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Chimie de la formation de liaisons phosphodiester par l'ADN polymérase

Chimie de la formation de liaisons phosphodiester par l'ADN polymérase


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Alors que j'enseigne la biologie générale à mes étudiants, j'ai réalisé que je ne comprenais pas tout à fait comment un nucléotide 3-P comme l'ATP est décomposé pour être incorporé dans l'ADN lors de la réplication. Comment cela marche-t-il??

En d'autres termes, quel est le véritable mécanisme/voie de réaction pour les éléments suivants :

Ce que je sais:

Je comprends que l'ATP est généralement hydrolysé pour devenir déphosphorylé dans d'autres contextes. Je comprends également qu'un phosphate d'un nucléotide est lié à un désoxyribose d'un nucléotide adjacent via une synthèse de déshydratation à partir de la jonction de leurs groupes hydroxyle pour former de l'ADN.

Cependant, je n'arrive pas à trouver une bonne ressource (en ligne ou dans l'un de mes manuels bio généraux [certes simples]) qui démontre exactement comment ces deux réactions se produisent pendant la réplication…

Je suppose que l'ADN polymérase profite des phosphates libérés par l'ATP (et des formes appropriées de GTP, CTP, TTP) pour s'activer ?

Dans l'ensemble, à quoi ressemble tout ce processus au niveau chimique/moléculaire ?

J'aimerais un visuel (en particulier une vidéo) si vous pouviez fournir une telle ressource en plus d'une explication approfondie de ce qui se passe ici.


J'ai trouvé cet article, qui approfondit les détails moléculaires des étapes individuelles de cette réaction et explique également comment cela est couplé à la sélectivité des nucléotides.

Les détails « de base » sur la réaction (cités de cette section, qui a également une belle figure):

La réaction de polymérisation procède par une simple attaque nucléophile du 3'OH de l'amorce sur le -phosphate du dNTP entrant suivie de l'élimination du pyrophosphate [… ] La réaction utilise un mécanisme « à deux ions métalliques » dans lequel l'ion métallique A active le 3'OH en tant qu'hydroxyde métallique tandis que les deux métaux A et B stabilisent la charge négative en développement sur le -phosphate à l'état de transition.

Les ions métalliques sont du magnésium (Mg$^{2+}$) et sont correctement positionnés par la structure enzymatique et certaines chaînes latérales d'acides aminés supplémentaires aident également à l'activation de la réaction.


Apologie

La réponse donnée par @Nicolai est essentiellement correcte (et je l'ai votée). Cependant, je pense que la question incarne certaines hypothèses erronées qui devraient être contestées afin que les lecteurs naïfs de la question ne soient pas induits en erreur en les acceptant. (Je les appelle ci-dessous "problèmes".) Je pense également que des illustrations - non incluses dans la réponse fournie par @Nicolai - sont nécessaires à cet égard.)

Autorité de soutien

J'ai utilisé un article de 2016 dans Science par Gao et Wang comme mon autorité, en citant et en reproduisant une partie de l'une de ses figures pour ceux qui n'ont pas accès à cette revue en bibliothèque. Les auteurs proposent en fait un mécanisme « ion à trois métaux », plutôt que le mécanisme « ion à deux métaux » mentionné par @Nicolai. Ceci, cependant, n'affecte pas les points de base que je fais, bien que cela serve à illustrer que les détails du mécanisme enzymatique sont d'une complexité qui ne convient pas à un enseignement à un niveau d'introduction.

Voici deux images clés de la figure 1 de cet article :

Problème 1

« Je suppose que l'ADN polymérase profite des phosphates libérés par l'ATP (et des formes appropriées de GTP, CTP, TTP) pour s'activer ? »

Une enzyme n'est pas « activée » par les produits de la réaction qu'elle catalyse. La liaison du substrat peut entraîner un changement de conformation qui se traduit par un état plus favorable pour la catalyse - et qui pourrait être appelé « activation » dans une discussion sur ce sujet ; mais l'usage de ce mot ne peut qu'embrouiller au niveau où se pose la question courante. En effet, l'un des concepts clés de la catalyse enzymatique est « énergie d'activation » - l'énergie nécessaire pour atteindre le état de transition. L'énergie d'activation fait référence à l'activation des réactifs - pas de l'enzyme. Pour citer le journal :

Les enzymes augmentent la vitesse des réactions chimiques, ce qui est censé se produire par une réduction de l'énergie d'activation nécessaire pour atteindre l'état de transition (Fig. 1A)

Les réactions chimiques qui entraînent une diminution de l'énergie libre (de Gibbs) (l'axe « Énergie » sur la figure 1A) sont thermodynamiquement favorables. Ils se produisent lentement car ils passent par un état de transition d'énergie plus élevée. Le rôle d'un catalyseur enzymatique est d'abaisser l'énergie pour atteindre cet état de transition (l'énergie d'activation). Comme le montre la figure, cette réaction est thermodynamiquement favorable. Le pyrophosphate libéré n'a aucune fonction, si ce n'est d'être hydrolysé par des pyrophosphatases pour éviter que la polymérisation ne s'inverse.

Problème 2

On ne sait pas ce que la flèche à gauche de la figure dans la question (du -phosphate du dNTP à l'amorce OH) est censée représenter†. Normalement, on supposerait qu'il s'agirait d'un électron, mais ici, cela n'a pas de sens. Comme le dit @Nicolai

« … la réaction procède par une simple attaque nucléophile du 3'OH de l'amorce sur le -phosphate du dNTP entrant »

c'est-à-dire que la flèche doit être de les électrons d'oxygène de l'OH à le phosphate nucléophile. Ceci est montré sur la figure 1B (où la chaîne d'ADN naissante est à gauche et le dNTP à droite). Cette dernière figure montre en fait l'état de transition, ce qui permet de voir de manière générale comment celui-ci pourrait être d'énergie plus faible que pour la réaction non enzymatique non catalysée. Il est stabilisé par les deux ions métalliques (Mg2+), qui elles-mêmes sont maintenues dans la position appropriée par des chaînes latérales acides au site actif de l'enzyme.

Notes de bas de page
Comme le souligne @ user1136, l'expression «activation enzymatique» est également utilisée pour décrire l'action des effecteurs allostériques positifs - de petites molécules qui augmentent l'activité du site actif par un changement structurel initié par leur liaison à un site distal du site actif - le site allostérique. Il s'agit d'une autre cause potentielle de confusion car elle n'a aucune pertinence ici.

†Dans un commentaire, l'affiche écrit « La flèche dans… l'image… représente le mouvement conceptuel des molécules et non les interactions chimiques du « monde réel » ». Si c'est ce qui était prévu (je ne connais pas la source), à ​​mon avis, les auteurs auraient dû utiliser un style de flèche différent (par exemple, une plus large, plutôt que ➛, et ne pas l'a tiré du phosphate à l'OH. Il trahit un manque de connaissance ou de préoccupation pour les conventions chimiques, et est particulièrement trompeur pour l'étudiant qui souhaite comprendre la biologie à un niveau chimique. Je trouve cela inexcusable chez un éditeur avec une réputation comme celle de Benjamin.


