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Pourquoi dois-je dégazer ma solution gel pour gels de polyacrylamide ?

Pourquoi dois-je dégazer ma solution gel pour gels de polyacrylamide ?


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Dans les protocoles d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE), je vois souvent des instructions pour dégazer la solution de gel en la mettant sous vide pendant 10 à 15 minutes avant de polymériser le gel.

Je ne fais généralement pas cela, et quand je l'ai essayé une fois, je n'ai pas vu de différence. Je me demande donc à quoi sert exactement le dégazage et quelle devrait être l'ampleur de l'effet.

  • Quel effet est censé avoir le dégazage de la solution de gel ?
  • Quelle est l'importance du dégazage pour obtenir de bons gels ?

Toute littérature qui examine l'effet du dégazage serait appréciée.


La raison du dégazage de vos gels est d'éliminer l'oxygène. L'oxygène dans le gel interfère avec la polymérisation, la ralentit et la rend moins consistante, donc le dégazage la rend plus rapide et plus uniforme.

A partir du protocole EncorBio SDS-PAGE :

La polymérisation est plus rapide et plus uniforme si vous dégazez les trois premières solutions pendant quelques minutes dans un ballon Ehrlenmeyer sous vide domestique avant d'ajouter les trois derniers réactifs. L'oxygène moléculaire inhibe la polymérisation en réagissant avec le radical libre SO4- ions, ce qui est en fait la raison pour laquelle les gels PAGE sont versés dans des tubes ou entre des plaques et non dans des appareils horizontaux à toit ouvert, comme cela peut être fait avec l'agarose. C'est aussi une bonne idée de superposer un peu d'isopropanol sur le gel car cela empêche l'oxygène de pénétrer et inhibe la polymérisation.

L'oxygène peut également conduire à l'oxydation des produits protéiques, ce qui peut être crucial si vous souhaitez ensuite extraire les produits et les utiliser pour autre chose (par exemple, Sun & Anderson, 2004).

Enfin, avoir des bulles dans votre gel peut fausser les résultats et les rendre moins reproductibles, car les bulles ne se formeront pas de manière cohérente à chaque répétition et elles perturbent le support physique du polyacrylamide. Un autre objectif du dégazage est donc d'assurer la répétabilité.

La fiche d'information sur la polymérisation de l'acrylamide Bio-Rad contient les meilleures informations que j'ai pu trouver :

La formation de gels de polyacrylamide se fait par polymérisation radicalaire. La réaction est donc inhibée par tout élément ou composé servant de piège à radicaux libres (Chrambach 1985). L'oxygène est un tel inhibiteur. L'oxygène, présent dans l'air, dissous dans des solutions de gel ou adsorbé sur les surfaces de plastique, caoutchouc, etc., inhibera et, dans des cas extrêmes, empêchera la polymérisation de l'acrylamide. Un dégazage correct est essentiel pour la reproductibilité. Par conséquent, l'une des étapes les plus importantes de la préparation des gels de polyacrylamide est l'évacuation ou le « dégazage » des solutions de gel immédiatement avant de verser le gel. Cela se fait en plaçant le flacon de solution de gel dans une chambre à vide ou sous un aspirateur puissant. Dans certains cas, une pompe à vide peut être nécessaire.

Les solutions mères tampons et les solutions mères de monomères sont généralement conservées à 4°C. Les solutions froides ont une plus grande capacité d'oxygène dissous. Le processus de dégazage est plus rapide et plus complet si la solution de gel est portée à température ambiante (23-25°C)' avant le début du dégazage. De plus, si une solution de gel froid est mise sous vide, le processus d'évacuation tend à maintenir la solution froide. Verser un gel avec une solution froide aura un effet négatif important sur la vitesse de polymérisation et sur la qualité du gel résultant.

La polymérisation dans laquelle la riboflavine est utilisée comme l'un des initiateurs nécessite un dégazage. La conversion de la riboflavine de la forme flavo à la forme leuco (l'espèce active dans l'initiation) nécessite en fait une petite quantité d'oxygène (Gordon 1973).

Ceci explique pourquoi la polymérisation initiée principalement par la riboflavine peut être complètement bloquée par un dégazage exhaustif. Cependant, un excès d'oxygène par rapport à celui nécessaire pour convertir la riboflavine en sa forme active inhibera l'allongement de la chaîne polymère, comme il le fait dans les réactions initiées uniquement par le persulfate d'ammonium et le TEMED. Ainsi, si le dégazage reste important pour limiter l'inhibition, il ne doit pas être si important qu'il empêche la conversion de la riboflavine en forme active. Pour la polymérisation initiée par les systèmes riboflavine/TEMED ou riboflavine/TEMED/persulfate d'ammonium, le dégazage ne doit pas dépasser 5 min.

Une conséquence de l'interaction de la riboflavine avec l'oxygène est que la riboflavine semble agir comme un capteur d'oxygène. Ceci est corroboré par l'observation que l'ajout de riboflavine (5 µg/ml) à des solutions de gel empilées contenant du persulfate d'ammonium/des initiateurs TEMED entraîne une polymérisation plus propre et plus uniforme sur les surfaces de gel exposées à l'oxygène (comme les peignes). Le même effet pourrait probablement être obtenu par un dégazage plus poussé des solutions sans riboflavine.

