienne sans OGM boycottera-t-elle cette biotechnologie, qui transforme efficacement chaque humain qui la prend en un OGM ambulant ? Je déteste quand la logique entrave les décisions en matière de soins de santé. Que se passe-t-il si la ruée vers la vitesse de la chaîne pour peaufiner la biotechnologie entraîne une légère interruption du séquençage de l'ARNm ? Je continue de penser au pauvre Jeff Goldblum dans La mouche.

Je continue également à penser à toutes les décennies infructueuses à essayer de développer un vaccin contre le coronavirus, avec d'innombrables souris, chats et enfants qui sont morts au cours des essais. Vous ne le saviez pas ? Oui, le problème est que ces "vaccins" ont tendance à augmenter l'absorption de l'agent pathogène. Cet effet est appelé rehaussement dépendant des anticorps (ADE), et j'ai posté une longue explication annotée de ce problème ICI. En fin de compte, c'est la raison pour laquelle il n'y a jamais eu de vaccin contre le coronavirus. Mais d'une manière ou d'une autre ils en ont trouvé un en dix mois ?

Qu'en est-il de la grossesse, de l'allaitement et de la fertilité à long terme des mamans génétiquement modifiées ? Ohhh, ils ne veulent pas y aller. Vous voulez savoir comment la biotechnologie de l'ARNm peut interférer avec un bébé en développement, un bébé allaité ou les chances d'une mère de retomber enceinte ? Dommage, car ils ont volontairement évité d'essayer tout cela, même pas chez la souris. Pas besoin de faire disparaître la preuve si aucune preuve n'a été produite. Ensuite, lorsque Pfizer a obtenu l'approbation du Royaume-Uni, ils ont publié DIX PAGES d'explications, d'avertissements, de clauses de non-responsabilité, etc. ICI

Bill Gates est sur une vidéo expliquant qu'il veut réduire la population mondiale de 90%, mais je suis le cinglé pour suggérer qu'un vaccin qui fonctionne via la génétique synthétique pourrait présenter des risques pour la fertilité. Ouais.


Résultats

Détection de molécules d'ARNm individuelles

Pour observer directement des événements aléatoires d'activation et d'inactivation de gènes, nous avons mesuré les variations de cellule à cellule du nombre de molécules d'un ARNm spécifique. Nous y sommes parvenus en intégrant un gène rapporteur possédant un réseau en tandem de sites de liaison de sondes dans des cellules de mammifères et en utilisant des sondes marquées par fluorescence pour visualiser l'ARNm transcrit à partir du gène par FISH. Pour obtenir la sensibilité d'une seule molécule, nous avons introduit 32 copies en tandem d'une séquence de liaison de sonde de 43 paires de bases à l'extrémité 3' d'une séquence codante pour une protéine fluorescente (tout au long de cet article, nous appelons ce tableau de séquences M1). La construction a été insérée dans des cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO) par électroporation, et une lignée cellulaire stable a été isolée dans laquelle une seule copie du gène a été intégrée dans le génome des cellules. Ces cellules ont ensuite été fixées et soumises à une hybridation avec une sonde oligodésoxyribonucléotidique simple brin qui était à la fois complémentaire des séquences répétées en tandem et marquée avec cinq fragments fluorophores bien dispersés (figure 1A). La liaison de tant de fluorophores à chaque molécule d'ARNm individuelle a entraîné des signaux si brillants que chaque molécule était détectable en tant que tache limitée par diffraction dans un microscope à fluorescence grand champ conventionnel (figure 1B). Pour compter le nombre total de molécules d'ARNm dans chaque cellule, des tranches optiques couvrant tout le volume cellulaire tridimensionnel ont été acquises (Vidéo S1). Le nombre de molécules d'ARNm dans chaque cellule a ensuite été mesuré à l'aide d'un logiciel personnalisé pour identifier les spots fluorescents individuels en trois dimensions à partir des piles d'images (figure 1C). Nous avons montré précédemment que chaque spot correspond à une molécule d'ARNm individuelle et qu'il n'y a pas de perte significative de molécules d'ARNm au cours de la procédure FISH [25], établissant ainsi que la méthode est un moyen valable pour compter le nombre de molécules d'ARNm dans des cellules individuelles .

(A) Schéma illustrant la méthode de détection de l'ARNm. De multiples sondes fluorescentes se lient à chaque molécule d'ARNm, produisant un signal lumineux et localisé.

(B) Image fusionnée d'une pile tridimensionnelle d'images d'une cellule CHO exprimant le gène 7x-tetO représenté en (A), où chaque ARNm est hybridé à des sondes FISH qui se lient à la séquence de liaison de sonde multimère dans son 3' -UTR (sonde P1-TMR se liant au multimère M1). Chaque spot correspond à une seule molécule d'ARNm.

(C) Identification des taches dans la pile d'images tridimensionnelles en (C). Chaque particule trouvée par l'algorithme d'analyse d'image est colorée différemment, montrant que l'algorithme est précis et que les molécules individuelles sont identifiées de manière unique. Les barres d'échelle mesurent 5 µm de long.

Mesure des variations de cellule à cellule dans les cellules clonales

Pour mesurer les variations de cellule à cellule du nombre d'ARNm dans les lignées cellulaires clonales, nous avons généré des lignées cellulaires CHO stables exprimant notre construction. Le gène a été placé sous le contrôle d'un promoteur dont l'expression pouvait être contrôlée dans les cellules de mammifères (figure 2A), et il a été intégré de manière stable dans le génome par électroporation, entraînant l'introduction d'une seule copie du gène (comme vérifié par Southern effacement des données non publiées). L'observation de l'ARNm synthétisé dans ces cellules a montré qu'il y avait des variations marquées du nombre de molécules d'ARNm d'une cellule à l'autre (figure 2B). Les zones lumineuses occasionnelles plus grandes qui ont été observées sont des sites de transcription récemment activés [25,26] causés par une accumulation d'ARNm naissant qui n'avait pas encore diffusé. L'observation que ces sites se produisent rarement indique que l'ARNm n'est pas continuellement synthétisé, mais qu'il est plutôt synthétisé pendant de brèves périodes de temps lorsque le gène est transcriptionnellement actif. Nous appelons ces périodes des sursauts transcriptionnels. Le reste du temps, le gène est dans un état transcriptionnellement inactif, durant lequel aucune molécule d'ARNm n'est synthétisée et celles synthétisées plus tôt sont dégradées.

(A) Diagramme schématique des promoteurs contrôlables par la doxycycline et des gènes rapporteurs qu'ils contrôlent. La doxycycline se lie à la protéine tTA, l'empêchant ainsi de se lier à la tet opérateur.

(B, C) Champs représentatifs de cellules des lignées cellulaires E-YFP-M1-1x et E-YFP-M1-7x, contenant respectivement les promoteurs 1x-tetO et 7x-tetO, où chaque ARNm est hybridé à la sonde FISH P1 -TMR et l'image a été obtenue en fusionnant une pile tridimensionnelle d'images.

(D) Deux cellules sœurs de la lignée cellulaire E-YFP-M1-7x affichant un ARNm hybridé à la sonde FISH P1-TMR (rouge) et co-colorée avec DAPI (bleu). L'image représente un plan focal. Les barres d'échelle mesurent 5 µm de long.

La preuve quantitative de la nature de type burst de la transcription provient de la comparaison du nombre d'ARNm dans les cellules contenant des sites de transcription actifs à ceux sans sites de transcription actifs. Nous avons constaté que sur 97 cellules sélectionnées au hasard dans la lignée cellulaire E-YFP-M1-7x (détails de la construction discutés ci-dessous), les 23 foyers de transcription contenant une moyenne de 244 ARNm par cellule, contre 33 ARNm par cellule dans les 74 sans site de transcription actif (p < 10 -4 ). Étant donné que la méthode FISH donne également la localisation spatiale de l'ARNm, nous avons également pu comparer les nombres relatifs d'ARNm dans le noyau et le cytoplasme pour étudier plus avant le comportement des salves transcriptionnelles. Si la transcription se produit par rafales, on s'attendrait à trouver plus d'ARNm dans le noyau que dans le cytoplasme lorsque le gène est actif, car l'ARNm nucléaire n'a pas été exporté. Cependant, lorsque le gène est à l'état inactif, l'ARNm nucléaire sera exporté sans être reconstitué, ce qui entraînera une plus faible proportion de l'ARNm cellulaire total se trouvant dans le noyau. Pour examiner un tel comportement, nous avons co-coloré les cellules avec du DAPI après l'hybridation et déterminé si chaque ARNm était situé dans le cytoplasme ou le noyau. Souvent, nous avons constaté que les cellules sans foyer transcriptionnel n'avaient que de l'ARNm cytoplasmique, alors que les cellules avec un site de transcription avaient généralement un grand nombre d'ARNm nucléaire (figure 2D). Statistiquement parlant, les cellules contenant des sites de transcription actifs avaient un pourcentage plus élevé d'ARNm rapporteur dans le noyau (35%, 17 cellules analysées) que les cellules sans sites de transcription actifs (25%, 22 cellules analysées) (p = 0,0093). Fait intéressant, les deux cellules représentées sur la figure 2D sont clairement issues de la même cellule mère mais semblent afficher un comportement transcriptionnel différent. Ce comportement est typique et indique que les variations globales des facteurs extrinsèques telles que la position dans le cycle cellulaire ne sont pas la principale source de variation de l'activité du transgène ceci est plus systématiquement analysé dans les « Contributions relatives des facteurs intrinsèques et extrinsèques aux variations de l'ARNm Niveau » des résultats.

Une autre preuve des salves transcriptionnelles provient d'une analyse des statistiques de la distribution des molécules d'ARNm par cellule sur l'ensemble de la population cellulaire. Si l'ARNm était produit à un taux constant, on s'attendrait à une distribution de Poisson de l'ARNm par cellule, auquel cas le nombre moyen de molécules d'ARNm par cellule et la variance (le carré de l'écart type) seraient égaux. Cependant, nous avons constaté que la moyenne était d'environ 40 molécules d'ARNm par cellule, tandis que la variance était d'environ 1 600 molécules au carré, ce qui indique que l'ARNm n'est pas synthétisé à un rythme constant, ce qui correspond à l'apparition de bouffées transcriptionnelles.