Métabolisme de l'ARN : synthèse, polymérase et catabolisme

Dans cet article, nous discuterons de: - 1. Synthèse d'ARN 2. ARN polymérase 3. Facteurs Sigma (σ) 4. Ribozymes 5. Catabolisme 6. Les ARN ribosomiques sont traités à partir d'un grand précurseur 7. L'ARN messager (ARNm) est modifié aux extrémités 5 & 3 & 8242 8. L'ARN de transfert (ARNt) est largement traité et modifié.

  1. Synthèse d'ARN
  2. ARN polymérase
  3. Facteurs Sigma (σ) de l'ARN
  4. L'ARN est également connu sous le nom de ribozymes
  5. Catabolisme de l'ARN
  6. Les ARN ribosomiques sont traités à partir d'un grand précurseur
  7. L'ARN messager (ARNm) est modifié aux extrémités 5 & 8242 et 3 & 8242
  8. L'ARN de transfert (ARNt) est largement traité et modifié

je. La transcription est le processus par lequel la synthèse de la molécule d'ARN est initiée et terminée.

ii. Étapes de la transcription :

(a) Formation d'un complexe de transcription :

L'enzyme ARN polymérase (dépendante de l'ADN) doit se lier à des séquences spécifiques sur un ADN. Les séquences reconnues par l'ARN polymérase sont appelées promoteur. Le brin d'ADN qui sert de tem­plate pour la synthèse d'ARN est appelé brin tem­plate (-brin).

Le brin d'ADN complémentaire à la matrice est appelé brin non-matrice (+ brin). Ce brin non-modèle est appelé brin codant. L'ARN polymérase (holoenzyme) se compose d'une enzyme centrale et d'un facteur sigma (a).

Le facteur Sigma reconnaît les séquences promotrices.

L'ARN polymérase s'attache à la région pro­moter.

L'ARN polymérase fait fondre la structure hélicoïdale et sépare localement 2 brins d'ADN.

L'ARN polymérase initie la synthèse de l'ARN. Le site où le premier nucléotide est incorporé est appelé le point de départ.

L'enzyme centrale commence la transcription au niveau du brin d'ADN séparé d'un complexe d'initiation. La sous-unité de l'ARN polymérase possède deux sites de liaison spécifiques pour la liaison du nucléotide triphosphate (NTP). Le premier NTP entrant se lie à l'ARN polymérase au point de départ du site d'initiation et H se lie à la base complémentaire de l'ADN au sein du complexe.

Ce site ne lie que le nucléotide triphosphate de purine A ou G. La liaison se fait avec l'extrémité 3 & 8242 du NTP, laissant l'extrémité 5 & 8242 libre. Le deuxième NTP entrant se lie au site d'élongation sur la polymer­ase.

Ce dinucléotide tétra-phosphate a soit le nucléotide terminal 5 & 8242. Après cette formation de liaison phosphodiester, un facteur est libéré. La première base est alors dissociée du site d'initiation et indique la fin de l'initiation.

L'enzyme polymérase centrale se déplace dans la direction 3′-5′ du brin codant et elle ajoute des NTP successifs à l'extrémité 3′-OH de la chaîne ribonucléotidique déjà établie dans la direction 5′-3′. Le NTP entrant forme une liaison phosphodiester avec l'extrémité 3 & 8242-OH du ribonucléotide précédent. L'hélice d'ADN se referme après la transcription de l'ARN polymérase à travers elle et la chaîne d'ARN en croissance se dissocie de l'ADN.

La fin de la synthèse de la molécule d'ARN est signalée par une séquence dans le brin temporisé de la molécule d'ADN, un signal qui est reconnu par une protéine de terminaison, le facteur Rho (p). Au niveau des sites de terminaison spécifiques, la nouvelle chaîne d'ARN est libérée.

Après la terminaison, l'enzyme centrale se sépare de la matrice d'ADN et l'enzyme centrale se lie à nouveau à un facteur et participe à la formation d'une nouvelle molécule d'ARN. Après la fin de la terminaison, le facteur Rho (p) dissocie l'ARN et ce facteur est à nouveau recyclé. Le processus global est donné à la Fig. 25.12.

je. C'est l'enzyme clé de la transcription.

ii. Un seul type d'ARN polymérase est responsable de la synthèse d'ARNm, d'ARNr, d'ARNt, etc.

iii. Différentes enzymes sont nécessaires pour synthétiser différents types d'ARN. Ils sont appelés ARN polymérase I, ARN polymérase II, III, etc.

iv. Composition des sous-unités de l'ARN polymère et de la shyase d'E. Coli.

v. L'holoenzyme α2ββ’σ peut être séparé en deux composants, l'enzyme de base (α2ββ’) et le facteur sigma.

vi. L'holoenzyme nécessite une matrice d'ADN double brin, quatre ribonucléotides triphosphates (GTP, ATP, UTP, CTP) et Mg++ ou Mn++.

vii. L'holoenzyme initie la transcription.

viii. L'enzyme de base a la capacité de synthétiser l'ARN sur une matrice d'ADN.

3. Sigma (σ) Facteurs d'ARN :

L'initiation de la transcription nécessite des protéines de spécificité (appelées facteurs σ). Ces facteurs sigma se lient de manière réversible à l'ARN polymérase centrale catalytiquement active.

L'ARN polymérase centrale interagit avec les facteurs sigma (σ) pour former une holoenzyme. Après la libération du facteur , l'enzyme centrale allonge une chaîne d'ARN.

La majorité de la transcription cellulaire nécessite le facteur σ primaire. Chez E. coli, le facteur primaire est appelé 70 et chez B. subtilis σ 43 .

Ces dernières années, les gènes codant pour les facteurs bactériens et phagiques ont été isolés et leurs séquences d'acides aminés ont été déduites des séquences d'ADN correspondantes. Cela montre que de nombreux facteurs ont des séquences d'acides aminés similaires et forment une famille de protéines homologues, les facteurs peuvent donc utiliser une variété de structures protéiques pour accomplir des fonctions apparentées dans les cellules bactériennes.

Activités biochimiques de Facteurs :

Les activités biochimiques des fac­teurs bactériens comprennent :

(b) Activation de la reconnaissance du promoteur

(d) Inhibition de la transcription non spécifique.

(e) Tous les facteurs ont au moins les deux premières de ces activités.

Différents facteurs σ interagissent avec la même ré­gion du complexe central d'ARN polymérase. Par conséquent, de nombreux facteurs o peuvent partager une structure protéique commune qui permet la liaison au noyau. La reconnaissance du promoteur ne peut se produire que lorsque l'holoenzyme est formée.

Il semble très probable que les facteurs σ eux-mêmes établissent des contacts spécifiques à la séquence avec la promotion. Les facteurs bactériens ne se lient pas légèrement à l'ADN en l'absence de core RNA polymer­ase. Comme pour la reconnaissance du promoteur, les facteurs ne présentent pas d'activité de fusion de l'ADN en l'absence des sous-unités centrales d'ARN polymérase.