Qu'il s'agisse d'une polymérisation chimique (persulfate d'ammonium/TEMED) ou d'une polymérisation photochimique (initiateurs riboflavine/TEMED ou riboflavine/TEMED/persulfate d'ammonium), la qualité reproductible du gel et les caractéristiques de séparation nécessitent une attention particulière à la température de la solution de gel avant le dégazage, et au temps de dégazage, la température, et vide. Ces paramètres doivent être maintenus constants chaque fois que les gels sont préparés.

Désolé pour les longues citations, mais elles sont collées ici au cas où les sources originales disparaîtraient.

Les références:


J'ai récemment utilisé des gels avec différents ratios Acrylamide/Bisacrylamide. Les gens travaillent généralement avec des ratios 1:37,5, 1:29 qui sont couramment utilisés pour les gels d'ADN et de protéines. J'ai remarqué que lorsque vous travaillez avec des ratios inférieurs 1:200 - 1:500, le dégazage devient fondamental pour garantir une résolution reproductible de mes protéines. Si je ne dégaze pas le mélange dans l'un de ces gels, certaines des protéines que je résout (qui migrent très près les unes des autres) ne se sépareront pas assez bien. Aussi, le temps de polymérisation du gel peut aller de 20 à 45 minutes environ si je ne dégaze pas la solution au préalable. Les solutions de dégazage avec des rapports de réticulation normaux de 1:29, 1:37,5 ne semblent pas, d'après mon expérience, avoir beaucoup d'effet autre que d'avoir des temps de polymérisation plus rapides. Cela fait peut-être une différence avec des gels à plus faible concentration (8-5%), mais honnêtement, je ne m'inquiéterais pas trop à ce sujet si j'utilisais régulièrement des gels à 10-15% et que la résolution reproductible n'était pas un problème.


Qu'est-ce qui pourrait empêcher le gel de se polymériser (se solidifier) ? - fabrication de gel (23 juin 2008 )

Est-ce que je manque quelque chose ? L'un des réactifs ci-dessus nécessite-t-il un stockage à une température particulière avant utilisation ? Pourquoi mes gels ne se solidifient-ils pas comme avant ?

Salut à tous. Mes gels running ne durcissent pas. j'ai ajouté

6 mL 30%acrylamide/0,8%bisacrylamide,
3,75 mL pH8,8 tris HCl 3M,
100 ul 20% FDS
5 ml d'eau

Est-ce que je manque quelque chose ? L'un des réactifs ci-dessus nécessite-t-il un stockage à une température particulière avant utilisation ? Pourquoi mes gels ne se solidifient-ils pas comme avant ?

Je vais essayer et je reviens vers vous. tu es potentiellement mon compteur de jour de veille!

Salut à tous. Mes gels running ne durcissent pas. j'ai ajouté

6 mL 30%acrylamide/0,8%bisacrylamide,
3,75 mL pH8,8 tris HCl 3M,
100 ul 20% FDS
5 ml d'eau

Est-ce que je manque quelque chose ? L'un des réactifs ci-dessus nécessite-t-il un stockage à une température particulière avant utilisation ? Pourquoi mes gels ne se solidifient-ils pas comme avant ?

Cellcounter a raison. L'APS est le principal coupable. Il est très important que vous stockiez votre APS sec dans un dessiccateur. Ça ira mal avec le temps si tu ne le fais pas (ça m'est arrivé!)
Claire

Vous aviez raison sur l'argent. Dès que j'ai refait l'APS, j'ai utilisé de l'APS frais et qu'est-ce que tu sais ? Mon gel était dur comme de la pierre (exagérant) en 30 minutes.

Vous aviez raison sur l'argent. Dès que j'ai refait l'APS, j'ai utilisé de l'APS frais et qu'est-ce que tu sais ? Mon gel était dur comme de la pierre (exagérant) en 30 minutes.

Salut à tous. Mes gels running ne durcissent pas. j'ai ajouté

6 mL 30%acrylamide/0,8%bisacrylamide,
3,75 mL pH8,8 tris HCl 3M,
100 ul 20% SDS
5 ml d'eau

Est-ce que je manque quelque chose ? L'un des réactifs ci-dessus nécessite-t-il un stockage à une température particulière avant utilisation ? Pourquoi mes gels ne se solidifient-ils pas comme avant ?

J'ai lu quelque part que trop mélanger le mélange de gel peut provoquer une saturation en oxygène qui entrave ensuite la polymérisation du gel. une vérité là-dedans ?

Salut à tous. Mes gels running ne durcissent pas. j'ai ajouté

6 mL 30%acrylamide/0,8%bisacrylamide,
3,75 mL pH8,8 tris HCl 3M,
100 ul 20% FDS
5 ml d'eau

Est-ce que je manque quelque chose ? L'un des réactifs ci-dessus nécessite-t-il un stockage à une température particulière avant utilisation ? Pourquoi mes gels ne se solidifient-ils pas comme avant ?

J'ai lu quelque part que trop mélanger le mélange de gel peut provoquer une saturation en oxygène qui entrave ensuite la polymérisation du gel. une vérité là-dedans ?

C'est vrai. Mais à moins de le mélanger comme une noix, il devrait finir par polymériser.

L'oxygène atmosphérique est un piégeur de radicaux libres qui élimine les ions SO4 produits par l'APS intrinsèquement instable nécessaire à la polymérisation.