Mécanismes contrôlant les salves transcriptionnelles

Pour étudier les mécanismes contrôlant les sursauts transcriptionnels, nous avons modifié le niveau global de transcription à la fois en modifiant la quantité d'activateur transcriptionnel présent dans les cellules et en modifiant le nombre de sites de liaison pour cet activateur dans le promoteur. Pour ce faire, le gène a été inséré en aval d'un promoteur minimal du cytomégalovirus, et soit une ou sept copies de la souche sensible à la tétracycline tet séquence opérateur étaient présents en amont du promoteur (figure 2A). La transcription à partir du promoteur n'est possible que lorsqu'une protéine connue sous le nom de tet-transactivateur (tTA) se lie à la séquence opérateur. tTA est une protéine constituée de deux domaines : un qui se lie au tet (dérivé de la protéine TetR), et un qui favorise la transcription des gènes voisins (le domaine d'activation acide VP16). L'antibiotique de type tétracycline, la doxycycline, se lie au domaine de liaison à l'ADN du tTA, l'empêchant de se lier à l'ADN. En faisant varier le taux de doxycycline dans le milieu de croissance, nous avons pu contrôler le taux de tTA libre dans les cellules [27].

Deux constructions (1x-tetO et 7x-tetO) ont été intégrées de manière stable dans des cellules CHO qui avaient été précédemment modifiées pour exprimer tTA, résultant en les lignées cellulaires E-YFP-M1-1x et E-YFP-M1-7x, chacune contenant un copie unique du gène rapporteur respectif. Des instantanés représentatifs des champs de cellules clonales sont illustrés aux figures 2B et 2C. Nous avons observé que la taille des rafales était plus grande dans la lignée cellulaire E-YFP-M1-7x que dans la lignée cellulaire E-YFP-M1-1x. Nous avons ensuite fait varier la quantité de doxycycline dans le milieu de croissance et mesuré la distribution du nombre de molécules d'ARNm par cellule sur plusieurs champs de cellules cultivées à chaque concentration de doxycycline (figure 3A nombre d'ARNm donné dans le tableau S1). Comme prévu, l'augmentation du niveau de doxycycline a entraîné une diminution du nombre moyen de molécules d'ARNm par cellule (figure 3B, en haut). Cependant, nous avons également constaté que la variabilité à travers la population (mesurée quantitativement par le « bruit », que nous définissons comme l'écart type divisé par la moyenne) restait constante pour toutes les concentrations de doxycycline pour la construction 1x-tetO mais variait de manière non monotone pour la 7x -tetO construction (figure 3B, en bas). De plus, nous avons constaté que les propriétés du bruit ne changent pas si l'on considère la concentration d'ARNm plutôt que le nombre absolu (figure S2, comparer avec la figure 3B, en bas). Ceci est très probablement dû au fait que la principale source de variation est l'état d'activation du gène lui-même, qui ne varie pas avec le volume de la cellule.

(A) Histogrammes montrant la distribution des molécules d'ARNm par cellule pour trois concentrations de doxycycline pour les deux lignées cellulaires E-YFP-M1-1x (à gauche) et E-YFP-M1-7x (à droite).

(B) Graphiques montrant la moyenne de la population (en haut) et le bruit (défini comme l'écart type divisé par la moyenne [en bas]) en fonction de la concentration de doxycycline. Les statistiques ont été tirées des comptes d'ARNm utilisés dans (A) et les barres d'erreur ont été obtenues par bootstrap.

(C) Taux d'activation (λ/δ) et nombre moyen de molécules d'ARNm produites par rafale (μ/γ) pour 1x-tetO (bleu) et 7x-tetO (rouge) obtenus en ajustant les données de comptage d'ARNm au modèle de gène activation et inactivation par la méthode du maximum de vraisemblance. Les barres d'erreur reflètent les intervalles de confiance à 95 %.

Les deux résultats sont incompatibles avec les modèles stochastiques conventionnels d'expression génique [3,5,15,28] qui prédisent que le bruit devrait augmenter régulièrement à mesure que le niveau moyen de transcription diminue. Pour expliquer ce comportement, nous avons invoqué un modèle d'activation et d'inactivation génique [29] dans lequel le gène subit des transitions peu fréquentes entre un état transcriptionnellement actif, au cours duquel de nombreuses molécules d'ARNm sont produites, et un état transcriptionnellement inactif, dans lequel aucune molécule d'ARNm n'est produit (le modèle est analysé plus en détail dans le protocole S1, où une formule complète pour la distribution de l'ARNm est présentée). En utilisant une évaluation numérique rapide des distributions théoriques résultant de ce modèle, nous avons pu ajuster les données obtenues expérimentalement pour trouver des expressions pour le taux d'activation des gènes, (à un facteur près du taux de dégradation de l'ARNm, δ), et la moyenne nombre d'ARNm produits au cours de chaque rafale, /γ (ci-après dénommé la taille de rafale moyenne) (figure 3C). La demi-vie de l'ARNm a été déterminée par RT-PCR quantitative à environ 4 ± 1 h (figure S1 voir Matériels et méthodes pour une discussion plus approfondie). Les résultats de la procédure d'ajustement montrent que soit l'augmentation du nombre de sites de liaison aux facteurs de transcription, soit l'augmentation de la quantité de facteurs de transcription intracellulaires augmente la taille moyenne des rafales. Sur la base de notre analyse, il est impossible de dire si cela est dû à une diminution du taux d'inactivation du gène ou à une augmentation du taux de transcription du gène activé. Ce fait indique cependant une différence importante avec le cas bactérien, où l'activation et l'inactivation des gènes ont généralement été associées à l'association et à la dissociation des facteurs de transcription [4]. Si tel était le cas, la diminution de la quantité de facteurs de transcription servirait à diminuer le taux d'activation tout en laissant les taux d'inactivation et de transcription identiques. Dans nos données, le taux d'activation des gènes semble être assez constant jusqu'à ce que la concentration en doxycycline atteigne un niveau relativement élevé, auquel cas elle augmente, ce qui plaide contre l'application du modèle bactérien à notre système. On ne sait pas pourquoi le taux d'activation des gènes augmente aux concentrations plus élevées de doxycycline, car la diminution du niveau de facteurs de transcription ne devrait que diminuer le taux d'activation des gènes. Cela pourrait être dû à des facteurs non inclus dans notre modèle, ou à un comportement physique de la cellule induit à des concentrations plus élevées de doxycycline. Cependant, nos données indiquent généralement que la modulation de la concentration d'activateurs transcriptionnels affecte le niveau global de transcription en modifiant la taille moyenne des rafales plutôt que sa fréquence.

Contributions relatives des facteurs intrinsèques et extrinsèques aux variations du niveau d'ARNm

Si la variation des niveaux d'expression d'une cellule à l'autre était vraiment due à des événements aléatoires d'activation du gène, alors la présence de plusieurs copies s'activant indépendamment du gène entraînerait une moindre variabilité de cellule à cellule du nombre d'ARNm (c'est-à-dire que le bruit devrait diminuer). Intuitivement, cela peut être vu en considérant des lancers de pièces simultanés : si une seule pièce est lancée, c'est soit pile soit face, mais si plusieurs pièces sont lancées à la fois, les chances que l'ensemble soit proche de 50 % face et 50 Le % de queues augmente avec le nombre de pièces utilisées. Pour tester cette possibilité, nous avons intégré plusieurs copies de notre gène rapporteur dans une région du génome via une transfection cationique à base de lipides (lipofection), qui intègre simultanément des dizaines à des centaines de copies de gènes, souvent en tandem et au même locus, et isolées lignée cellulaire L-GFP-M1-7x. Généralement, le nombre d'ARNm produits dans cette lignée cellulaire était beaucoup plus important que dans E-YFP-M1-7x (avec une seule copie du gène rapporteur), mais la lignée cellulaire présentait toujours des variations massives de cellule à cellule (figure 4A ) avec une distribution nettement asymétrique (Figure 4B). Statistiquement, cela est démontré par le fait que les caractéristiques de bruit de ces deux lignées cellulaires étaient similaires puisque le nombre moyen de molécules d'ARNm par cellule a augmenté d'environ 10 fois (sans doxycycline) par rapport à la lignée cellulaire E-YFP-M1-7x , on s'attendrait à ce que le bruit diminue d'un facteur √ 10 3 si les gènes s'exprimaient indépendamment, mais aucune diminution de ce type n'a été observée (figure 4C à comparer à la figure 3B).

(A) Champ représentatif de la lignée cellulaire L-GFP-M1-7x, généré par lipofection, où l'ARNm a été hybridé à la sonde FISH P1-TMR, l'image a été obtenue en fusionnant une pile d'images en trois dimensions.

(B) Histogramme montrant la distribution des molécules d'ARNm par cellule pour la lignée cellulaire L-GFP-M1-7x lorsqu'elle est cultivée dans un milieu ne contenant pas de doxycycline.

(C) Graphiques montrant la moyenne de la population (en haut) et le bruit (défini comme l'écart type divisé par la moyenne [en bas]) en fonction de la concentration de doxycycline. Les barres d'erreur ont été obtenues par bootstrap.

Il y a deux explications alternatives à cette observation. Une possibilité est que les fluctuations massives observées dans le nombre de molécules d'ARNm par cellule soient dues à des fluctuations de facteurs globaux qui affectent simultanément l'expression de tous les gènes rapporteurs (par exemple, les fluctuations des niveaux de tTA ou d'ARN polymérase II). généralement appelé bruit extrinsèque [3,15]. Alternativement, étant donné que les gènes ont été intégrés dans le même locus génomique, il est possible que les gènes s'expriment de manière coordonnée en réponse à un événement d'activation génique local aléatoire (tel que la décondensation de la chromatine) qui affecte tous les gènes à proximité [1]. Cependant, si des événements d'activation de gènes locaux se produisent au hasard, les gènes situés sur des sites distants s'activeraient et se désactiveraient indépendamment. Ce type de bruit, dû à l'occurrence aléatoire d'événements impliqués dans l'expression des gènes, est généralement appelé bruit intrinsèque et ne dépend pas de facteurs globaux.