Enfin, il a été démontré que les facteurs E. coli 70 réduisent l'affinité des sous-unités centrales pour le promoteur d'ADN ne contenant pas de promoteur d'environ 10 4 . Il a été avancé que cette activité est importante pour permettre la reconnaissance du promoteur contre un large arrière-plan d'ADN non spécifique. Chez B. subtilis, un composant protéique séparé, δ 21 , inhibe la transcription médiée par le noyau de l'ADN ne contenant pas de promoteur.

La protéine 21 se lie à l'enzyme centrale de B. subtilis en présence et en l'absence de facteurs et réduit l'interaction de l'ARN polymérase avec la matrice d'ADN. Il est intéressant de noter que la capacité d'inhiber la transcription non spécifique a également été attribuée à un facteur de spécificité des mitochondries de levure qui peut être fonctionnellement similaire à un facteur .

Caractéristiques générales de Facteurs :

(a) Les facteurs σ forment un groupe hétérogène de protéines.

(b) E. coli 70 et B. subtilis 43 ont une identité d'acides aminés d'environ 50 % permettant un espace de 245 acides aminés introduit dans le plus petit facteur σ 43.

(c) Toutes les protéines σ apparentées sont acides avec un excès de charge négative à pH 7,0. Le facteur E. coli σ 70 est l'une des protéines les plus acides d'E. coli.

(d) La plupart des facteurs a bactériens sont des polypeptides uniques.

4. L'ARN est également connu sous le nom de ribozymes:

une. Les ARN qui présentent une activité catalytique hautement spécifique au substrat et répondent à tous les critères classiques de définition en tant qu'enzymes sont appelés ribozymes.

b. Ils catalysent la trans-estérification et finalement l'hydrolyse des liaisons phosphodiester dans les molécules d'ARN. Ces réactions sont facilitées par les groupes -OH libres, par exemple sur les résidus guanosyle.

c. Ils jouent un rôle clé dans les événements d'épissage d'intron essentiels à la conversion des pré-ARNm en ARNm matures.

ré. Récemment, il a été noté qu'un composant d'ARN ribosomique hydrolyse un ester d'aminoacyle et joue ainsi un rôle central dans la fonction de liaison pep­tide. Ces observations, faites dans des organites de plantes, de levures, de vichyrus et de cellules eucaryotes supérieures, montrent que l'ARN peut agir comme une enzyme.

5. Catabolisme de l'ARN:

une. Les ribonucléases hydrolysent spécifiquement les acides ri­bonucléiques.

b. Les endonucléases clivent les liaisons phospho-shydiester internes pour produire un 3′-hydroxyle et un 5′-phospharyl ou un 5′-hydroxyle et une extrémité 3′-phospharyl.

c. Les exonucléases ne sont capables d'hydrolyser un nucléotide que lorsqu'il est présent à l'extrémité d'une molécule.

Les molécules d'ARN sont souvent traitées avant de devenir fonctionnelles:

je. Tous les transcrits primaires d'ARN eucaryotes subissent un traitement avant leur fonction, que ce soit sous forme d'ARNm, d'ARNr ou d'ARNt. Ce traitement se produit principalement dans le noyau. Le traitement comprend un clivage nucléolytique en molécules plus petites et des réactions nucléolytiques et de ligature couplées.

ii. Dans les cellules de mammifères, 50 à 75 % de l'ARN nucléaire ne contribue pas à l'ARNm cytoplasmique. Cette perte d'ARN nucléaire est significativement plus importante que la perte de séquences internes seules.

Les portions codantes (exons) de la plupart des gènes eucaryotes sont interrompues par des introns:

je. Les exons de nombreux gènes sont de longues séquences d'ADN qui ne fournissent pas l'information génétique et sont finalement transfonnés en la séquence d'acides aminés d'une molécule de protéine. Ces séquences interrompent la région codante des gènes de structure. Ces séquences intermédiaires (introns) existent chez la plupart des eucaryotes.

ii. Les séquences d'ARN d'intron sont séparées du transcrit et les exons du transcrit sont épissés ensemble dans le noyau avant que la molécule d'ARNm résultante n'apparaisse dans le cytoplasme pour la traduction. Les exons sont les moyens de fournir l'information génétique.

Les introns sont supprimés et les exons sont épissés ensemble:

je. Après élimination des introns, les exons sont ligaturés pour former la molécule d'ARNm qui est transportée vers le cytoplasme.

ii. Des quatre différents mécanismes de réaction d'épissage, celui le plus fréquemment utilisé dans les cellules eucaryotes est décrit ici. Il existe des séquences raisonnablement conservées à chacune des deux jonctions exon-intron (épissage) et au site de ramification qui est localisé 20 à 40 nucléotides en amont du site d'épissage 3 à 8242. Le spliceosome, une structure particulière, est impliqué dans la conversion du transcrit primaire en ARNm.

iii. Les spliceosomes se composent du transcrit primaire, de cinq petits ARN nucléaires (U1, U2, U5 et U4/U6) et de plus de 50 pro­teines. Collectivement, ceux-ci forment un petit complexe de nucléoprotéines (snRNP), parfois appelé snurp. Les snurps sont utilisés pour positionner les segments d'ARN pour les réactions d'épissage nécessaires.

La réaction d'épissage commence par une coupure à la jonction de l'exon 5′. Ceci est effectué par une attaque nucléophile par un résidu adénylyle dans la séquence de point de ramification située juste en amont de l'extrémité 3 à 8242 de cet intron.

iv. Le terminal libre 5′ forme alors une boucle qui est liée par une liaison phosphodiester inhabituelle 5′ - 2′ au réactif A dans la séquence du site de ramification PyNPyPyPuAPy (Fig. 25.13). Le résidu adénylyle est typiquement situé à 28-37 nucléotides en amont de l'extrémité 3 à 8242 de l'intron à éliminer. Le site de branche identifie le site d'épissure 3′.

Une deuxième coupe est faite à la jonction de l'intron avec l'exon 3′. Dans cette deuxième réaction de trans-estérification, l'hydroxyle 3′ de l'exon amont attaque le phosphate 5′ à la frontière exon-intron en aval et la structure contenant l'intron est libérée et hydrolysée. Les exons 5'8242 et 3'8242 sont ligaturés pour former une séquence continue.

v. U1 se lie d'abord au 5 exon-intron lié­ary par appariement de bases U2 se lie ensuite, par appariement de bases, au site de ramification. Un complexe U5/U4/U6 rejoint ensuite le spliceosome. Un déroulement à médiation protéique dépendante de l'ATP entraîne la perturbation du complexe U4/U6 à paires de bases avec la libération de U4. U6 est alors capable d'interagir d'abord avec U2, puis avec U1.

Ces interactions servent à approximer le site d'épissage 5 & 8242, le point de branchement avec son A réactif, puis le site d'épissage 3 & 8242. Ceci est amélioré par U5. Les deux extrémités sont clivées par le complexe U2/U6. L'ARN sert d'agent catalytique. Cette séquence est ensuite répétée dans des gènes contenant plusieurs introns. Les introns ne sont pas nécessairement supprimés dans l'ordre - 1, puis 2, puis 3, etc.

vi. Les molécules d'ARN hn sont les transcrits primaires ainsi que leurs premiers produits traités qui sont transportés vers le cytoplasme sous forme de molécules d'ARNm matures après l'ajout des queues Caps et Poly (A) et l'élimination de la partie correspondant aux introns.