Dans le bon vieux temps, les gens avaient également l'habitude de désaérer le mélange d'acrylamide pour faire polymériser les gels.

J'étais encore en train de désaérer le mélange d'acrylamide pour extraire l'oxygène de la solution l'année dernière (juste au cas où). Mais maintenant, j'ai découvert que ce n'était plus une nécessité. Ils peuvent encore polymériser même sans désaération!


Pourquoi mon gel d'empilage SDS-PAGE ne polymérise-t-il pas ? 23 octobre 2012 18:34 S'inscrire

Mon responsable de laboratoire a décidé que nous allons maintenant verser nos propres gels SDS-PAGE. J'ai sorti l'équipement vieux de plusieurs années et me suis chargé de trouver comment faire cela. Le gel de résolution polymérise bien, mais le gel d'empilement ne va pas plus loin que le goo (et parfois même pas aussi loin).

J'utilise 12% de gel de résolution, 5% de gel d'empilement. Recettes ci-dessous :

Gel résolvant (12%, 1 ml de solution) - Est-ce que polymériser:
334ul DI H2O
250ul 1.5M Tris, pH 8.8
400ul 30% acrylamide/0.8% bis-acrylamide
5ul 20% FDS
10ul 10% APS
1ul TEMED

Gel d'empilage (5%, 1 ml au total) - Fait ne pas polymériser
549ul DI H2O
260ul 0,5M Tris, pH 6,8
170ul 30% acrylamide/0.8% bis-acrylamide
5ul 20% FDS
10ul 10% APS
1ul TEMED

Maintenant, j'ai essayé de doubler et de tripler la quantité d'APS et de TEMED (en diminuant l'eau en conséquence). J'ai même mis en place une série de tests où j'ai fait 5x, 10x et 20x APS et TEMED. Toujours pas de polymérisation.

Les solutions sont à température ambiante. L'APS provient d'une bouteille fraîche et est fraîchement préparée à chaque tentative. TEMED est frais. La seule chose qui n'est pas fraîche sont les réactifs secs Tris, acrylamide et bis-acrylamide. Les solutions elles-mêmes sont fraîches. Les acrylamides auraient-ils mal tourné ? Mais comme je l'ai dit, le gel résolvant à 12% se polymérise.

Les solutions sont faites dans une pièce à lumière jaune, mais lorsqu'elles sont exposées à la lumière blanche, la polymérisation est toujours infructueuse.

Des fabricants de gel expérimentés ont des idées ?

L'oxygène inhibe la polymérisation de l'acrylamide, vous devez donc peut-être dégazer vos solutions. Ou, si les volumes sont trop petits, dégazez l'eau que vous utilisez pour les fabriquer.

Comment éloignez-vous l'air de votre gerbeur ? Le peigne recouvre-t-il complètement le dessus de la solution d'acrylamide ? Si l'un d'entre eux est exposé à l'air, vous pouvez soigneusement superposer du butanol saturé d'eau sur le dessus avec une pipette pasteur, il flottera et constituera une barrière pendant que l'acrylamide polymérise, puis vous pouvez le verser et rincer le gel avec un peu de courant tampon avant de charger vos échantillons.
posté par Quietgal à 19:45 le 23 octobre 2012 [1 favori]

Demandez au responsable du laboratoire de comparer les économies de coûts par rapport au montant d'argent gaspillé en vous payant pour essayer de le mettre en place et de le faire fonctionner, et le travail perdu à cause des retards. Les économies sont probablement déjà plus que compensées.

Je fabrique encore beaucoup de mes propres solutions, etc., mais quand il s'agit de ce genre de choses, mon groupe de laboratoire achète des gels préfabriqués. Pas de soucis de sécurité concernant l'acrylamide non polymérisé, pas de perte de temps, une meilleure consistance et reproductibilité.
posté par attention grenouilles vivantes à 6:52 AM le 24 octobre 2012 [1 favori]

Réponse par affiche : L'achat n'est pas une option, le responsable préférerait que nous passions le temps à le faire fonctionner pour acheter les gels.

J'ai superposé du butanol non saturé d'eau, mais cela n'a fait aucune différence. Dois-je d'abord essayer de le saturer en eau ?
posté par schroedinger à 7:44 AM le 24 octobre 2012

Un mélange de commentaires et de questions qui peuvent être utiles ou non :