Pour explorer ces deux explications alternatives, nous avons construit un autre gène rapporteur, CFP-M2, qui codait pour une protéine fluorescente cyan et contenait un réseau en tandem différent de séquences de liaison de sonde dans son 3'-UTR, noté M2. Cela a permis de distinguer son ARNm de l'ARNm synthétisé à partir de gènes rapporteurs contenant la matrice de séquences M1 en effectuant une FISH avec une sonde supplémentaire qui se lie à la matrice M2 mais est conjuguée à un fluorophore de couleur différente. Dans une série d'expériences, ce gène a été intégré dans une lignée cellulaire (L-GFP-M1-7x) qui exprimait déjà un gène rapporteur contenant la puce M1, ce qui a entraîné l'intégration du gène rapporteur CFP-M2 dans un locus éloigné du site d'intégration de GFP-M1 (Figure 5A, à gauche). Dans une deuxième série d'expériences, les deux gènes rapporteurs ont été intégrés simultanément par lipofection, ce qui a entraîné l'intégration des deux gènes au même locus (figure 5A, à droite). Si les variations de l'expression de l'ARNm dans chaque cellule étaient dues à des facteurs globaux, des explosions de synthèse d'ARNm à partir de ces gènes distincts se produiraient probablement simultanément dans la même cellule, quelle que soit leur localisation génomique (c'est-à-dire que les deux lignées cellulaires montreraient une forte corrélation entre l'expression des deux ARNm rapporteurs). Cependant, si l'expression des gènes est contrôlée par des événements d'activation des gènes locaux affectant indépendamment des loci individuels, la première lignée cellulaire, dans laquelle les gènes rapporteurs distincts sont intégrés à des loci différents, ne montrerait aucune corrélation dans l'expression des gènes, mais la deuxième lignée cellulaire, dans laquelle les gènes rapporteurs distincts sont intégrés au même locus, montrerait une forte corrélation dans l'expression des gènes.

(A) Schéma illustrant des expériences d'intégration à double rapporteur, où les deux rapporteurs sont soit intégrés à des emplacements séparés dans le génome (à gauche) soit au même locus (à droite).

(B) Superposition bicolore montrant une pile tridimensionnelle fusionnée d'images de la lignée cellulaire dans laquelle deux gènes rapporteurs différents (l'un exprimant l'ARNm contenant la matrice de séquence M1 et l'autre exprimant l'ARNm contenant la matrice de séquence M2) sont intégrés dans des loci (lignée cellulaire L-GFP-M1-7x+L-CFP-M2-7x) le vert correspond au signal de l'ARNm de la GFP-M1 et le rouge correspond au signal de l'ARNm de la CFP-M2 (en utilisant les sondes P1-TMR et P2- Alexa-594, respectivement). Les niveaux relatifs d'ARNm des deux gènes ont été quantifiés en comptant l'ARNm de chaque couleur dans une seule tranche optique dans chaque cellule (encart).

(C) Superposition bicolore montrant une pile tridimensionnelle fusionnée d'images de la lignée cellulaire dans laquelle les deux gènes rapporteurs distincts sont intégrés dans le même locus (lignée cellulaire L-YFP-M1-CFP-M2), où le même Des sondes FISH ont été utilisées comme en (B). Les niveaux relatifs d'ARNm des deux gènes ont été quantifiés en comptant l'ARNm de chaque couleur dans une seule tranche optique dans chaque cellule (encart). Les barres d'échelle mesurent 5 µm de long.

Lorsqu'ils sont intégrés à des loci séparés (comme en témoigne la présence de deux sites de transcription distincts), les deux ARNm rapporteurs affichent chacun individuellement les grandes fluctuations observées précédemment (figure 5B), mais l'occurrence de ces fluctuations n'était pas du tout corrélée les unes aux autres (R = 0.056, p = 0,57) (Figure 5B, encadré). Cependant, lorsque les deux gènes ont été intégrés au même locus (comme en témoigne un seul site de transcription bicolore Vidéo S2), les gènes ont produit les deux types d'ARNm en rafales simultanées (figure 5C et encart R = 0.89, p = 1,2 × 10 −38 ). Pris ensemble, les résultats de ces expériences montrent que des événements d'activation et d'inactivation de gènes peu fréquents contrôlent la variabilité des niveaux d'ARNm, et ces événements se produisent de manière aléatoire et ne dépendent pas de facteurs extrinsèques globaux. De plus, les résultats impliquent que ces événements d'activation de gènes sont étendus spatialement, en ce sens qu'ils affectent des régions entières du génome à la fois.

Variations de cellule à cellule dans l'ARNm codant pour la grande sous-unité de l'ARN polymérase II

Pour examiner plus avant le rôle des facteurs extrinsèques globaux, nous avons vérifié les fluctuations d'un facteur extrinsèque putatif, l'ARN polymérase II, pour voir si le niveau d'expression de son ARNm était en corrélation avec le niveau d'expression de l'ARNm d'un gène rapporteur. Nous avons pu imager des molécules individuelles de l'ARNm naturel codant pour la grande sous-unité de l'ARN polymérase II en exploitant la présence d'une séquence naturelle de 21 nucléotides qui se répète 52 fois dans l'ARNm. Nous avons utilisé une sonde FISH pour la séquence répétée qui a été marquée avec un fluorophore de couleur distinctive, et nous avons compté des taches fluorescentes similaires à celles observées précédemment (figure 6A). Nous avons constaté que cet ARNm présentait également des rafales de synthèse d'ARNm et que sa distribution dans un champ de cellules était similaire à celles observées pour les gènes rapporteurs, avec une variance supérieure à 50 fois la moyenne (figure 6B, en haut). Pour vérifier une corrélation entre le niveau de cet ARNm et celui d'un gène rapporteur (dans la lignée cellulaire E-YFP-M1-7x), nous avons également quantifié le niveau d'expression de l'ARNm du gène rapporteur dans les mêmes cellules. Aucune corrélation significative n'a été trouvée (R = 0.083, p = 0,41) (Figure 6B, en bas). En utilisant le modèle d'activation et d'inactivation des gènes, nous avons pu estimer les taux d'activation, d'inactivation et de transcription des gènes jusqu'à un facteur de la demi-vie de l'ARNm (voir la figure 6B pour les valeurs des paramètres et les intervalles de confiance), indiquant que le l'activation était en effet peu fréquente et ressemblait à une rafale. Ces résultats montrent deux choses : (a) la synthèse de l'ARNm à partir de gènes naturels peut également être de type burst et (b) les fluctuations du nombre de molécules d'ARNm codant pour la grande sous-unité de l'ARN polymérase II ne sont pas une source de bruit dans l'expression. d'autres gènes.

(A) Champ représentatif de la lignée cellulaire E-YFP-M1-7x lors de l'exécution de FISH avec des sondes de couleurs différentes pour l'ARNm YFP-M1 et l'ARNm codant pour la grande sous-unité de l'ARN polymérase II. L'image est une superposition bicolore, où le vert correspond au signal de l'ARNm YFP-M1 (une tranche optique) et le rouge correspond au signal de l'ARNm de l'ARN polymérase (pile d'images tridimensionnelles fusionnées). Les sondes utilisées étaient P1-Cy5.5 et P3-TMR.

(B) Histogramme montrant la distribution des molécules d'ARNm d'ARN polymérase par cellule (en haut) et nuage de points (en bas) montrant les niveaux d'ARNm rapporteur (quantifiés en comptant l'ARNm dans une seule tranche optique) et les niveaux d'ARNm d'ARN polymérase (quantifiés en comptant tous les ARNm) dans chaque cellule. L'activation des gènes (λ/δ), l'inactivation (γ/δ) et les taux de transcription (μ/δ) (normalisés par le taux de décroissance de l'ARNm δ) sont donnés avec des intervalles de confiance à 95 % comme indiqué. La barre d'échelle mesure 5 µm de long.

Propagation de la variabilité de l'ARNm aux niveaux de protéines

Pour étudier les effets de la transcription en rafale de l'ARNm sur les niveaux de protéines intracellulaires, nous avons simultanément quantifié le nombre d'ARNm et les protéines fluorescentes qu'ils codaient dans des cellules individuelles. Pour évaluer les effets du taux de dégradation des protéines sur la variabilité des protéines, nous avons effectué cette analyse sur une lignée cellulaire exprimant une protéine fluorescente qui était activement dégradée et une autre lignée cellulaire exprimant une protéine fluorescente sans dégradation active.

Pour le cas de la dégradation active, nous avons utilisé une lignée cellulaire exprimant de manière stable le gène rapporteur GFP-M1, qui a codé une protéine fluorescente verte (GFP) qui avait été marquée à l'extrémité C-terminale avec une courte séquence d'acides aminés riche en proline, glutamique acide, sérine et thréonine (d2EGFP) qui cible la protéine pour une dégradation active (avec une demi-vie d'environ 2 h) et a examiné les corrélations entre les niveaux d'ARNm et de protéines (figure 7A). Nous avons constaté que les niveaux étaient assez bien corrélés, avec des coefficients de corrélation supérieurs à 0,78 (p < 2,6 × 10 −22 ) sur une gamme de forces transcriptionnelles. De plus, la distribution des niveaux de protéines totales est apparue plutôt similaire à celles de l'ARNm (figure 7A, histogrammes marginaux en haut, ARNm et à droite, protéine).

(A) Diagramme de dispersion des nombres totaux de GFP et d'ARNm dans des cellules individuelles de la lignée cellulaire L-GFP-M1-7x cultivées dans des conditions sans doxycycline (bleu), 0,08 ng/ml de doxycycline (rouge) et 0,16 ng/ml de doxycycline (vert ). Les histogrammes marginaux indiquent la distribution de l'ARNm rapporteur par cellule (en haut) ou de la GFP totale (à droite) pour toutes les conditions de croissance.

(B) Nuage de points des niveaux totaux de CFP et d'ARNm (obtenus à partir d'une seule tranche optique) dans des cellules individuelles de la lignée cellulaire L-GFP-M1-7x + L-CFP-M2-7x cultivées dans des conditions sans doxycycline. Les histogrammes marginaux indiquent la distribution de l'ARNm rapporteur par cellule (en haut) ou de la GFP totale (à droite) pour toutes les conditions de croissance.

(C) Histogramme de YFP total par cellule de la lignée cellulaire E-YFP-M1-7x. YFP a été quantifié dans des cellules vivantes pour minimiser la perte de fluorescence due à la fixation et à la perméabilisation.

(D) Nuages ​​de points et histogrammes marginaux associés montrant les résultats des simulations stochastiques du modèle de dynamique de l'ARNm et des protéines présenté dans le protocole S1. La dynamique de l'ARNm était la même pour tous les cas, mais le taux de dégradation des protéines était augmenté comme indiqué. Les détails des procédures de simulation et les valeurs exactes des paramètres utilisés sont donnés dans la section Matériaux et méthodes.