6. Les ARN ribosomiques sont traités à partir de un grand précurseur :

je. Dans les cellules de mammifères, trois molécules d'ARNr A sont transcrites pour agir comme une grande molécule précurseur. Le précurseur est ensuite traité dans le nucléole pour fournir le composant ARN des sous-unités ribosomales du cytoplasme.

Les gènes d'ARNr sont présents dans les nucléoles et des centaines de ces gènes sont présents dans chaque cellule. Ce grand nombre de gènes synthétise finalement de nombreuses copies de chaque type d'ARNr pour former les 10 7 ribosomes nécessaires à chaque réplication cellulaire. Une seule molécule d'ARNm est copiée dans 10 5 molécules de protéines, ce qui permet une grande amplification, les ARNr sont des produits finaux.

ii. Chacune des unités transcrites par les gènes de l'ARNr code (5'8242 à 3'8242) un ARN ribosomique 18s, 5,8s et 28s. Le transcrit primaire est une molécule de 45 s hautement méthylée dans le nucléole. Dans le précurseur 45s, le segment 28s contient 65 groupes ribose-méthyle et 5 groupes base-méthyle. Le précurseur 45s est traité par nucléolyse.

iii. Au cours du traitement de l'ARNr, une méthylation supplémentaire se produit. Dans les nucléoles, la plus grande sous-unité 60s est formée par l'assemblage de chaînes 28s avec 50 protéines ribosomiques. La molécule d'ARNr 5.8s est également formée à partir de l'ARN précurseur 45 s dans le nucléole. La molécule d'ARNr 18s est associée à 30 protéines ribosomiques pour former les sous-unités ribosomiques (40s).

7. L'ARN messager (ARNm) est modifié aux extrémités 5 & 8242 et 3 & 8242:

je. Les molécules d'ARNm de mammifères contiennent une structure de coiffe de 7-méthylguanosine à leur terminal 5, et la plupart ont une queue poly (A) au terminal 3 & 8242. La structure du capuchon est ajoutée à l'extrémité 5 du précurseur d'ARNm nouvellement transcrit dans le noyau avant le transport de la molécule d'ARNm vers le cytoplasme.

Le capuchon 5′ du transcrit de l'ARN est nécessaire à l'initiation de la traduction et à la protection de l'extrémité 5′ de l'ARNm contre les attaques par les exonucléases 5′ → 3′.

ii. Les queues poly (A) sont ajoutées à l'extrémité 3 & 8242 des molécules d'ARNm dans l'étape de traitement post-transcriptionnelle. L'ARNm est d'abord clivé à environ 20 nucléotides en aval d'une séquence de reconnaissance AAUAA. La poly (A) polymérase ajoute une courte queue poly (A) qui s'étend à 200 résidus A.

Cette enzyme protège l'extrémité 3′ de l'ARNm de l'attaque de l'exonucléase 3′ → 5′. Dans les cellules mammaires, les processus cytoplasmiques peuvent ajouter et éliminer des résidus d'adénylate des queues poly (A).

iii. Les nucléotides supplémentaires se produisent dans les régions non codantes 5 à 8242 et 3 à 8242 de la région codante, les séquences non codantes les plus longues se trouvent généralement à l'extrémité 3 à 8242.

8. L'ARN de transfert (ARNt) est largement traité et modifié:

je. Les molécules d'ARNt agissent comme des molécules adaptatrices pour la traduction de l'ARNm en séquences protéiques. Les tRN As sont réduits en taille par une classe spécifique de ribonucléases. Les gènes de certaines molécules d'ARNt contiennent un seul intron de 10 à 40 nucléotides de long.

Ces introns sont transcrits. Le traitement des transcrits précurseurs de nombreuses molécules d'ARNt doit inclure le remplacement des introns et l'épissage approprié de la région de l'anticodon pour générer une molécule adaptatrice active pour la synthèse des protéines.

ii. La modification supplémentaire des molécules d'ARNt comprend l'alkylation des nucléotides et la fixation de la terminaison C-C-A caractéristique à l'extrémité 3 de la molécule par l'enzyme nucléotidyl transférase. Le 3’OH du ribose A est le point de fixation de l'acide aminé spécifique qui doit entrer dans la réaction de polymérisation de la synthèse des protéines.

La méthylation des précurseurs d'ARNt de mammifères se produit dans le noyau, mais le clivage et la fixation de C-C-A sont des fonctions cytoplasmiques. La fixation des acides aminés aux résidus C-C-A nécessite les enzymes dans le cytoplasme des cellules de mammifères.


Rôle biologique

Les agents endogènes et environnementaux modifient continuellement l'ADN génomique, entraînant des dommages physiques ou des modifications qui entraînent des niveaux à l'état d'équilibre de 50 000 sites apuriniques/apyrimidiniques (AP) par cellule eucaryote. 4 sites AP sont générés par dépurination spontanée ou hydrolyse enzymatique spécifique de la lésion du N-liaison glycosylée entre le désoxyribose et la base. Le taux de dépuration spontanée a été estimé à � 4 dépurations par cellule et par jour. 5 La voie de réparation par excision de base (BER) (Figure ​ (Figure1) 1 ) est responsable de l'élimination des lésions de base simples et des sites AP dans l'ADN. Pol β contribue à deux activités enzymatiques, la synthèse d'ADN et la désoxyribose phosphate (dRP) lyase, lors de la réparation des sites AP.

Réparation par excision de la base. La réparation par excision de base implique l'élimination d'un nucléotide endommagé (pointeurs rouges) de l'ADN. Il est remplacé par un nucléotide non endommagé (pointeurs verts). La base endommagée est éliminée par une ADN glycosylase spécifique aux dommages (1) qui hydrolyse la liaison N-glycosidique entre le désoxyribose et la base endommagée. Dans cette image, l'uracile serait éliminé par l'uracile ADN glycosylase. L'endonucléase AP 1 incise le squelette sucre–phosphate 5′ jusqu'au site AP (2). Le domaine lyase de pol β (3) supprime le groupe 5′-dRP (pointeur rouge) et le domaine polymérase insère un nucléotide dans une réaction dépendante de la matrice (pointeur vert). L'ADN ligase (4) scelle l'ADN entaillé, ce qui entraîne la restauration de la structure d'ADN d'origine.

Les sites AP représentent des lésions potentiellement dangereuses car elles peuvent être mutagènes et cytotoxiques. L'endonucléase AP 1 incise le site AP, ce qui donne des terminaisons 3′-hydroxyle et 5′-dRP. Le groupe dRP est excisé par l'activité lyase de la pol β, ce qui donne un 5′-phosphate et un trou d'un nucléotide (c'est-à-dire une seule base de modélisation). Pol β comble cette lacune à un seul nucléotide, ce qui entraîne un ADN coupé qui sera ensuite ligaturé pour restaurer la structure native de l'ADN.