-Est-ce que vous mélangez les solutions de gel ? J'inverse mes tubes Falcon pour mélanger un peu l'APS et le TEMED, mais vous ne voulez pas aérer le mélange de gel avec, disons, un vortex.
-Vous dites "Bouteille APS" - Je suppose que vous voulez dire un conteneur avec APS sec, n'est-ce pas, pas une solution ? (Parce qu'il se détériore totalement lorsqu'il est aqueux, et je le fais frais à partir de poudre à chaque fois parce que la vie est trop courte pour passer à nouveau des gels stupides.)
-Combien de temps attendez-vous que le gel d'empilement polymérise ? Un peu plus longtemps ne fait pas nécessairement mal (bon sang, la polymérisation pendant la nuit est même préférable à certains égards, bien que cela puisse être gênant et ne soit pas nécessaire pour les configurations SDS-PAGE standard.) Et un gel d'empilage sera toujours plus gluant qu'un résolvant gel - vous pouvez l'observer lorsque vous démontez les choses après une course afin de pouvoir tacher le gel.
-Vous dites « les solutions sont à température ambiante ». Avez-vous conservé votre solution d'acrylamide à température ambiante ? La solution doit être conservée à 2-8°C. (Dans le noir, de préférence, à moins que vous ne le traversiez rapidement.)
-Vos poudres d'acrylamide ont-elles été stockées dans l'obscurité (pour l'acrylamide ordinaire) ? A 2-8°C (pour le N,N′-Méthylènebis(acrylamide)) ?
-Vos volumes semblent assez petits et avec un rapport d'empilement élevé sur gel de résolution. Si vous utilisez autre chose que des mini-gels de taille plus ou moins standard (par exemple, ceux que vous fabriqueriez pour une plate-forme Bio-Rad Mini-Protean), cela pourrait-il être pertinent ?

Alors que oui, vous pouvez dégazer vos tampons, je n'ai jamais eu besoin de le faire sauf pour les gels de séquençage d'ADN, et je n'ai jamais eu besoin de superposer le dessus de mes empiler gels avec du butanol ou de l'isopropanol. Vous ne devriez pas avoir besoin de recourir à des mesures extrêmes pour la protéine SDS-PAGE standard. Si je devais parier, je parierais que votre acrylamide est incertain (soit en raison des conditions de stockage/de l'âge des poudres ou de la solution), et que le problème est pire dans le gel d'empilement car il contient moins d'acrylamide. Pouvez-vous retirer quelques ml de solution d'acrylamide prémélangée dans un laboratoire voisin qui fait des gels régulièrement, ou acheter 100 ml de Sigma ou de quelqu'un (puisqu'il semble que vous versiez de jolis gels standard, pas des gels Schägger à C% élevé ou autre) ? Cela confirmerait ou infirmerait au moins la possibilité que votre acrylamide soit en cause. Idem pour le Tris, si vous vous sentez paranoïaque.
posté par ubersturm à 9:36 AM le 24 octobre 2012

Meilleure réponse: je ne fais pas que des gels de 1 ml, ce ne sont que des recettes pour 1 ml pour faciliter la comparaison des composants. Le gel d'empilement a été laissé à polymériser pendant la nuit, et il était trop gluant pour que des puits se forment, point final.

pense avoir résolu celui-ci. Les poudres d'acrylamide n'ont pas été stockées dans l'obscurité et ont environ sept ans. J'ai emprunté une solution fraîche d'acrylamide/bis-acrylamide préfabriquée et tout s'est très bien polymérisé. Toutes les informations que j'ai consultées en ligne concernaient les anciens APS et TEMED, mais il semble que l'acrylamide puisse également se détériorer. Merci a tous!
posté par schroedinger à 14:15 le 24 octobre 2012


Comment ça marche?

Il existe plusieurs types de techniques PAGE qui sont utilisées, mais la plus courante est appelée SDS-PAGE. Dans SDS-PAGE, le détergent Dodécyl sulfate de sodium est utilisé pour dénaturer les protéines et normaliser leur rapport masse/charge. Sans SDS, le poids moléculaire et la charge de la protéine affecteraient sa séparation dans le gel. Avec le SDS, seul le poids moléculaire affecte la vitesse de migration et les échantillons se séparent donc en conséquence. La PAGE sans SDS est appelée PAGE native, car les protéines restent dans leur conformation native.

La matrice de gel

Comme pour l'électrophorèse sur gel d'agarose, les échantillons sont séparés à l'aide d'un champ électrique et traversent une matrice de gel qui influence la migration des protéines. Dans PAGE, plutôt que l'agarose, nous utilisons un produit chimique appelé polyacrylamide. La variation du pourcentage de polyacrylamide dans le gel nous permet de modifier la taille des pores du gel, ce qui signifie que nous pouvons séparer différentes tailles de protéines dans différents gels de pourcentage. Les pourcentages de gel typiques sont indiqués dans le tableau ci-dessous.

Pourcentage d'acrylamideRésolution de séparation
5 %60 – 220 Kd
7.5 %30 – 120 Kd
10 %20 – 75 Kd
12%17 – 65 Kd
15 %15 -45 Kd
17.5%12 – 30 Kd

L'acrylamide est normalement vendu sous forme liquide, car la forme en poudre est neurotoxique et dangereuse à manipuler. La polymérisation est obtenue en mélangeant de l'acrylamide avec du bis-acrylamide, ce qui permet aux réticulations de se former entre les molécules d'acrylamide. Des produits chimiques supplémentaires sont ajoutés pour initier la polymérisation, généralement du persulfate d'ammonium comme source de radicaux libres et du TEMED comme stabilisant. Une fois la polymérisation commencée, le gel est versé entre 2 plaques de verre et laissé polymériser complètement.

Le mélange de gel est composé non pas d'eau mais de tampon d'électrophorèse (Tris-HCl), qui fournit les ions pour l'électrophorèse. Souvent, le gel est versé en 2 parties. La première partie est un gel résolvant, avec un pH autour de 8,8 qui ralentit la migration des protéines. Au-dessus du gel de résolution, un gel d'empilement est versé avec un pH de 6,8 et une plus grande taille de pores. Ce gel d'empilement fonctionne pour comprimer les échantillons de protéines en un mince front de migration, de sorte que toutes les protéines de l'échantillon arrivent au gel de résolution en même temps, conduisant à une migration relative précise.