Pour le cas d'absence de dégradation de protéine active, nous avons utilisé une autre lignée cellulaire, exprimant cette fois le gène rapporteur CFP-M2, dans laquelle la protéine fluorescente ne contenait aucun marqueur de dégradation. Nous avons constaté que la corrélation entre les niveaux d'ARNm et de protéines était significativement plus faible qu'auparavant (R = 0.35, p = 1,9 × 10 -4 ) (figure 7B). De plus, alors que la distribution de l'ARNm était encore fortement asymétrique avec de longues queues, la distribution des protéines était un peu moins asymétrique. Nous avons également examiné la distribution des protéines dans les cellules vivantes de la lignée cellulaire E-YFP-M1-7x, dont le gène rapporteur code également pour une protéine fluorescente qui n'est pas activement dégradée. Dans ce cas, l'intégration en une seule copie a produit trop peu de protéines pour que nous puissions les détecter après la procédure de fixation, nous empêchant de mesurer simultanément les niveaux d'ARNm, mais nous avons constaté que les niveaux de protéines fluorescentes dans les cellules vivantes présentaient également une distribution beaucoup moins asymétrique car par rapport aux protéines activement dégradées (figure 7C).

Pour expliquer les différences dans la distribution des protéines et la corrélation entre les cas activement dégradés et non dégradés, nous avons ajouté la dynamique des protéines au modèle de dynamique de l'ARNm et examiné le comportement de ce modèle à l'aide de l'algorithme de simulation stochastique de Gillespie [30]. (Les paramètres utilisés pour les simulations étaient ceux obtenus à partir de la lignée cellulaire E-YFP-M1-7x dans des conditions sans doxycycline, bien que les caractéristiques qualitatives observées ne dépendent pas fortement des paramètres spécifiques utilisés.) Ces simulations montrent que la diminution du taux de la dégradation des protéines entraîne une forte diminution de la corrélation entre les niveaux d'ARNm et de protéines (figure 7D). En outre, la distribution des protéines est passée d'être fortement asymétrique à une nature plus gaussienne (Figure 7D, histogrammes marginaux de droite), même si la distribution de l'ARNm est restée fortement asymétrique dans tous les cas (Figure 7D, histogramme marginal supérieur). Intuitivement, cela est dû au fait que les protéines avec des taux de dégradation rapide des protéines ne seront abondantes que lorsque l'ARNm qui les code est abondant, ce qui entraîne une corrélation élevée et des distributions similaires. Cependant, si les protéines se dégradent très lentement, alors les protéines des salves transcriptionnelles antérieures peuvent toujours être présentes lorsque de nouvelles bouffées se produisent. Dans ce cas, les salves transcriptionnelles servent simplement à « recharger » occasionnellement la quantité de protéines fluorescentes de temps en temps, ce qui entraîne des distributions moins asymétriques et une corrélation plus faible entre l'ARNm et le nombre de protéines. Qualitativement, ces prédictions correspondent bien à nos observations expérimentales.


Quantification de l'ARNm dans l'espace et le temps

Quantification de l'ARNm dans l'espace et le temps. J Cell Sci 15 mai 2010 123 (10) : e1002. est ce que je:

Figure 1. L'épissage pré-ARNm implique l'élimination précise des introns du transcrit d'ARN primaire. Le processus d'épissage est catalysé par des complexes protéiques appelés spliceosomes qui sont composés de protéines et de molécules d'ARN appelées snRNA. Les spliceosomes reconnaissent les séquences aux extrémités 5 & 3 & 8242 de l'intron.

Les erreurs d'épissage sont impliquées dans les cancers et autres maladies humaines. Quels types de mutations peuvent conduire à des erreurs d'épissage ?

Notez que plus de 70 introns individuels peuvent être présents et que chacun doit subir le processus d'épissage, en plus du coiffage 5' et de l'ajout d'une queue poly-A, juste pour générer une seule molécule d'ARNm traduisible.

Découvrez comment les introns sont supprimés lors de l'épissage de l'ARN sur ce site Web.

Modification de l'ARN dans les trypanosomes

Figure 2. Trypanosoma brucei est l'agent causal de la maladie du sommeil chez l'homme. Les ARNm de cet agent pathogène doivent être modifiés par l'ajout de nucléotides avant que la synthèse des protéines puisse se produire. (crédit : modification d'œuvre par Torsten Ochsenreiter)

Les trypanosomes sont un groupe de protozoaires qui comprend le pathogène Trypanosoma brucei, qui provoque la maladie du sommeil chez l'homme (Figure 2). Les trypanosomes, et pratiquement tous les autres eucaryotes, ont des organites appelées mitochondries qui fournissent à la cellule de l'énergie chimique. Les mitochondries sont des organites qui expriment leur propre ADN et seraient les vestiges d'une relation symbiotique entre un eucaryote et un procaryote englouti. L'ADN mitochondrial des trypanosomes présente une exception intéressante au dogme central : leurs pré-ARNm n'ont pas les informations correctes pour spécifier une protéine fonctionnelle. Habituellement, cela est dû au fait qu'il manque plusieurs nucléotides U à l'ARNm. La cellule effectue une étape supplémentaire de traitement de l'ARN appelée édition de l'ARN pour y remédier.

D'autres gènes du génome mitochondrial codent pour des ARN guides de 40 à 80 nucléotides. Une ou plusieurs de ces molécules interagissent par appariement de bases complémentaires avec certains des nucléotides du transcrit pré-ARNm. Cependant, l'ARN guide a plus de nucléotides A que le pré-ARNm n'a de nucléotides U avec lesquels se lier. Dans ces régions, l'ARN guide se boucle. Les extrémités 3' des ARN guides ont une longue queue poly-U, et ces bases U sont insérées dans les régions du transcrit pré-ARNm au niveau desquelles les ARN guides sont bouclés. Ce processus est entièrement médié par des molécules d'ARN. C'est-à-dire que les ARN guides, plutôt que les protéines, servent de catalyseurs dans l'édition de l'ARN.

L'édition d'ARN n'est pas seulement un phénomène des trypanosomes. Dans les mitochondries de certaines plantes, presque tous les pré-ARNm sont édités. L'édition d'ARN a également été identifiée chez des mammifères tels que des rats, des lapins et même des humains. Quelle pourrait être la raison évolutive de cette étape supplémentaire dans le traitement du pré-ARNm ? Une possibilité est que les mitochondries, étant des vestiges d'anciens procaryotes, aient une méthode tout aussi ancienne basée sur l'ARN pour réguler l'expression des gènes. À l'appui de cette hypothèse, les modifications apportées aux pré-ARNm diffèrent selon les conditions cellulaires. Bien que spéculatif, le processus d'édition de l'ARN peut être un vestige d'une époque primordiale où les molécules d'ARN, au lieu de protéines, étaient responsables de la catalyse des réactions.


Renseignements à l'appui

Graphique S1. Détermination du taux de dégradation de l'ARNm rapporteur

Le tracé montre la différence de cycle de seuil entre les PCR effectuées sur le gène rapporteur GFP et le ménage EF1 à partir d'une expérience de RT-PCR en temps réel réalisée sur l'ARNm total extrait de la lignée cellulaire L-GFP-M1-7x. Au temps 0, le milieu cellulaire a été remplacé par un milieu contenant 10 ng/ml de doxycycline, arrêtant efficacement la transcription du gène rapporteur, permettant ainsi de déterminer le temps de dégradation de l'ARNm. Pour déterminer la demi-vie, nous n'avons pris en compte que les trois points les plus à droite, car les premiers moments peuvent afficher une dégradation non de premier ordre en raison des effets transitoires du traitement et de l'exportation de l'ARNm.

Graphique S2. Effets du volume cellulaire sur le bruit de l'ARNm

Le tracé montre le bruit (défini comme l'écart type divisé par la moyenne) des concentrations d'ARNm pour la construction 1x-tetO (rouge) et la construction 7x-tetO (bleu) sur une plage de concentrations de doxycycline. La concentration d'ARNm a été déterminée en divisant le nombre d'ARNm par le volume total de la cellule, tel que déterminé par microscopie. Comparer à la figure 3B, en bas.

Graphique S3. Corrélation linéaire utilisée pour fournir des estimations précises du nombre de molécules d'ARNm dans les cellules à forte expression rencontrées lors de l'analyse des niveaux d'ARNm dans la lignée cellulaire L-GFP-M1-7x

Le tracé montre la corrélation entre le nombre de molécules d'ARNm et la fluorescence totale intégrée sur le volume cellulaire (fond soustrait). Les cellules ont été prélevées dans des champs aléatoires de la lignée cellulaire L-GFP-M1-7x et les cellules ont été choisies à la fois pour des niveaux raisonnables d'ARNm pour permettre la segmentation et pour le manque de caractéristiques hautement fluorescentes qui pourraient potentiellement influencer l'étalonnage. L'ajustement linéaire a indiqué une valeur d'environ 53 500 unités de fluorescence par molécule d'ARNm.

Protocole S1. Modèle d'activation et d'inactivation des gènes, estimation des paramètres et comparaison avec des études antérieures

Modèle mécanistique des sursauts dans la synthèse d'ARNm, modèle de base de l'activation et de l'inactivation des gènes, ajustement des paramètres aux distributions expérimentales, détermination de la moyenne et des variances des protéines, et relation entre le modèle et les études précédentes du bruit intrinsèque par rapport au bruit extrinsèque.

Tableau S1. Nombre d'ARNm Reporter (YFP-M1) par cellule utilisés dans l'étude à partir des lignées cellulaires E-YFP-M1-1x et E-YFP-M1-7x, et nombre d'ARNm de grande sous-unité RNAPII dans la lignée cellulaire E-YFP-M1- 7x

Vidéo S1. Survol en trois dimensions d'une paire de cellules sœurs récemment divisées de la lignée cellulaire E-YFP-M1-7x

Chaque tache blanche représente une molécule d'ARNm. La tache blanche dense dans l'une des cellules est un site de transcription actif.

Vidéo S2. Survol en trois dimensions d'une paire de cellules sœurs récemment divisées de la lignée cellulaire possédant deux gènes rapporteurs intégrés dans le même locus (L-YFP-M1-CFP-M2)

Le vert correspond au signal de l'ARNm de YFP-M1 et le rouge correspond au signal de l'ARNm de CFP-M2. La tache jaune dense dans les deux cellules est un site actif de transcription, indiquant que les deux ARNm sont transcrits au même locus génomique.


De quoi est fait l'ARNm ?

Chaque séquence d'ADN qui finit par devenir une protéine est une exemple d'ARNm. Chaque séquence d'ADN qui finit par devenir une protéine est une exemple d'ARNm. Les ARN messager ou ARNm est simplement un support transitoire d'informations sur ce qu'il faut synthétiser du noyau aux ribosomes.

que signifie ARNm ? ARN messager

Par conséquent, où l'ARNm est-il fabriqué ?