Comme discuté en détail ci-dessous et ailleurs, 6,7 pol β et d'autres membres de la famille X des ADN polymérases ont évolué pour combler de courtes lacunes dans l'ADN lors de transactions cellulaires essentielles. Dans un système modèle murin, la perte de pol β entraîne une létalité embryonnaire, cependant, les fibroblastes embryonnaires de souris cultivés sont viables. 8 Ces cellules sont hypersensibles aux toxiques génomiques en raison de l'accumulation d'intermédiaires de réparation cytotoxiques. 9 En plus de ses activités enzymatiques, pol β interagit physiquement avec d'autres facteurs clés du BER qui accélèrent la réparation sur les sites AP. dix

Le rôle fondamental que joue pol β dans le BER et la synthèse d'ADN haute fidélité de remplissage implique pol β et BER en tant que suppresseurs de tumeurs. 11,12 Conformément à cette idée est l'observation qu'un pourcentage élevé de tumeurs ont des variantes de pol β. Ceux-ci ont souvent une fidélité altérée ou des activités catalytiques et peuvent induire une transformation cellulaire. 13 Beaucoup de ces variantes ont des changements d'acides aminés qui sont éloignés des sites actifs de la polymérase ou de la lyase. Il reste à voir si ces altérations affectent les interactions protéiques critiques nécessaires à un BER efficace ou le comportement dynamique critique des protéines qui influence l'activité catalytique et/ou la fidélité (voir ci-dessous).


Formation de liaisons phosphodiester

Dans la formation de phosphodiester, deux groupes  hydroxyle (OH) sur la molécule de phosphate se lient aux carbones 3' et 5' sur deux sucres pentose indépendants. Ce sont deux réactions de condensation, donc deux molécules d'eau sont produites. Le phosphate est alors lié aux sucres par deux liaisons ester, d'où la nomenclature de liaison phosphodiester. Cette réaction est catalysée par des ligases, telles que l'ADN ligase lors de la réplication de l'ADN.

Une représentation de la réaction est montrée dans le diagramme ci-dessous.


Liaison phosphodiester

UNE liaison phosphodiester se produit lorsque exactement deux des groupes hydroxyle de l'acide phosphorique réagissent avec des groupes hydroxyle sur d'autres molécules pour former deux liaisons ester. Le "lien" implique ce lien C-O-PO2 − -O-C. [1] La discussion sur les phosphodiesters est dominée par leur prévalence dans l'ADN et l'ARN, mais les phosphodiesters sont présents dans d'autres biomolécules, par ex. protéines porteuses d'acyle.

Les liaisons phosphodiester constituent les squelettes de l'ADN et de l'ARN. Plus précisément, la liaison phosphodiester relie l'atome de carbone 3' d'une molécule de sucre et l'atome de carbone 5' d'une autre. Ces groupes saccharidiques sont dérivés du désoxyribose dans l'ADN et du ribose dans l'ARN. Les phosphodiesters sont chargés négativement à pH 7. [2] La répulsion entre ces charges négatives influence la conformation des acides polynucléiques. La charge négative attire les histones, les cations métalliques tels que le magnésium et les polyamines.

Pour que la liaison phosphodiester soit formée et que les nucléotides soient joints, les formes triphosphate ou diphosphate des blocs de construction nucléotidiques sont séparées pour dégager l'énergie nécessaire pour entraîner la réaction catalysée par l'enzyme. [3]

L'hydrolyse des liaisons phosphodiester est catalysée par les phosphodiestérases, qui sont impliquées dans la réparation des séquences d'ADN. [4]

La liaison phosphodiester entre deux ribonucléotides peut être rompue par hydrolyse alcaline, alors que la liaison entre deux désoxyribonucléotides est plus stable dans ces conditions. La facilité relative de l'hydrolyse de l'ARN est un effet de la présence du groupe 2' hydroxyle.

Une phosphodiestérase est une enzyme qui catalyse l'hydrolyse des liaisons phosphodiester, par exemple une liaison dans une molécule d'AMP cyclique ou de GMP cyclique.

Une enzyme qui joue un rôle important dans la réparation des dommages oxydatifs de l'ADN est la 3'-phosphodiestérase.

Au cours de la réplication de l'ADN, il existe un trou entre les phosphates dans le squelette laissé par l'ADN polymérase I. L'ADN ligase est capable de former une liaison phosphodiester entre les nucléotides.


Séquences d'insertion

Stratégies de transposition

Le clivage endonucléolytique des liaisons phosphodiester aux extrémités IS et leur transfert dans une molécule d'ADN cible nécessitent généralement l'assemblage d'un complexe synaptique comprenant la Tpase, les deux extrémités et l'ADN cible. Dans la transposition classique, il existe deux principaux modes de transposition, conservateur et réplicatif, selon que l'élément est copié ou non lors de son déplacement. Cela dépend de la nature et de l'ordre des clivages aux extrémités ( Figure 2 ) : si le transposon est libéré de son squelette donneur par des clivages double brin ou s'il reste attaché suite au clivage d'un seul brin. Les réactions de clivage de l'ADN et de jonction de brins de nombreux éléments transposables avec les DDE Tpases sont remarquablement similaires. Ils catalysent le clivage endonucléolytique à chaque extrémité 3' du transposon pour libérer les groupements 3' OH, qui sont ensuite utilisés dans une attaque nucléophile concertée sur la molécule cible.

Figure 2 . Principales stratégies de transposition. L'ADN de transposon est indiqué par des cases ouvertes ou des cases ombrées pour l'ADN de transposon nouvellement répliqué. L'ADN du donneur est indiqué par des lignes pointillées et l'ADN cible par des lignes en gras. Le clivage des brins est représenté par de petites flèches verticales. L'attaque nucléophile de la liaison phosphodiester, P, par l'hydroxyle 3' actif (3'OH) entraînant un transfert de brin est également indiquée par des flèches. La région dentée montrée dans l'ADN cible représente les duplications cibles associées à l'insertion. La polarité de l'ADN est indiquée en haut de chaque panneau. Notez que dans le cas de l'IS91 On pense que le mécanisme de transposition se produit par un mécanisme de cercle roulant. La polarité de l'ADN cible a été inversée pour faciliter le dessin de la figure.

Une caractéristique importante de la transposition est la manière dont l'extrémité 5' (deuxième brin) est traitée. La transposition réplicative implique le clivage d'un seul brin à chaque extrémité de transposon et les transferts dans un site cible pour créer une fourche de réplication ( Figure 2 ). Certains SI ne semblent pas traiter le deuxième brin et subissent simplement une transposition réplicative, ou, plus précisément, une intégration réplicative ( Figure 2 (une)). Si la transposition est intermoléculaire, la réplication à partir de la ou des fourches naissantes génère des cointégrations (fusions de réplicons), où les réplicons donneurs et cibles sont joints mais séparés par une copie directement répétée de l'élément à chaque jonction. La résolution de ces structures pour régénérer les molécules donneuses et cibles, chacune portant une seule copie de l'élément, est accomplie par recombinaison entre les deux éléments. This proceeds for some transposons by site-specific recombination using a specialized transposon-specific enzyme distinct from the Tpase, the resolvase (e.g., Tn3 family), or is taken in charge by the host homologous recombination system.

In conservative or cut-and-paste transposition, the element is excised from (or replicated out of) the donor site and reinserted into a target site. This implies cleavage of both DNA strands at the ends of the element and their rejoining to target DNA to generate a simple insertion. The original donor DNA molecule is either degraded or repaired by host-specified enzymes. Different IS elements have adopted various strategies to separate themselves from the donor DNA backbone. Some of these are shown in Figure 2 .