Faire couler le gel

Contrairement à l'électrophorèse sur gel d'agarose, où les gels sont coulés dans des plateaux et exécutés horizontalement, les gels SDS-PAGE sont coulés verticalement à l'aide d'un appareil de coulée. on coule les gels de cette façon pour que les gels d'empilement et de résolution forment un gel continu, ce qui serait beaucoup plus difficile dans un gel horizontal. Il permet également de charger une quantité beaucoup plus importante de protéines sur le gel. Le réservoir de gel est également divisé en 2 sections. Selon le fabricant, le réservoir aura une chambre tampon intérieure (ou supérieure) et une chambre tampon extérieure (ou inférieure). Ces deux chambres sont reliées par le gel pour créer un circuit continu. Chaque chambre contient une électrode, négative dans la chambre intérieure et positive dans la chambre extérieure. La chambre interne est en contact avec le dessus du gel, et lorsqu'un champ électrique est appliqué, les protéines se dirigeront vers l'électrode positive dans la chambre tampon externe, en raison des charges négatives des molécules SDS. Les tampons typiques pour SDS-PAGE sont le Tris-Glycine pour les chambres tampons et le Tris-HCl pour le gel.

La vitesse de déplacement à travers le gel est alors déterminée par le gradient de tension, c'est-à-dire la tension entre les électrodes. L'intensité de champ requise est liée à la taille du réservoir de gel utilisé et la tension requise peut être calculée à l'aide de l'équation simple E = V/d où E est l'intensité du champ, V la tension et d la distance en cm entre les électrodes. Les réservoirs de gel verticaux fonctionnent généralement à 5 - 10 V / cm, donc si votre réservoir a une distance d'électrode de 10 cm, vous utiliserez le gel à 50 - 100 V. La valeur exacte dépend de vos échantillons et doit être déterminée de manière empirique.

Pour appliquer ce champ électrique, nous utilisons une alimentation en courant continu. La plupart des alimentations d'électrophorèse peuvent être réglées pour fournir soit un courant constant, soit une tension constante, chacune ayant des avantages et des inconvénients. Un problème potentiel est la production de chaleur due au flux de courant dans le système, qui peut être particulièrement élevé avec des réservoirs plus grands nécessitant une tension plus élevée. Pour cette raison, il est conseillé d'utiliser une certaine forme de refroidissement, soit passif sous la forme d'un bloc de refroidissement, soit actif tel qu'un refroidisseur à recirculation, pour les systèmes d'électrophorèse plus importants.

Visualiser la protéine

Après la migration, les protéines doivent être visualisées pour déterminer leur longueur et leur abondance. Il existe plusieurs méthodes couramment utilisées pour visualiser des protéines qui sont soit spécifiques, soit non spécifiques. La visualisation non spécifique des protéines cible toutes les protéines, en utilisant des colorants qui se lient aux régions communes des protéines telles que les groupes amino. Des exemples de taches de protéines non spécifiques incluent Coomassie Brilliant Blue et Ruby Pro. Ces taches sont souvent irréversibles et peuvent (mais pas toujours) interférer avec les applications en aval. La coloration non spécifique peut être utile pour quantifier rapidement des échantillons dans un gel ou pour s'assurer qu'un échantillon d'intérêt est présent.

Pour visualiser spécifiquement certaines protéines, nous devons utiliser des anticorps. Les anticorps reconnaissent des structures tridimensionnelles uniques dans la protéine pour les distinguer des autres. En conjuguant l'anticorps avec un colorant ou une enzyme, nous pouvons visualiser uniquement la protéine qu'il reconnaît. Le processus de déplacement des protéines d'un gel à une membrane qui peut être sondée avec des anticorps s'appelle Western Blot. Pour en savoir plus sur le western blot, vous pouvez lire notre article dédié prochainement. Que vous fassiez du western blot ou simplement une coloration non spécifique, vous devrez visualiser les protéines à l'aide du système de documentation sur gel. Le type de système que vous utilisez variera selon que vous utilisez un colorant visible comme le coomassie, ou un colorant fluorescent ou chimioluminescent attaché à un anticorps. Comme pour les systèmes de documentation sur gel d'agarose, les systèmes de documentation sur gel pour les protéines peuvent présenter une variété de spécifications en fonction des exigences. Pour plus de conseils sur les gels docs, vous pouvez lire notre article dédié.