Le processus de fabrication ARNm de l'ADN est appelé transcription et se produit dans le noyau. Les ARNm dirige la synthèse des protéines, qui se produit dans le cytoplasme. ARNm formé dans le noyau est transporté hors du noyau et dans le cytoplasme où il se fixe aux ribosomes.

ADN à la transcription d'ARN. L'ARN dans lequel l'information est transcrite est l'ARN messager (ARNm). Le processus associé à l'ARN polymérase consiste à dérouler le ADN et construire un brin de ARNm en plaçant sur la croissance ARNm molécule la base complémentaire de celle sur le brin matrice de la ADN.


La révolution du vaccin à ARNm ne fait que commencer

PERSONNE N'ATTENDAIT le premier vaccin Covid-19 à être aussi bon qu'il l'était. "Nous espérions environ 70 %, c'est un succès", a déclaré le Dr Ann Falsey, professeur de médecine à l'Université de Rochester, New York, qui a dirigé un site d'essai de 150 personnes pour le vaccin Pfizer-BioNTech en 2020.

Même Uğur Şahin, le co-fondateur et PDG de BioNTech, qui avait dirigé le médicament dès ses premiers stades, avait des doutes. Tous les tests de laboratoire préliminaires semblaient bons depuis qu'il les a vus en juin, il disait systématiquement aux gens que "immunologiquement, il s'agit d'un vaccin presque parfait". Mais cela ne signifie pas toujours que cela fonctionnera contre "la bête, la chose là-bas" dans le monde réel. Ce n'est que le 9 novembre 2020, trois mois après le début de l'essai clinique final, qu'il a finalement reçu la bonne nouvelle. « Efficace à plus de 90 pour cent », dit-il. «Je savais que cela changeait la donne. Nous avons un vaccin.

«Nous étions ravis», dit Falsey. « Cela semblait trop beau pour être vrai. Aucun vaccin respiratoire n'a jamais eu ce genre d'efficacité.

L'arrivée d'un vaccin avant la fin de l'année a été une tournure inattendue des événements. Au début de la pandémie, la sagesse conventionnelle était que, même avec tous les arrêts tirés, un vaccin prendrait au moins un an et demi à se développer. Les têtes parlantes ont souvent fait référence au fait que le précédent vaccin le plus rapide jamais développé, contre les oreillons en 1967, avait pris quatre ans. Les vaccins modernes s'étendent souvent au-delà d'une décennie de développement. BioNTech – et Moderna, basée aux États-Unis, qui a annoncé des résultats similaires plus tard la même semaine – a brisé ce calendrier conventionnel.

Aucune des deux sociétés n'était connue avant la pandémie. En fait, ni l'un ni l'autre n'avait jamais eu un seul médicament approuvé auparavant. Mais tous deux pensaient depuis longtemps que leur technologie d'ARNm, qui utilise de simples instructions génétiques comme charge utile, pourrait dépasser les vaccins traditionnels, qui reposent sur l'assemblage souvent laborieux de virus vivants ou de leurs parties isolées. L'ARNm s'est avéré être une chose extrêmement rare dans le monde de la science et de la médecine : une technologie prometteuse et potentiellement transformatrice qui a non seulement survécu à son premier grand test, mais a dépassé les attentes les plus folles de la plupart des gens.

Mais sa prochaine étape pourrait être encore plus grande. La portée des vaccins à ARNm allait toujours au-delà d'une seule maladie. Comme pour passer d'un tube à vide à une puce électronique, la technologie promet d'effectuer la même tâche que les vaccins traditionnels, mais de manière exponentiellement plus rapide et pour une fraction du coût. « Vous pouvez avoir une idée le matin et un prototype de vaccin le soir. La vitesse est incroyable », déclare Daniel Anderson, chercheur en thérapie par ARNm au MIT. Avant la pandémie, des organisations caritatives, dont la Fondation Bill & Melinda Gates et la Coalition for Epidemic Preparedness Innovations (CEPI) espéraient transformer l'ARNm de maladies mortelles que l'industrie pharmaceutique a largement ignorées, telles que la dengue ou la fièvre de Lassa, tandis que l'industrie a vu une chance de accélérer la quête de rêves scientifiques de longue date : un vaccin amélioré contre la grippe ou le premier vaccin efficace contre le VIH.

Amesh Adalja, expert en maladies émergentes au Johns Hopkins Center for Health Security, dans le Maryland, a déclaré que l'ARNm pourrait « faire en sorte que toutes ces applications que nous espérions, poussions, fassent partie de la vie quotidienne ».

"Quand ils écriront l'histoire des vaccins, ce sera probablement un tournant", ajoute-t-il.

Alors que le monde reste concentré sur le déploiement des vaccins Covid-19, la course à la prochaine génération de vaccins à ARNm – ciblant diverses autres maladies – explose déjà. Moderna et BioNTech ont chacun neuf candidats en développement ou en essais cliniques précoces. Il existe au moins six vaccins à ARNm contre la grippe en préparation, et un nombre similaire contre le VIH. Nipah, Zika, herpès, dengue, hépatite et paludisme ont tous été annoncés. Le domaine ressemble parfois au début d'une ruée vers l'or, alors que les géants pharmaceutiques recrutent des chercheurs prometteurs pour d'énormes contrats – Sanofi a récemment payé 425 millions de dollars (307 millions de livres sterling) pour s'associer à une petite biotech américaine d'ARNm appelée Translate Bio, tandis que GSK a payé 294 millions de dollars ( 212 millions de livres sterling) pour travailler avec l'allemand CureVac.

"La biotechnologie n'a généralement pas autant de perturbations que l'industrie informatique - les temps de développement sont longs, elle est fortement réglementée. Donc, vous pouvez généralement voir le changement venir », explique Hartaj Singh, analyste de l'industrie chez Oppenheimer & Co. « Covid a inversé la tendance, les vaccins à ARNm sont rapidement sortis comme le grand gagnant. De nombreuses plates-formes de vaccins plus anciennes auront disparu – remplacées – dans quelques années, ou du moins considérablement diminuées. »

Şahin irait plus loin. « Ce sera transformateur, cela ne fait aucun doute. Ce sera absolument transformateur. De nombreuses plates-formes de vaccins plus anciennes ne survivront pas. » Mais, dit-il, l'impact ira au-delà de ce que nous savons déjà. « Il y a tellement d'autres choses que nous pouvons faire. Ce n'est pas seulement un remplacement, nous proposerons d'autres nouvelles innovations médicales qui ne seraient pas possibles autrement. »

Ugur Sahin, PDG de BioNTech

TOUT LE MONDE N'ÉTAIT PAS tellement surpris que les vaccins à ARNm réussissent leur premier test avec brio. Katalin Karikó, une biochimiste hongroise, a commencé à travailler avec l'ARNm dès 1989. Ses recherches à l'Université de Pennsylvanie au milieu des années 2000 ont jeté les bases des vaccins BioNTech et Moderna (Karikó supervise maintenant les produits pharmaceutiques ARN pour BioNTech en tant que vice-président principal ). Quand je lui pose des questions sur son point de vue sur l'année écoulée, elle est typiquement émoussée. « Il n'y avait pas de clous rongés. Je m'attendais à ce que les vaccins soient très puissants », dit-elle.

Même en confinement, Karikó est l'un des centres névralgiques du monde des ARNm. Depuis son domicile à l'extérieur de Philadelphie, elle conseille les scientifiques de BioNTech en Allemagne et travaille toujours avec d'anciens collègues universitaires de l'État voisin de Penn State. C'est une scientifique invétérée, parsemant les conversations de références au format académique – nom, expérience, année – et constamment à la recherche de la prochaine frontière. Elle est profondément impressionnée par l'ampleur du déploiement du vaccin (« la fabrication, échelle incroyable, 200 millions de personnes déjà injectées »). Mais elle semble presque impatiente de voir combien de temps il a fallu aux gens pour comprendre sa fascination pour l'ARNm. La science a toujours dit que cela « fonctionnerait comme un charme », dit-elle, en racontant les études à petite échelle des deux dernières décennies.

Le concept derrière l'ARNm en tant que médicament est étonnamment simple : c'est la molécule que vos propres cellules utilisent pour transporter les instructions de vos gènes, écrites dans un langage chimique simple de quatre lettres. Si vous pouvez le synthétiser dans un laboratoire et le livrer aux cellules, vous pouvez théoriquement leur dire de fabriquer un outil spécifique - un antigène viral, ou une molécule bloquant le cancer, ou plus de tissu cardiaque - le tout dans leur propre langue. Moderna a commencé à appeler les thérapies à ARNm le «logiciel de la vie» ou un «système d'exploitation» pour la médecine.

Mais, comme tant d'autres propositions théoriquement attrayantes en science, elle était remplie de problèmes pratiques. Le corps rejette violemment l'ARN de sources extérieures - probablement pour éviter d'être détourné par des virus et d'autres agents pathogènes - et souvent l'ARN s'est avéré si toxique qu'il a tué les animaux de laboratoire sur lesquels il a été testé. "Nous ne pouvions pas rêver de l'utiliser sur des humains", dit Karikó. Pendant des années, cela a été un obstacle si important que peu de scientifiques ont même envisagé de l'utiliser pour des vaccins. "C'était tellement théorique à l'époque, personne ne faisait vraiment ce genre de choses", explique le Dr David Scales, professeur adjoint de médecine à l'Université Cornell qui a travaillé avec Karikó en tant qu'étudiant.

En collaboration avec l'immunologiste Drew Weissman de l'Université de Pennsylvanie au début des années 2000, Karikó a conçu des molécules d'ARNm synthétiques qui pourraient éviter les défenses de l'organisme. C'était un processus laborieux qui, dit Weissman, a tué beaucoup de souris avant qu'elles ne trouvent enfin la formule efficace. Mais en 2004, l'une de ses constructions a fonctionné. En effet, cela a ouvert les lignes de communication entre nos cellules et les messages d'ARNm créés par les scientifiques.

Karikó a toujours cru que l'ARNm pouvait tout faire. "Pendant des années, j'allais à des réunions scientifiques et j'approchais les gens pour leur dire:" Sur quoi travaillez-vous? Peut-être que cette technologie d'ARN pourrait aider » - quelle qu'elle soit, une maladie, même la calvitie. Ils pensaient probablement tous que j'étais folle », dit-elle en riant.

"Elle était tellement passionnée par les choses que l'ARN pouvait faire", dit Scales. « Elle était évangéliste et traductrice. Elle vous a aidé à réfléchir à toutes les possibilités.