It has been possible to experimentally convert the transposition pathway of some elements from a cut-and-paste mode to a cointegrate mode by simple mutation, illustrating the subtle flexibility of the reactions and providing some hints as to the evolution of these pathways.

Of those ISs not belonging to the DDE group, transposition of IS608 and ISDra2, both members of the IS200/IS605 family, is understood in detail ( figure 3 ). Their Tpases (TnpA) are Y1 Tpases of the HUH endonuclease superfamily. They use a single catalytic tyrosine as a nucleophile for strand cleavage and transfer. TnpA acts as a dimer, recognizes the subterminal hairpin structures at both ends on a specific strand (defined as the top strand). In contrast to the DDE enzymes, which do not form covalent enzyme–substrate intermediates, TnpA creates a 5′ phosphotyrosine covalent intermediate on DNA cleavage: with the left end of the IS and with the DNA flank at the right ends. Strand transfer then excises the IS as a single (top)-strand circle rejoining the left and right DNA donor flanks. The single-strand circle then integrates into a suitable target. This class of ISs, requiring single-strand DNA, shows preferential excision from and integration into the lagging strand of replication forks and other regions of single-strand DNA such as those produced during fragmentation and reassembly of the Déinocoque radiodurans genome following irradiation. Insertion occurs 3′ to a specific tetra- or pentanucleotide which is also required for further transposition.

EST91 appears to have adopted a polarized rolling circle transposition mode (as suggested by the similarity of its Tpase with rolling-circle-type replicases). Like IS608 and ISDra2, it requires a specific tetranucleotide target sequence that abuts IRR ( Figure 2 ). One-ended transposition products occur at high frequency in the absence of IRL. They carry a constant end defined by IRR and a variable end defined by a copy of the target consensus located in the donor plasmid. It is thought that donor strand cleavage results in a covalent complex between the 5′ IRR end and Tpase and is followed by single-strand transfer into the target DNA at a site containing a consensus tetranucleotide. The attached single strand of the IS is displaced by replication in the donor molecule. Termination is triggered when the complex reaches either the 3′ IRL end or a tetranucleotide consensus sequence in the donor ( Figure 2 ). This scheme does not, however, address how the element is replicated into the target molecule.


Supplementary Figure 1 Kinetics of I-DmoI cleavage under single-turnover conditions.

UNE) pH 8/65ºC and B) pH6/40ºC. First-order rate constants (k*) are plotted against I-DmoI initial concentrations ([I-DmoI]0). The correlation coefficients (R) corresponding to the curve fitting to the equation describing k* as a function of [I-DmoI]0 and the estimated kinetic parameters k*max et K M* are shown in the chart. One gel for each assay is presented as an example of the experimental data.

Supplementary Figure 2 Superposition of the active centers of I-DmoI in the presence of Mg 2+ or Mn 2+ .

Each structure is colored according to the nature of the present divalent ions. UNE) The initial state of the reaction previously obtained in the presence of the non-catalytic metal Ca 2+ (PDB Code 2VS7) is superimposed with the initial experimental state obtained in this manuscript. The rmsd (root mean square deviation) of the atoms in the active centre is 0.2 Å. B) Detailed view of the active centre comparing the conformation of the state 2. The DNA phosphodiester bonds are still intact and sites A and B are occupied with the metal, Mg 2+ or Mn 2+ depending on the soaking. The rmsd of the atoms in the active centre is 0.1 Å. C) A similar detailed view of the enzyme catalytic centre in state 7. This is the final state where both DNA strands are cleaved in the same way independently of the metal used in the experiment (Mg 2+ or Mn 2+ ), and the metal is found in sites A and B. The rmsd of the atoms in the active centre is 0.1 Å. The Mg 2+ structures were solved at 2.20 and 2.35 Å resolution for states 2 and 7 respectively.

Supplementary Figure 3 PELE simulation results: interaction energies (kcal/mol) versus distance (Å) for the Mn 2+ ions’ entrance along the channel formed in the I-DmoI–DNA interface.

A different colour is used for the interaction energies obtained for the independent 127 PELE trajectories. Distances are relative to reference positions (i.e. in PDB structures). Positions of binding sites A, B and C are highlighted with blue circles. Graphs correspond to: A-B) modelling of Mn 2+ binding to site A when no ions are previously located in the active site C-D), modelling of Mn 2+ binding to site B when no ions are previously bound in the active site E-F), modelling of Mn 2+ binding to site B when there is an ion bound in site A and G-H), modelling of Mn 2+ binding to site C when there are ions bound in sites A and B. The green and grey spheres in Figures B, D, F. H are used to show the reference positions and the places visited by the Mn 2+ ions throughout the PELE ‘effective’ trajectories (.i.e. corresponding to simulations where the ions accessed the active site).

Supplementary Figure 4 PB calculations in the structure corresponding to the first stage of the catalytic process of I-DmoI.

UNE) Electrostatic potential visualization of the surface in complex I-DmoI/DNA. The arrow indicates the aperture of the channel in the protein/DNA interface where site A is located. The DNA double helix is highlighted in yellow. B) Calculated Molecular Interaction Potential (MIP) using Mn 2+ as probe for the structure corresponding to the initial stage of catalysis (state 1). The black mesh corresponds to the calculation assuming that no divalent ions are bound to I-DmoI. The red mesh corresponds to the calculation assuming that Mn 2+ ions were previously bound to sites A and B. The 100 points of highest interaction energy (electrostatic + Van der Waals) are depicted in each case. The Mn 2+ atoms are represented as black spheres and the residues involved in their coordination are shown. Notice that site C is predicted to bind Mn 2+ even when divalent ions are previously bound to sites A and B. Panels C and D depict the Potential Energy Surface (PES) at the QM(BP86/SVP)/MM(AMBER) level of theory corresponding to the movement of a divalent ion from site A or B to C. C) The divalent ion was modelled as Mg 2+ . The 90 atoms considered in the QM partition are highlighted. The starting structure in the calculations is depicted in RÉ), where black and red arrows indicate the displacements modelled from site A to C or B to C, respectively. Note that only one ion was present in the calculations, which is initially bound to sites A or B. QM/MM calculations show that there would be an energy barrier of

15-20 kcal/mol associated with the displacement of the ion from A or B to C. Therefore, if an ion initially binds to A or B it would be probably trapped there instead of moving to C.

Supplementary Figure 5 Accumulation of the nicked product in the K120M mutant.

UNE) The K120M mutation disturbs double strand cleavage allowing the accumulation of nicked plasmid. 2 nM of supercoiled plasmid DNA target was incubated with 100 nM of wild type I-DmoI or 50, 100 nM of I-DmoI K120M mutant at pH 8, 65 ºC for 30 min. B) Nicked oligonucleotides labeled with 6-FAM (C and NC) were used to determine which DNA strand is affected by the K120M mutation in I-DmoI. Oligonucleotide and protein at 750 nM were incubated at pH 8, 65 ºC for 30 min. The left panel of the gel displays NC and C substrates in the absence of enzyme determining the non-cleaved status of the probes. In the right panel of the gel NC and C were incubated with I-DmoI K120M showing that the mutant activity to digest the intact coding strand in target C is normal however, the mutant activity was affected when the NC probe (containing the intact non-coding strand) was used in the assay.