Quelqu'un peut-il me parler de l'extraction d'ADN à partir de gel de polyacrylamide? - (16 novembre 2006 )

Salut tout le monde, je suis très heureux de rejoindre ce forum. Je suis étudiant en dernière année et je dois faire quelques expériences avec l'indicateur SSR (simple sequence repeat). Maintenant, je me prépare à cloner des gènes et j'ai quelques problèmes. C'est l'étape d'extraction de l'ADN, mais à partir de 6% de gel de polyacrylamide colorant à l'argent (normalement, dans mon laboratoire, ils extraient simplement du gel d'agarose). J'ai besoin de quelques conseils sur le protocole et la différence entre le gel de polyacrylamide colorant au bromure d'éthidium et le gel colorant à l'argent que je dois remarquer avant d'aller extraire l'ADN.
La bande intéressée est d'environ 300 pb et je dois électrophorèse des produits PCR sur gel de polyacrylamide car il y a beaucoup de bandes qui ont leur taille proche de la bande dont j'ai besoin (par exemple 350 pb, 270 pb..). Puis-je utiliser le kit d'extraction de gel QIAEX II de QIAgen à cette fin ? A part ce kit, y a-t-il une procédure que je peux utiliser ? (ce kit est trop cher, donc s'il y a un moyen moins cher, c'est mieux)
S'il vous plaît aidez-moi, merci pour votre aide!!!

si votre bande d'ADN était faible et contient moins d'ADN, ce qui ne peut être détecté que par une bande colorée à l'argent sur PAGE, vous pouvez couper la bande et la mettre dans de l'eau bouillie pour l'élution, puis réamplifiée pour la purification,
si votre bande est forte et peut être détectée par EB qui est moins sensible que la coloration à l'argent. vous pouvez suivre les instructions du kit QiaexII.

avez-vous déjà fait bouillir une tranche de gel de polyacrylamide dans de l'eau, je ne pense pas que l'ADN de récupération soit suffisant pour effectuer la réamplification car dans l'eau chaude, la plupart des matériaux contenus dans ces tranches seront dénaturés.
Comment colorer le gel avec EB, ou c'est la même chose avec le gel d'agarose ?

Oui
vérifiez comment les gens récupèrent la bande DD-RT du gel PAGE, ils font même bouillir la tranche de gel pendant 15 minutes, je viens de mettre de l'eau bouillie dans un tube avec une bande coupée.

la coloration PAGE avec EB est la même que le gel d'agarose, mettre le gel dans la solution EB (il est préférable d'utiliser le même tampon pour l'électroporese)
en passant, le vert SBRY est plus sensible à la coloration de l'ADN dans le gel PAGE.

, merci beaucoup pour vos réponses! Mais la taille de mon gel est d'environ 33 X 35 cm, il est donc trop difficile et dangereux d'essayer de le colorer dans une solution EB. Connaissez-vous une autre procédure qui passe la tranche de gel dans de l'agarose à 2 % et obtient l'ADN sur la membrane DEAE qui est intégrée sous les puits ? Je l'ai trouvé en cherchant plus d'informations mais je ne sais pas comment acheter cette membrane.

PAGE de taille mini devrait fonctionner pour des produits de cette taille (comme le gel utilisé sur BioRad mini II)
alternativement, une basse température de fusion peut être envisagée

J'y ai pensé avant et quand j'ai demandé à mon professeur, elle a dit que la taille mini PAGE n'était pas appropriée car sa longueur n'est pas suffisante pour faire la distinction entre ce groupe et d'autres groupes qui s'en approchent. J'ai sous-entendu l'appareil d'électrophorèse qui est utilisé pour les protéines (environ 10 X 13 cm ?), il me serait plus facile de travailler avec

10 % de PAGE non dénaturé avec une meilleure résolution pour un ADN de 300 pb environ

Vous êtes un homme gentil, je réfléchirai davantage à tous vos conseils. J'espère que je réussirai avec mes expériences, mais je pense qu'il y aura plus de problèmes auxquels je devrai faire face, donc je posterai toutes les choses pas claires avec moi et je serai heureux de recevoir plus d'aide!


Préparation gel d'acrylamide - pour SDS-PAGE (17 mai 2007 )

Bonjour, j'ai quelques questions de base sur la préparation du gel d'acrylamide :

1. J'aimerais utiliser un tube jetable de 10 ml/50 ml pour préparer la solution de gel, mais j'ai peur que la surface soit trop petite pour le dégazage. Dois-je utiliser une fiole Erlenmeyer ?

2. J'achète une solution d'acrylamide, mais la solution, TEMED et APS semblent toujours être des choses dangereuses. Dois-je préparer et couler le gel sous une hotte ? Lors du nettoyage des plaques, etc., dois-je me préoccuper des monomères et prendre des précautions autres que le port de gants ?

3. Puis-je jeter le gel polymérisé dans une poubelle standard ou s'agit-il d'un déchet dangereux ?

Quand il s'agit de TEMED ou de TNT, oui, faites-le sous hotte. Et bien sûr, lors du nettoyage des plaques, utilisez des gants. Eh bien, ils ont affirmé que le gel polymérisé ne serait rien du tout. Donc, vous pouvez essentiellement jeter dans une poubelle.

Bonjour, j'ai quelques questions de base sur la préparation du gel d'acrylamide :

1. J'aimerais utiliser un tube jetable de 10 ml/50 ml pour préparer la solution de gel, mais j'ai peur que la surface soit trop petite pour le dégazage. Dois-je utiliser une fiole Erlenmeyer ?

2. J'achète une solution d'acrylamide, mais la solution, TEMED et APS semblent toujours être des choses dangereuses. Dois-je préparer et couler le gel sous une hotte ? Lors du nettoyage des plaques, etc., dois-je me préoccuper des monomères et prendre des précautions autres que le port de gants ?