Près de 20 ans plus tard, les vaccins rendus possibles par son travail ont fait de Karikó une célébrité scientifique. Ce morceau, dit-elle, "me rend nerveux." Le cofondateur de Moderna, Derrick Rossi, et le biologiste britannique Richard Dawkins ont suggéré qu'elle devrait être considérée pour le prix Nobel. C'est agréable, dit-elle, même si les demandes constantes d'interviews empiètent sur son travail. Et plus important que tous les applaudissements, c'est le fait que des milliers de scientifiques ont maintenant adopté sa façon de penser.

Contrairement aux premiers jours de la recherche sur l'ARNm, nous n'attendrons pas des décennies pour son prochain grand test. La pandémie l'a mis sous les projecteurs, et les scientifiques sont impatients de savoir si son succès contre le coronavirus peut être reproduit.

Norbert Pardi, professeur assistant de recherche à l'Université de Pennsylvanie

LE PROCHAIN ​​GRAND La percée du vaccin à ARNm ne sera probablement pas contre une autre nouvelle maladie exotique, mais très familière. "La grippe est la cible numéro un", dit Falsey. Maladie que la plupart des gens considèrent sous contrôle, la grippe tue encore plus de 300 000 personnes dans le monde la plupart des années. Ceci malgré plus d'un milliard de vaccins contre la grippe par an.« Les vaccins ne sont pas aussi efficaces que nous le souhaitons », dit-elle.

C'est peut-être un euphémisme. Selon les Centers for Disease Control and Prevention (CDC), qui suivent chaque année l'efficacité du vaccin aux États-Unis, ils atteignent rarement une protection de 50 %. Pour la saison grippale 2018-2019, il n'était que de 29%, certaines années, il est aussi bas que 10%. Les articles scientifiques, généralement peu enclins à un langage expressif, font souvent référence à un vaccin amélioré contre la grippe comme le « Saint Graal » du domaine.

Un scientifique qui poursuit ce rêve est Norbert Pardi, qui travaille dans l'ancien département de Katalin Karikó à l'Université de Pennsylvanie, où il a été recruté par Karikó en 2011. (Il vient également de Hongrie et me montre fièrement une photo en noir et blanc de son grand-père aux côtés du père de Karikó dans une boucherie d'une petite ville.) Depuis les résultats de BioNTech en novembre, le téléphone du laboratoire sonne sans arrêt. « Les entreprises, les universitaires, ils voulaient parler. Je voulais tout savoir sur ces vaccins à ARN », explique Pardi. Mais son projet principal, qui remonte à avant la pandémie de coronavirus, cible la grippe. "Le vaccin saisonnier n'est tout simplement pas très bon, nous pouvons en faire un meilleur."

Le problème avec les vaccins antigrippaux actuels réside dans le décalage entre la nature insaisissable du virus de la grippe et la méthode plutôt archaïque et lente que nous utilisons pour fabriquer un vaccin contre lui - un processus d'ARNm semble être fait sur mesure pour le remplacer. La maladie que nous appelons grippe est causée par plusieurs espèces différentes du virus de la grippe, et chaque espèce est hautement mutable (ce qui signifie qu'elle peut changer très rapidement). Cela signifie qu'un nouveau vaccin est requis chaque année contre les souches les plus mortelles, et même pendant la fabrication du vaccin, le virus continue de muter. L'ancien responsable de la vaccination pour le CDC, Bruce Gellin, l'appelle une "cible mobile", et dit qu'un vaccin qui convient bien au début de l'année pourrait être éludé quelques mois plus tard.

Cela semblerait nécessiter un vaccin rapidement adaptable et modifiable – et le vaccin contre la grippe saisonnière n'est pas cela. Le premier vaccin commercial contre la grippe a été homologué aux États-Unis en 1945, et nous le fabriquons presque de la même manière aujourd'hui. Le vaccin est fabriqué en cultivant les souches cibles du virus de la grippe dans des œufs de poule fécondés, puis en les purifiant de leurs blancs – un processus aussi désordonné que cela puisse paraître. Les virus sont ensuite inactivés chimiquement et injectés dans les bras des patients. Le tout est lent, prenant plusieurs mois entre l'identification des souches cibles, la croissance des œufs et la récolte du vaccin.

Tous les vaccins ne sont pas fabriqués de cette façon – les vaccins dits à «virus tué» sont les plus anciens de la vieille école. Pour la plupart des agents pathogènes, cette approche a depuis longtemps été supplantée par une technologie appelée vaccins à protéines recombinantes, où un seul morceau du virus – une protéine virale – est cultivé en laboratoire. C'est ce qu'utilisent les vaccins Novavax récemment approuvés. Si la bonne cible est choisie, cette seule pièce peut amorcer le système immunitaire aussi efficacement qu'un virus entier - avec beaucoup moins de dégâts.

Mais ils ont leurs propres inconvénients. Les protéines sont des molécules complexes, et elles peuvent être difficiles à cultiver en laboratoire. "J'ai passé beaucoup de temps en tant que biochimiste à purifier des protéines, elles peuvent être très compliquées, très particulières", explique Pardi.

L'ARNm supprime tout cela. Il a parfois été décrit dans la presse comme « transformer votre corps en une usine de vaccins », mais cela suggère une sorte de pouvoir coercitif. Votre corps est déjà une merveilleuse usine de protéines. Un million de fois plus efficace que n'importe quel laboratoire sur Terre, ses cellules fabriquent chaque jour des milliards de protéines pour le fonctionnement normal de l'organisme. Un vaccin à ARNm n'est qu'une petite instruction génétique dans la langue maternelle de l'usine - un ordre de travail pour ajouter quelques petites protéines virales à la file d'attente. « Vos cellules le font constamment de toute façon. Nous détournons juste un peu ce processus pour fabriquer la protéine virale que nous voulons que le système immunitaire reconnaisse », explique Anna Blakney, chercheuse en ARN à l'Université de la Colombie-Britannique.

Cela donne à l'ARNm un avantage de vitesse considérable par rapport aux méthodes traditionnelles, ce qui signifie que le virus de la grippe aurait moins de temps pour muter avant l'arrivée d'un vaccin. « Le délai de fabrication du vaccin est tellement plus court. Vous pourriez faire un énorme lot en deux semaines. Vous pourriez même recevoir plusieurs vaccins antigrippaux différents au cours de l'hiver si cela change en temps réel », explique Blakney.

"Nous pouvons y faire face à chaque saison", déclare ahin, qui espère avoir le vaccin contre la grippe de BioNTech dans des essais humains plus tard cette année.

Un vaccin antigrippal plus efficace serait déjà un grand pas, mais Pardi et son groupe vont au-delà, en essayant de créer un vaccin qui cible les structures centrales et immuables du virus de la grippe. « Un vaccin universel, une injection qui durerait des années », dit-il. Des décennies de recherche suggèrent de nombreuses cibles probables sur le virus de la grippe pour un tel vaccin, mais le ciblage de plusieurs sites sur plusieurs souches de grippe augmente rapidement la complexité et les coûts de l'approche traditionnelle. Ce n'est pas le cas avec l'ARNm, explique Pardi : « Nous pouvons facilement avoir 12 ou 14 cibles en un seul coup. Quatre protéines, et leurs variantes, dans plusieurs souches.

Le groupe de Pardi et leurs collaborateurs ont déjà démontré de bons résultats pour un vaccin chez la souris. Les furets sont les prochains sur l'échelle des tests sur les animaux - "j'espère cette année", dit-il. Il est possible que si leur vaccin universel fonctionne dans quelques années, il ne concurrencera pas les vaccins antigrippaux traditionnels mais les vaccins saisonniers à base d'ARNm que BioNTech et Moderna sont sur le point de tester maintenant. « Pendant de nombreuses années, nous avons dû convaincre les gens que cette technologie était viable – le monde a totalement changé à cet égard », dit-il. Comme Karikó, il est heureux de voir plus de scientifiques s'accumuler. « Nous aimons voir ça. Au cours des prochaines années, nous en apprendrons beaucoup sur le fonctionnement de la technologie. »

Un travailleur de laboratoire à l'installation de BioNTech à Mayence

LA GRIPPE EST UN cible évidente pour l'ARNm, explique le Dr Lynda Stuart, directrice adjointe des vaccins à la Fondation Gates. Elle s'attend à ce que la plate-forme «transforme les vaccins contre la grippe» et qu'il existe de nombreux autres vaccins qu'elle pourrait améliorer ou remplacer. Mais au-delà de cela, cela pourrait également aider avec ce qu'elle appelle les « problèmes et maladies réels, difficiles et insolubles ». Parce que la plate-forme peut produire un nouvel ARN si rapidement et à moindre coût, « vous n'avez pas à passer par ce long processus de fabrication avec chaque idée. Il devient plus rapide de les tester. Nous pouvons trouver de nouvelles idées plus rapidement.

Peut-être qu'aucun virus ne s'est avéré plus dur ou plus intraitable que le VIH. « Nous sommes près de 40 ans après la découverte du VIH », déclare Mark Feinberg, chef de l'Initiative internationale pour un vaccin contre le sida (IAVI), et malgré les progrès des traitements et de la prophylaxie, un remède n'est « pas proche ». Il y a un tas de problèmes. Le VIH est une infection à long terme – se cachant discrètement à l'intérieur de nos cellules plutôt que de mener une bataille immédiate et rangée avec le système immunitaire, comme Covid-19 ou la grippe. Il mute incroyablement rapidement, créant souvent plusieurs variantes à l'intérieur d'un même patient, de sorte qu'il n'a pas de cible unique et stable vers laquelle viser un vaccin. Un biochimiste m'a décrit la protéine de pointe du coronavirus comme une « cible juteuse », c'est pourquoi tant de vaccins différents agissent contre elle. « Un pic obtient une très bonne réponse immunitaire. Les protéines du VIH pas tellement », dit Feinberg.

Mais les scientifiques pensent qu'ils ont une feuille de route pour un vaccin. Comme l'explique Derek Cain, professeur au Human Vaccine Institute de l'Université Duke, une petite fraction des personnes infectées à long terme par le VIH finissent par développer ce qu'on appelle des « anticorps neutralisants largement » contre le virus, capables de l'arrêter avant qu'il ne pénètre dans les cellules. . À ce stade de la maladie, dit-il, ces anticorps sont comme «un extincteur contre un incendie de maison à quatre alarmes». Ils ne peuvent pas inverser l'infection par eux-mêmes. Mais si une personne nouvellement exposée au VIH avait les mêmes anticorps, « du coup c'est un extincteur contre une allumette », et l'infection pourrait être stoppée.