Supplementary Figure 6 Potential energy surface at the QM(B3LYP/SVP) level, considering a direct nucleophilic attack of a hydroxyl ion on the target phosphate group.

The same model depicted in Supplementary Figure 7A was considered [RC: Reaction Coordinate (combination of interatomic distances considered to model the reaction of interest)]. After optimization of the initial structure, a penta-coordinated phosphorous intermediate (similar to the one obtained in first step of the mechanism depicted in Supplementary Figure 7) is obtained, later this intermediate easily evolves to the final hydrolytic products (reaction energy of -32.7 kcal/mol at the QM(B3LYP/6-311++G(d,p)//B3LYP/SVP) level of theory). However, the distance between the O3’ leaving atom and the phosphate group as well as the pattern of coordination of metals in sites B and C are inconsistent with the crystallographic structures corresponding to states 5 to 7 of the catalytic mechanism of I-DmoI.

Supplementary Figure 7 QM(B3LYP/SVP) calculations in a model of the I-DmoI active site, considering a proton transfer between the nucleophilic water molecule and the O3′ leaving group.

UNE) The model considered (110 atoms) was based on the structure corresponding to time 8h (state 3). B) Potential Energy Surface (PES) of a first step where the target phosphate group deprotonates the incoming water molecule and renders a penta-coordinated phosphorous intermediate. The associated energy barrier and reaction energy of this step at the QM(B3LYP/6-311++G(d,p)//B3LYP/SVP) level are 24.8 and 20.4 kcal/mol respectively. C) PES corresponding to the final nucleophilic attack of the resulting hydroxyl ion and the protonation of the O3’ leaving group. The reaction energy considering the final product and the reactants is 1.0 kcal/mol at the QM(B3LYP/6-311++G(d,p)//B3LYP/SVP) level of theory RC: Reaction Coordinate (combination of interatomic distances considered to model the reaction of interest). RÉ) Superimposition of the structure corresponding to the last stage of the catalytic process (state 7) after replacing the water in site C by Mg 2+ and the same structure optimized at level QM(B3LYP/SVP)/MM(AMBER). The pre-optimized structure is depicted in dark gray. Notice that E117 is not coordinating the ion in C in the optimized structure, which negatively impacts its binding affinity.


Biotechnology Principles And Processes MCQ NEET Important Questions – Answer Keys

1) C. DNA ligase is genetic or DNA adhesive – a specific type of enzyme, a ligase, (EC 6.5.1.1) that facilitates the joining of DNA strands together by catalyzing the formation of a phosphodiester bond.

2) A. A selectable marker is a gene introduced into a cell, especially a bacterium or to cells in culture, that confers a trait suitable for artificial selection.

3) C. Recombinant human insulin has been produced predominantly using E. coli for therapeutic use in human.

4) D. DNA fingerprinting is a method used to identify an individual from a sample of DNA by looking at unique patterns in their DNA. restriction fragment length polymorphism, or RFLP, is a technique
that exploits variations in homologous DNA sequences. It refers to a difference between samples of homologous DNA molecules from differing locations of restriction enzyme sites

5) D. It acts in alkaline medium and binds to epithelial cells of midgut

6) A. Plasmids that can transfer foreign DNA into a living cell

8) C. Restriction endonucleases : Chemical knife and ligases: Genetic gum

9) A. Genes that confer resistance to various antibiotics are used as selective markers in cloning vectors. Normally the genes encoding resistance to antibiotics such as ampicillin, chloroamphenicol, tetracycline or kanamycin, etc., are considered useful selectable markers for E. coli.

10) A. The crude oil degradation –> Pseudomonas putida.

11) D. Bam HI, Eco RI & Hind III are restriction endonuclease pBR322 is plasmid of E.coli

12) A. Ti (tumor-inducing) plasmid based vectors are high efficiency vectors and were developed with the aim of introducing genes into plants.Agrobacterium tumefaciens causes crown gall disease
in plants in which cells grow in anundifferentiated and uncontrolled manner to form a tumor.

13) D. Retroviruses used as Vector

14) D. Plasmid used as vectors

15) C. rDNA technology is genetic engineering

16) A. Formation of phosphodiester bond between two DNA fragments

17) C. Entamoeba coli is a protozoa

18) C. Extension of primer end on the template DNA

19) A. Human gene may have intron which bacteria cannot process

20) C. A continuous culture system

23) A. A device in which substances are treated to stimulate biochemical transformation by living cells

24) C. It involves manipulation of two DNAs

25) D. The cell is treated with a specific concentration of a divalent cation such as calcium to increase pore size in cell wall.

26) D. All of these required for PCR

27) D. A phosphodiester bond within a specific sequence

28) B. Tetracycline resistance

29) C. It requires simultaneous plating on two plates having different antibiotics

30) A. The proteins involved in the replication of the plasmid

32) C. Chromogenic substrate gives blue colour The rDNA or recombinant DNA is inserted within the coding sequence of the enzyme galactosidase. This results in inactivation of the enzyme. In the presence of chromogenic substrate, blue coloured colonies are produced if the plasmid in the
bacteria doesn’t have the insert i.e. those are non recombinant.

36) B. Transformation of plant cells

37) A. As selectable markers

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16.1. Determining the Nature of DNA

The isolation of Nuclein

Modern understandings of DNA have evolved from the discovery of nucleic acid to the development of the double-helix model. In the 1860s, Friedrich Miescher (Figure 16.2), a physician by profession, was the first person to isolate phosphate-rich chemicals from white blood cells or leukocytes. He named these chemicals (which would eventually be known as RNA and DNA) nuclein because they were isolated from the nuclei of the cells.

To see Miescher conduct an experiment step-by-step, click through this review of how he discovered the key role of DNA and proteins in the nucleus.

Griffith and Bacterial Transformation

A half century later, British bacteriologist Frederick Griffith was perhaps the first person to show that hereditary information could be transferred from one cell to another “horizontally,” rather than by descent. In 1928, he reported the first demonstration of bacterial transformation, a process in which external DNA is taken up by a cell, thereby changing morphology and physiology. He was working with Streptococcus pneumoniae, the bacterium that causes pneumonia. Griffith worked with two strains, rough (R) and smooth (S). The R strain is non-pathogenic (does not cause disease) and is called rough because its outer surface is a cell wall and lacks a capsule as a result, the cell surface appears uneven under the microscope. The S strain is pathogenic (disease-causing) and has a capsule outside its cell wall. As a result, it has a smooth appearance under the microscope. Griffith injected the live R strain into mice and they survived. In another experiment, when he injected mice with the heat-killed S strain, they also survived. In a third set of experiments, a mixture of live R strain and heat-killed S strain were injected into mice, and—to his surprise—the mice died. Upon isolating the live bacteria from the dead mouse, only the S strain of bacteria was recovered. When this isolated S strain was injected into fresh mice, the mice died. Griffith concluded that something had passed from the heat-killed S strain into the live R strain and transformed it into the pathogenic S strain, and he called this the transforming principle (Figure 16.3). These experiments are now famously known as Griffith’s transformation experiments.