3. Puis-je jeter le gel polymérisé dans une poubelle standard ou s'agit-il d'un déchet dangereux ?

Je le fais généralement dans un tube à centrifugation de 50 ml. C'est bien. vous pouvez également utiliser le tube plusieurs fois. essayez de ne pas avoir de mousse à la surface du liquide, sauf si vous aspirez beaucoup sous vide. mélanger très doucement. Dans la plupart des cas, je ne dégaze pas. Je mélange très très doucement.

vous pouvez jeter le gel polymérisé dans une poubelle standard, mais uniquement le gel polymérisé. Parfois, le gel laissé dans le tube de 50 ml ne polymérise pas aussi bien, alors j'ajoute un peu d'APS à l'acrylamide restant après avoir mis le gel en commun, donc il est parfaitement polymérisé et je peux le jeter.

Bonjour, j'ai quelques questions de base sur la préparation du gel d'acrylamide :

1. J'aimerais utiliser un tube jetable de 10 ml/50 ml pour préparer la solution de gel, mais j'ai peur que la surface soit trop petite pour le dégazage. Dois-je utiliser une fiole Erlenmeyer ?

2. J'achète une solution d'acrylamide, mais la solution, TEMED et APS semblent toujours être des choses dangereuses. Dois-je préparer et couler le gel sous une hotte ? Lors du nettoyage des plaques, etc., dois-je me préoccuper des monomères et prendre des précautions autres que le port de gants ?

3. Puis-je jeter le gel polymérisé dans une poubelle standard ou s'agit-il d'un déchet dangereux ?

Voici quelques suggestions issues de mon expérience

Je préfère dégazer la solution de gel (résolution) pour améliorer la résolution de la bande (n'oubliez pas que de nombreux autres facteurs influencent la résolution comme la préparation des échantillons, et ce n'est qu'un mais important). Dégazer uniquement avant d'ajouter du SDS pour éviter la formation intensive de mousse. ne vous inquiétez pas des tubes de 10 à 50 ml - je dégaze généralement dans ces tubes. Pour un dégazage rapide, mettez l'agitateur magnétique en solution car la viscosité varie en fonction du % d'acrylamide dans la solution de travail et diminuez la vitesse de dégazage. Je ne vous recommande que de dégazer les solutions de travail lorsque vous préparez des gels à gradient. Parce que l'une des solutions de mélange a généralement un pourcentage élevé d'acrylamide (près de 20%) et si vous supprimez les bulles d'air, vous supprimez donc l'oxygène et le taux de polymérisation de l'inhibiteur de polymérisation principal et peuvent obstruer votre chambre de mélange (il y a plusieurs années, j'ai eu ce problème).

Concernant l'achat de solution d'acrylamide. Je préfère préparer du bouillon frais (tous les mois) à partir d'acrylamide solide. Parce que pendant le stockage de la solution d'acrylamide, la concentration en acide acrylique augmente. C'est aussi diminuer la résolution de votre PAAG. Mais vous pouvez résoudre ce problème en incubant votre solution d'acrylamide avec de la résine Amberlite MB 150 (Supelco ou analogue chez Merck ou Fluka). Stockez votre stock avec cette résine (couvrant le fond de la bouteille de stockage) dans une bouteille sombre à 4C.

Concernant les dangers de l'APS. Ne vous inquiétez pas (APS) et travaillez en laboratoire sans cagoule. À propos de Temed - ce n'est qu'une amine avec une forte odeur et donc ne la laissez pas ouverte après utilisation (aliquotez-la dans des tubes eppendorf sous le capot si vous achetez une bouteille de 1L, puis conservez-la dans 4C et travaillez facilement).

BONNE CHANCE & ne t'inquiète pas pour ça & #33

Merci pour les suggestions à tous, c'est utile. Je vais essayer mon premier gel SDS-PAGE aujourd'hui.


Quelle est l'apparence physique du détergent CHAPS ?

Ce biodétergent est fourni sous forme de poudre cristalline blanche.

Quelle est la concentration micellaire critique (CMC) du détergent CHAPS ?

La valeur CMC est de 6 à 10 mM. Les détergents avec des valeurs de CMC élevées sont généralement faciles à éliminer par dilution. Les détergents avec de faibles valeurs de CMC sont avantageux pour les séparations sur la base du poids moléculaire. En règle générale, les détergents doivent être utilisés à leur CMC et à un rapport pondéral détergent/protéine d'environ dix.

Dans 0-0,1 M Na+, quel est le nombre d'agrégation ?

Le nombre d'agrégation à ce niveau est 4-14.

Quelle est la température de transition ?

Le point de trouble est supérieur à 100°C

Quelle est la CCM du CHAPS (gel de silice : méthanol/NH4OH = 95/5) ?

Le détergent CHAPS est-il soluble dans l'eau ?

Oui, ce détergent devient une solution claire et incolore à légèrement jaune dans l'eau. La solubilité est de 50 mg/mL à 20°C. Il est préférable d'éviter de secouer et d'agiter les mélanges lors de la préparation des solutions CHAPS.

Comment puis-je faire une solution CHAPS 10% ?

Pour une solution à 10 % (c'est-à-dire 1 g de solide CHAPS dans un bécher suivi de 9 g d'eau), couvrez le bécher avec un verre de montre et laissez-le reposer à température ambiante pendant 30 à 60 minutes. Des solutions allant jusqu'à 1 M (60%) peuvent être réalisées de cette manière.

Quelle est la stabilité de ce détergent ?