C'est comme si le système immunitaire de ces patients était un entraîneur qui avait trouvé une stratégie gagnante dans les dernières minutes d'un match, trop tard pour aider sa propre équipe. Mais, dit Cain, "Nous pouvons recréer ce combat avec une série de vaccinations", en montrant des instantanés de vaccins du système immunitaire non testés des mêmes infections à VIH qui ont progressé au fil des années chez les autres patients. Il faudra beaucoup d'essais et d'erreurs, de multiples vaccinations et des ajustements – ce que Stuart appelle potentiellement des « essaims de vaccins, avec de nombreuses cibles ».

En utilisant les méthodes traditionnelles de vaccination, ce serait une guerre d'usure scientifique massive. Feinberg dit qu'avec les vaccins à base de protéines, "l'intervalle entre avoir une idée et se lancer dans un essai pourrait facilement être de deux ans".

"Il est difficile d'imaginer avoir à suivre ce processus pour chaque immunogène, chaque cible", explique Cain. Mais l'ARN peut non seulement être rendu plus rapide, car il ne s'agit que du signal chimique plutôt que d'une protéine elle-même - il contient également toujours les mêmes ingrédients. Il n'a pas besoin d'une nouvelle série de longs tests de sécurité avant d'être jugé. « Vous pouvez passer d'une séquence à l'introduction d'un vaccin en clinique dans un délai sans précédent. Cela nous permettrait d'avancer beaucoup plus rapidement », explique Feinberg.

Soudain, le calendrier scientifique de ce projet incroyablement ambitieux est comprimé par des années, voire des décennies, dit Cain. Son groupe collabore actuellement avec Pardi et Weissman en Pennsylvanie pour commencer à sélectionner des cibles, tandis que l'IAVI et la Fondation Gates travaillent avec Moderna. "La question à un million de dollars est toujours de savoir si cela fonctionnera", dit Cain, mais l'approche de l'ARNm pourrait donner une réponse bien plus tôt que quiconque ne l'aurait cru possible il y a quelques années à peine.

« Cette échelle était inimaginable auparavant. Nous sommes à un point très excitant », déclare Feinberg.

Siège social et laboratoire principal de BioNTech à Mayence, Allemagne

LA MÊME HISTOIRE se déroule dans des centaines de domaines scientifiques différents. 2020 a ouvert les vannes. Ce n'est pas seulement que les vaccins Covid-19 ont validé l'ARNm en tant qu'approche scientifique, le déploiement du vaccin a également construit un vaste réseau de réglementation et de fabrication pour une toute nouvelle technologie en moins d'un an. Dans un sens, Covid a construit l'infrastructure pour l'avenir de l'ARNm. Les chercheurs avaient toujours promis que ce serait plus propre et plus rapide que les méthodes traditionnelles, mais maintenant les entreprises renforcent également la capacité de fabriquer des milliards de doses par an, et cela a été testé et trouvé sans danger chez des millions de personnes. "Ces données de sécurité, l'échelle de fabrication, c'est toute une valeur ajoutée qui aurait pu prendre des années à se développer", explique Stuart. Tant d'obstacles auxquels sont confrontées les autres technologies du ciel bleu ont été balayés par l'urgence de la pandémie.

De ce fait, le nombre de nouveaux projets explose. Un rapport récent de Roots Analysis a dénombré plus de 150 vaccins à ARNm et autres thérapies en cours de développement. Si l'ARNm est vraiment une nouvelle ère en vaccinologie, nous le saurons probablement dans un avenir très proche, grâce au grand nombre de médicaments testés. BioNTech travaille sur au moins sept nouveaux vaccins, certains « avec la même approche qu'avec Covid », explique ahin. D'autres, comme la tuberculose et le VIH, peuvent être des trajets plus longs. Moderna a neuf vaccins dans son pipeline. De nouveaux laboratoires et sociétés de biotechnologie font également la queue pour s'essayer, attirés par la communauté grandissante et la promesse de résultats rapides.

Ziphius Vaccines, une petite entreprise belge fondée en 2019 pour se concentrer sur les traitements par ARNm du cancer, s'est tournée vers les maladies infectieuses pendant la pandémie. « Personne ne croyait que l'on pouvait produire un vaccin aussi rapidement, mais du coup, avec la plateforme [ARNm], on peut obtenir une cible en six semaines », explique Mathieu Ghadanfar, directeur médical de l'entreprise. Ziphius a rapidement choisi dix cibles, dont la dengue, l'hépatite et l'encéphalite à tiques, et espère avoir des résultats précliniques pour au moins quatre d'ici la fin de 2022. En raison des avancées de l'année dernière, les grandes entreprises ont le savoir-faire d'étendre rapidement les résultats prometteurs provenant d'un laboratoire plus petit. "Il existe toutes ces installations qui peuvent désormais produire n'importe quel vaccin à ARNm, et celles-ci sont là pour rester", a déclaré Ghadanfar. "Chaque jour, je vois une nouvelle entreprise se lancer dans l'ARNm."

Même le processus de fabrication déjà rationalisé de ces vaccins est peut-être sur le point de se réduire encore plus, ce qui leur permettra non seulement d'être rendus plus faciles, mais pratiquement n'importe où. Parce que sa composition chimique est relativement simple par rapport aux virus entiers ou aux cellules vivantes que nous extrayons pour les vaccins traditionnels, les usines d'ARNm n'ont besoin que d'une fraction de l'espace. De la taille d'un "terrain de football à une pelouse", m'a plaisanté un ingénieur. Mais il n'y a aucune raison qu'ils ne puissent pas devenir encore plus petits et plus simples. « Comme s'installer sur un bureau, de la taille d'une photocopieuse. Vous avez vos produits chimiques dans une cartouche, et c'est parti », explique Harris Makatsoris, professeur de systèmes de fabrication durables au King's College de Londres.

Makatsoris travaille sur un prototype pour faire exactement cela. Cela fait partie d'un projet financé par le gouvernement britannique appelé Future Vaccine Manufacturing Research Hub, qui visait à l'origine à trouver des moyens pour les pays du Sud de fabriquer leurs propres vaccins. C'est toujours l'objectif, mais après des mois pendant lesquels presque toutes les nations de la Terre se bousculent et se battent pour des approvisionnements limités, la capacité de fabriquer des vaccins est désormais une priorité gouvernementale. Makatsoris imagine ces machines à échelle personnelle utilisées pour des opérations à petite échelle dans les hôpitaux, mais en cas de pandémie, devenant une sorte de grille nationale de vaccination. "Avec quelque chose comme 60 machines, vous pourriez faire toute la population de l'Angleterre", dit-il.

Ou, placez-les dans une boîte et envoyez-les là où vous en avez besoin. « Techniquement, c'est assez difficile, mais c'est petit, cela n'implique aucune matière dangereuse. C'est très transférable », explique Cleo Kontoravdi, professeur d'ingénierie des biosystèmes à l'Imperial College. Robin Shattock de l'Imperial College, qui dirige le hub, l'envisage en termes similaires à la révolution de l'informatique personnelle. « Le laboratoire dans une boîte est le PC, et les entreprises ou les laboratoires fabriquent des logiciels – des vaccins ou d'autres médicaments », dit-il. Tant que vous avez le matériel, vous pouvez exécuter le programme n'importe où dans le monde.

Un employé de laboratoire sur un banc propre dans le laboratoire de culture cellulaire de BioNTech

PEUT-ÊTRE LE PLUS Ce qui est passionnant au cours des prochaines années, c'est que, comme le dit Blakney, il y a « tant de choses que nous ne savons pas encore » sur ce que cette technologie peut faire exactement. Le biologiste fondateur de l'ARN James Eberwine dit qu'à mesure que nous en apprenons davantage sur son fonctionnement à l'intérieur de nos cellules et sur la façon de le manipuler, plus il peut devenir puissant. « L'avenir, c'est vraiment l'ARN », dit-il. "J'ai été partisan de cela pendant tout ce temps."

Dans un avenir immédiat, les bases de l'administration d'ARN pourraient être considérablement améliorées. À l'heure actuelle, les vaccins à ARNm fonctionnent comme les vaccins traditionnels, injectés dans un muscle et aspirés par les cellules qu'ils y rencontrent. « C'est un outil très contondant », dit Blakney. Elle se concentre sur le revêtement de nanoparticules lipidiques, le globule de graisse qui entoure la charge utile du vaccin à ARNm comme une bulle de savon. «Les gens trouvent maintenant des moyens de modifier la composition pour la faire agir différemment dans le corps, pour cibler la rate ou cibler les poumons. Nous commençons tout juste à comprendre comment contrôler ce système », dit-elle. Karikó envisage d'ajouter de nouvelles instructions qui jouent sur les propres signaux du corps pour mélanger et organiser son ARN - l'empêchant d'être utilisé dans certains types de cellules, ou modifiant le moment et la durée de son action. Cela pourrait rendre la livraison plus précise, moins toxique et finalement plus efficace.

« Il existe de réelles possibilités de ciel bleu », déclare Stuart. Les protéines de création d'ARNm sont le modèle de base. Elle suggère que la technologie pourrait également être utilisée pour le remplacement des protéines (traiter des maladies telles que la mucoviscidose, où le corps fabrique une protéine vitale de manière incorrecte) et des anticorps monoclonaux (petites cellules immunitaires qui peuvent cibler les cellules malades et cancéreuses pour la destruction). Chez BioNTech, ahin travaille sur les deux depuis bien avant Covid, et il est également enthousiasmé par ce qu'il appelle «l'ingénierie immunitaire», utilisant l'ARNm pour fournir des instructions pour des versions améliorées des propres molécules immunitaires du corps, complétant ses défenses existantes pour durent plus longtemps ou reconnaissent mieux les envahisseurs.


L'ARNm produit est-il constant dans le temps ? - La biologie

Le dogme central se concentre sur la production des grands polymères d'acide nucléique et de protéine de la biologie. Cependant, le contrôle et le maintien des fonctions de la cellule ne dépendent pas seulement de la synthèse de nouvelles molécules. La dégradation est un autre processus clé dans la vie des macromolécules de la cellule et est elle-même étroitement contrôlée. En effet, dans le modèle le plus simple de production d'ARNm, la dynamique du niveau moyen d'ARNm est donnée par

où r est le taux de production d'ARNm et est la constante de vitesse dictant la dégradation de l'ARNm. La valeur à l'état d'équilibre de l'ARNm est donnée par

montrant qu'en première approximation, c'est l'équilibre des processus de production et de désintégration qui contrôle les niveaux d'équilibre de ces molécules. Si notre équation est pour le nombre de copies de molécules par cellule, il y aura un changement brusque du nombre à chaque fois que les cellules se divisent puisque le contenu total en ARNm et en protéines est partagé entre les deux cellules filles. Si au contraire notre équation est pensée dans le langage des concentrations, nous n'avons pas à faire face à ce problème car à mesure que la cellule se développe, le nombre de molécules et donc la concentration varient en douceur. L'effet de croissance sur la concentration peut être absorbé dans la constante de vitesse de dégradation pour tenir compte de la dilution. C'est une solution mathématiquement élégante commune mais pas immédiatement intuitive, et nous allons donc essayer de la clarifier ci-dessous. Mais d'abord, quelles sont les valeurs caractéristiques des temps de dégradation des ARNm et des protéines ?