Scientists Oswald Avery, Colin MacLeod, and Maclyn McCarty (1944) were interested in exploring this transforming principle further. They isolated the S strain from the dead mice and isolated the proteins and nucleic acids, namely RNA and DNA, as these were possible candidates for the molecule of heredity. They conducted a systematic elimination study. They used enzymes that specifically degraded each component and then used each mixture separately to transform the R strain. They found that when DNA was degraded, the resulting mixture was no longer able to transform the bacteria, whereas all of the other combinations were able to transform the bacteria. This led them to conclude that DNA was the transforming principle.

DNA, Not Proteins, is the Genetic Material

Experiments conducted by Martha Chase and Alfred Hershey in 1952 provided confirmatory evidence that DNA was the genetic material and not proteins. Chase and Hershey were studying a bacteriophage, which is a virus that infects bacteria. Viruses typically have a simple structure: a protein coat, called the capsid, and a nucleic acid core that contains the genetic material, either DNA or RNA. The bacteriophage infects the host bacterial cell by attaching to its surface, and then it injects its nucleic acids inside the cell. The phage DNA makes multiple copies of itself using the host machinery, and eventually the host cell bursts, releasing a large number of bacteriophages. Hershey and Chase labeled one batch of phage with radioactive sulfur, 35 S, to label the protein coat. Another batch of phage were labeled with radioactive phosphorus, 32 P. Because phosphorous is found in DNA, but not protein, the DNA and not the protein would be tagged with radioactive phosphorus.

Each batch of phage was allowed to infect the cells separately. After infection, the phage bacterial suspension was put in a blender, which caused the phage coat to be detached from the host cell. The phage and bacterial suspension was spun down in a centrifuge. The heavier bacterial cells settled down and formed a pellet, whereas the lighter phage particles stayed in the supernatant. In the tube that contained phage labeled with 35 S, the supernatant contained the radioactively labeled phage, whereas no radioactivity was detected in the pellet. In the tube that contained the phage labeled with 32 P, the radioactivity was detected in the pellet that contained the heavier bacterial cells, and no radioactivity was detected in the supernatant. Hershey and Chase concluded that it was the phage DNA that was injected
into the cell and carried information to produce more phage particles, thus providing evidence that DNA was the genetic material and not proteins (Figure 16.4).

Nucleotide Experiments of Chargaff

Around this same time, Austrian biochemist Erwin Chargaff examined the content of DNA in different species and found that the amounts of adenine, thymine, guanine, and cytosine were not found in equal quantities, and that it varied from species to species, but not between individuals of the same species. He found that the amount of adenine equals the amount of thymine, and the amount of cytosine equals the amount of guanine, or A = T and G = C. This is also known as Chargaff’s rules. This finding proved immensely useful when Watson and Crick were getting ready to propose their DNA double helix model.


DNA Replication, Transcription & Translation

Whenever cells divide, they need to make an extra copy of their DNA through DNA replication. DNA gives our cells the ‘instructions’ to make proteins - the things which do the work in our cells and include enzymes, hormones and channel proteins. DNA is converted into protein in two processes which sound annoyingly similar - transcription and translation.

Semi-conservative DNA replication

During cell division, cells need to make a complete copy of their genetic information. When DNA is replicated, the new DNA molecule is made up of one strand of the original DNA whereas the other strand is made of freshly made DNA. Since half of the DNA is preserved from the previous round of DNA replication, we describe the process as semi-conservative. It takes place in the following stages:

DNA helicase unwinds the double helix, breaking the hydrogen bonds between complementary base pairs to separate the strands. One of the strands will act as a modèle for synthesis of the other strand.

Complementary nucleotides will attach to the template strand by hydrogen bonding.

ADN polymérase catalyses the formation of liaisons phosphodiester between nucleotides, forming a complementary strand alongside the template parent strand.

Deux daughter DNA molecules are formed, each containing demi du original DNA molecule.

It is important that DNA polymerase accurately copies the template strand to avoid placing the wrong DNA nucleotide in the incorrect position. To avoid this, DNA polymerase ‘proofreads’ the complementary strand as it moves along the DNA. If it detects a mismatch, it can ‘snip out’ the wrong nucleotide and replace it with the right one. DNA polymerase has an accuracy rate of about 99%, which means that mistakes do occur every once in a while. A mistake results in a change to the DNA base sequence, which is known as a mutation. DNA mutations can have detrimental effects to the organism, since an altered base sequence can change the sequence of amino acids in a protein, causing it to fold differently and possibly lose its function.

Meselson and Stahl’s Experiment

The evidence that DNA replication is semi-conservative comes from a pretty clever experiment carried out by Matthew Meselson and Franklin Stahl. Before this, scientists were unsure whether DNA replication was conservative or semi-conservative. If DNA replicated conservatively, the original DNA strands would remain intact and the newly synthesised DNA would consist of two freshly-made strands.

To figure this out they used a heavy isotope of nitrogen (N-15) which has an extra neutron compared to the normal, lighter form of nitrogen (N-14). Ils grew bacteria in the presence of the heavy nitrogen and any new DNA that the bacteria made would incorporate this isotope and so would weigh heavier. If DNA replicates conservatively, Meselson and Stahl knew that they’d see some DNA made of just heavy nitrogen with the rest made of only light nitrogen, but if it replicated semi-conservatively it would be a mixture of the two isotopes. Here’s how they carried out the experiment in more detail:

Two populations of bacteria were grown - one in a solution containing heavy nitrogen and the other in a solution containing light nitrogen. As the bacteria grow and reproduce, they incorporate the nitrogen into their ADN.

DNA was extracted from the bacteria and centrifuged to separate the DNA according to its poids. The DNA from the bacteria grown in N-15 separated at a higher density (a band lower down the test tube) compared to the DNA from the bacteria grown in N-14.

The scientists then took the bacteria that had been growing in N-15 (which now just contains heavy DNA) and grew them in the light isotope N-14. Again, they extracted their DNA and separated it using centrifugation.

Après le first round of DNA replication, they saw just one band of DNA which was an intermediate weight between 14-N and 15-N. This indicates that the DNA was made up of both types of nitrogen isotopes (i.e. one old strand and one newly synthesised strand).

Après le second round of DNA replication, there was now 2 bands of DNA. One band has an intermediate weight but further newly synthesised DNA is now only being made using the lighter isotope. This proved that DNA is replicated semi-conservatively.

If DNA replication is conservateur, Meselson and Stahl would have seen two bands of DNA (one heavy and one light) after both the first and second rounds of replication.



Commentaires:

  1. Viljo

    c'est ponctuel

  2. Panteleimon

    Votre phrase est incomparable ... :)

  3. Yozshuzuru

    Ne pas dire que c'est plus.

  4. JoJojora

    Je suis désolé, je ne peux rien aider, mais il est assuré que vous aideront nécessairement. Ne désespérez pas.

  5. Dosida

    Oui !!!! pas de mots

  6. Daron

    C'est agréable, cette magnifique pensée doit être précisément à dessein



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