Figure 1 : Demi-vies mesurées des ARNm dans les fibroblastes d'E. coli, de levure bourgeonnante et de souris NIH3T3. (A, adapté de JA Bernstein et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 99:9697, 2002 B, adapté de Y. Wang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 99:5860, 2002 C. adapté de B. Schwanhausser, Nature, 473 : 337, 2013).

La durée de vie des molécules d'ARNm est généralement courte par rapport à l'échelle de temps fondamentale de la biologie cellulaire définie par le temps entre les divisions cellulaires. Comme le montre la figure 1A, pour E. coli, la majorité des molécules d'ARNm ont des durées de vie comprises entre 3 et 8 minutes.Les expériences menant à ces résultats ont été réalisées en inhibant la transcription grâce à l'utilisation du médicament rifampicine qui interagit avec l'ARN polymérase, puis en interrogeant les cellules sur leurs niveaux d'ARNm à deux minutes d'intervalle après le traitement médicamenteux. En particulier, les niveaux d'ARN ont été quantifiés en hybridant avec des ADN complémentaires sur une puce à ADN et en mesurant les niveaux relatifs de fluorescence à différents moments. Ces temps de dégradation ne sont que plusieurs fois plus longs que le temps minimal requis pour l'allongement transcriptionnel et traductionnel tel que discuté dans la vignette « Qu'est-ce qui est plus rapide, transcription ou traduction ? ». Cela reflète l'existence éphémère de certains messages d'ARNm.

Compte tenu de ces données à l'échelle du génome, diverses hypothèses peuvent être explorées pour les fondements mécanistiques des durées de vie observées. Par exemple, existe-t-il une corrélation entre l'abondance de certains messages et leur taux de dégradation ? Existe-t-il des motifs de structure secondaire ou des motifs de séquence qui confèrent des différences dans les taux de désintégration ? L'une des grandes surprises des mesures menant à la figure 1A est qu'aucune des idées reçues sur les origines de la durée de vie de l'ARNm ne s'est avérée cohérente avec les données, qui n'ont révélé aucune corrélation claire avec la structure secondaire, l'abondance des messages ou le taux de croissance.

Figure 2 : L’éléphant et l’Escheria Coli, décembre 1972. “Tout ce qui est vrai pour le Colibacille est vrai pour l’éléphant”, ou en anglais « What is true for the E. coli is true for the l'éléphant". De : http://www.pasteur.fr/infosci/archives/mon/im_ele.html

Dans quelle mesure l'affirmation de Monod selon laquelle « ce qui est vrai pour E. coli est vrai pour l'éléphant » (représenté par Monod sur la figure 2) nous amène à notre évaluation des durées de vie de l'ARNm dans d'autres organismes ? La réponse courte n'est pas très. Alors que la durée de vie médiane de la dégradation de l'ARNm est d'environ 5 minutes dans E. coli, la durée de vie moyenne est ≈ 20 minutes dans le cas de la levure (voir figure 1B) et de 600 minutes (BNID 106869) dans les cellules humaines. Fait intéressant, une mise à l'échelle claire est observée avec les temps de cycle cellulaire pour ces trois types de cellules d'environ 30 minutes (E. coli), 90 minutes (levure bourgeonnante) et 3000 minutes (humain), sous les vitesses de croissance exponentielle rapide dans lesquelles les cellules d'intérêt ont été cultivées pour ces expériences. En règle générale, ces résultats suggèrent que l'échelle de temps de dégradation de l'ARNm dans ces cas est donc d'environ un cinquième du temps de cycle cellulaire exponentiel rapide.

L'ARN messager n'est pas la seule cible de dégradation. Les molécules de protéines sont elles-mêmes également la cible d'une destruction spécifique, bien que généralement, leur durée de vie ait tendance à être plus longue que les ARNm qui conduisent à leur synthèse, comme discuté ci-dessous. En raison de ces longues durées de vie, sous des taux de croissance rapides, le nombre de copies d'une protéine particulière par cellule est réduit non pas à cause d'un processus de dégradation actif, mais simplement parce que la cellule double tous ses autres constituants et se divise en deux filles laissant chacune des filles avec deux fois moins de copies de la protéine d'intérêt que celles présentes dans la cellule mère. Pour comprendre l'effet de dilution, imaginez que toute synthèse protéique pour une protéine donnée a été désactivée tandis que la cellule continue de doubler son volume et se divise peu de temps après. En termes de valeurs absolues, si le nombre de copies de notre protéine d'intérêt avant la division est N, après c'est N/2. En termes de concentrations, s'il partait d'une concentration c, au cours du cycle cellulaire il s'est dilué à c/2 par le doublement du volume. Ce mécanisme est particulièrement pertinent dans le contexte des bactéries où les durées de vie des protéines sont souvent dominées par le temps de division cellulaire. En conséquence, le taux de perte totale de protéines (terme ayant la même signification que γ pour l'ARNm) est la somme d'une partie due à la dégradation active et d'une partie due à la dilution qui se produit lorsque les cellules se divisent et nous pouvons écrire le total taux d'enlèvement sous la forme α=αactifdilution.

L'affirmation selon laquelle la durée de vie des protéines dans les bactéries à croissance rapide est plus longue que le cycle cellulaire lui-même est corroborée par des mesures déjà effectuées dans les années 1960, où le marquage radioactif était utilisé comme moyen de mesurer les taux. Dans ce cas, la dégradation des protéines marquées a été surveillée en examinant l'accumulation d'acides aminés radioactifs dans un perfusat à échange rapide. On a estimé que seulement 2-7% du protéome était activement dégradé, avec une demi-vie d'environ 1 heure (BNID 108404). Plus récemment, des études ont montré des cas spécifiques de dégradation rapide, notamment des facteurs sigma, des facteurs de transcription et des protéines de choc froid, mais l'affirmation générale selon laquelle la dilution est le mécanisme dominant de perte de protéines chez les bactéries reste valable.

Figure 3 : Demi-vies mesurées des protéines dans la levure bourgeonnante et une lignée cellulaire cancéreuse humaine HeLa. L'expérience sur la levure a utilisé l'inhibiteur de traduction cycloheximide qui perturbe la physiologie cellulaire normale. La demi-vie médiane des 4100 protéines mesurées dans la cellule HeLa non en division est de 36 heures. (A, adapté de A. Belle et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 103:13004, 2006 B, adapté de S. Cambridge et al, J. Proteome Res. 10:5275, 2011.)

Tout comme avec les études à l'échelle du génome des durées de vie des ARNm décrites ci-dessus, les durées de vie des protéines ont été soumises à un examen similaire. Étonnamment, nous n'avons pas pu trouver d'informations à l'échelle du génome dans la littérature sur les temps de dégradation des protéines dans E. coli mais chez la levure bourgeonnante, un médicament d'inhibition de la traduction (cycloheximide) a été utilisé pour inhiber la synthèse macromoléculaire, puis la teneur en protéines a été quantifiée à des moments ultérieurs à l'aide de Western blots. La technique de Western blot est un schéma dans lequel les protéines d'intérêt sont repêchées par liaison spécifique à une partie de la protéine (par exemple par des anticorps) et la quantité de protéine est lue à partir de l'intensité d'un rapporteur qui a été calibré par rapport à une référence. L'inhibition de la traduction peut provoquer des artefacts, mais avec cette mise en garde à l'esprit, les durées de vie mesurées illustrées à la figure 3A à l'aide de la méthode d'inhibition de la traduction révèlent les durées de vie plus longues des protéines par rapport à leurs homologues ARNm, avec une durée de vie moyenne d'environ 40 minutes (BNID 104151). Les problèmes de précision de ces résultats nécessitent encore le développement de nouvelles méthodes pour construire de telles enquêtes.

Figure 4 : Distribution de 100 protéines d'une lignée cellulaire humaine H1299, comparant le taux de dégradation à la dilution pour trouver quel mécanisme d'élimination est dominant pour chacune des protéines. Le taux d'élimination global alpha varie entre 0,03 et 0,82 heure-1 avec une moyenne de 0,1+/-0,09 heure-1. Cela équivaut à une demi-vie ≈ 7 heures via la relation demi-vie, T1/2 = ln(2)/alpha. Adapté de E. Eden et al, Science, 331:764, 2011.

En utilisant des techniques modernes de fluorescence, il est devenu possible de mesurer les taux de dégradation des protéines humaines in vivo sans avoir besoin de lyser les cellules. Les longs temps d'élimination observés dans les cellules humaines sont illustrés à la figure 3B. Les mesures ont été effectuées en fusionnant la protéine d'intérêt à une protéine fluorescente. Ensuite, en divisant la population en deux groupes dont l'un est photoblanchi et l'autre non, et en observant la réémergence de la fluorescence dans la population photoblanchie, il est possible de mesurer directement le temps de dégradation. Comme le montre la figure 4, pour les cellules humaines, il existe une interaction intéressante entre la dégradation active et l'élimination des protéines par dilution. Les demi-vies de dégradation active se sont avérées être largement distribuées avec le renouvellement observé le plus rapide de moins d'une heure et le plus lent ne montrant qu'une dégradation active négligeable au cours des quelques jours de microscopie en accéléré. Ces résultats peuvent être mis en contraste avec une prédiction basée sur la règle N-end qui stipule que l'acide aminé à l'extrémité N terminale de la protéine a un effet important sur la dégradation active effectuée par le système d'ubiquitination. Par exemple, dans les systèmes de mammifères, il prédit que l'arginine, le glutamate et la glutamine entraîneront une dégradation en une heure environ, tandis que la valine, la méthionine et la glycine seront stables pendant des dizaines d'heures.

En essayant de caractériser les durées de vie des protéines les plus stables, des souris ont reçu de la nourriture marquée aux isotopes pendant une courte période à un âge précoce, puis analysées un an plus tard. Les résultats ont montré que la plupart des protéines se renouvellent en quelques jours, mais que quelques-unes présentent une stabilité remarquable. Les demi-vies des histones ont été mesurées à ≈200 jours.


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