Le biodétergent CHAPS est sensible à l'humidité et hygroscopique.

Le détergent CHAPS peut-il être éliminé des échantillons par dialyse ?

Oui, le faible poids moléculaire micellaire de ce détergent et sa concentration micellaire critique élevée (6-10 mM) lui permettent d'être éliminé des échantillons par dialyse.

Quelle est la différence entre les détergents CHAPS et CHAPSO ?

Un détergent apparenté, appelé CHAPSO , a la même structure chimique de base avec un groupe fonctionnel hydroxyle supplémentaire.

Les deux détergents ont une faible absorbance de la lumière dans la région ultraviolette du spectre électromagnétique, ce qui est utile pour les travailleurs de laboratoire surveillant les réactions chimiques en cours ou la liaison protéine-protéine avec la spectroscopie UV/Vis.

Quelle concentration de CHAPS est utilisée pour préparer le gel IEF ?

Des concentrations comprises entre 2 et 4 % sont généralement utilisées dans un gel IEF. CHAPS is commonly used for non-denaturing IEF (without urea) and has been shown to give excellent resolution of some subcellular preparations and plant proteins.

What is the difference between CHAPS and Triton X100?

Triton X100 is non-ionic. It has both hydrophilic and hydrophobic regions, but no net charges. CHAPS detergent is zwitterionic. It has hydrophobic regions but also a head group with a negative charge (in normal saline). In addition, Triton X100 forms large (greater than 90,000 MW) aggregates when concentration rises above 0.25 mM. CHAPS on the other hand forms smaller aggregates (6,000 MW) when concentration rises above 10 mM.


FAQ: Why are there extra bands visible on polyacrylamide gels?

For the 100bp DNA Ladder, the 500 and 517bp fragments, which run as a close doublet on agarose, separate very clearly on acrylamide, with the 517bp band running around midway between the 500 and 600bp fragments. This &ldquoanomalous&rdquo migration is an inherent characteristic of acrylamide gel electrophoresis and does not indicate any error in the stated size of the DNA fragments in our ladder.

For the 50bp DNA Ladder and the Low Molecular Weight Ladder, two or more of the bands comprising the 200bp reference band tend to run differently, resulting in one or more extra bands detectable around the 200bp range. As with the 100bp DNA Ladder, this is attributed more to the limitations of acrylamide gel technology than to a problem with the ladder composition. As defined in most molecular biology lab manuals (Maniatis&rsquo Cold Springs Harbor Molecular Cloning Manual, 2nd edition) and as acknowledged by the manufacturers of acrylamide gels, applications requiring precise sizing of DNA fragments should be performed using agarose gels whenever possible.


SDS-PAGE "Hall of Shame"

You may very well have prepared a nearly perfect gel, and would have a difficult time improving upon the product. If that is so, then by all means gloat about it! If you didn't do such a hot job don't despair. All good scientists learn from their mistakes, in fact, without making mistakes most of us wouldn't learn much at all!

The "Hall of Shame" presents examples of some of the worst gels students (and instructor) have run in past labs, with an example or two from a research lab. They represent many of the ways one can mess up a gel (but not all of them - we're still finding new ways!). See what features of your own gel(s) were unsatisfactory - or at least less than perfect - and use the illustrations to figure out what you might do to improve your technique.


Description du produit

GelRed® is an ultra sensitive, extremely stable and environmentally safe fluorescent nucleic acid dye designed to replace the highly toxic ethidium bromide (EtBr) for staining dsDNA, ssDNA or RNA in agarose gels or polyacrylamide gels.

  • Safer than EtBr: non-mutagenic and non-hazardous for disposal
  • Much more sensitive than EtBr and SYBR® Safe
  • Stable at room temperature and microwavable
  • Simple precast or post-electrophoresis gel staining, no destaining
  • Replaces EtBr with no change to equipment or optical settings
  • Compatible with downstream gel purification, restriction digest, sequencing, and cloning

GelRed®: A Superior Alternative to EtBr

GelRed® is much more sensitive than EtBr, and can be used to stain dsDNA, ssDNA or RNA in agarose gels via either precast or post gel staining without destaining. GelRed® can also be used to stain polyacrylamide gels via post gel staining. GelRed® is also compatible with downstream DNA manipulations such as restriction digest, sequencing, and cloning. GelRed® and EtBr have virtually the same spectra, so you can directly replace EtBr with GelRed® without changing your existing imaging system. For detailed protocols for use, please download the GelRed® Product Information Sheet. Also see our GelRed® and GelGreen® Frequently Asked Questions (FAQs).

Non-Mutagenic and Safer for the Environment

A series of safety tests have confirmed that GelRed® is noncytotoxic, nonmutagenic and nonhazardous at concentrations well above the working concentrations used in gel staining. As a result, working strength GelRed® can be safely disposed of down the drain or in regular trash, providing convenience and reducing cost in waste disposal. For detailed test results, you may download the GelRed®/GelGreen® Safety Report.

How Safe is Your Gel Stain?

Many so-called “safe” DNA dyes like SYBR® Safe, Midori Green, GreenSafe, SafeView™, and RedSafe™ not only have low sensitivity, but also readily penetrate living cells to bind DNA, and some are cytotoxic. Unlike these dyes, GelRed® is cell membrane-impermeant, so it cannot enter living cells to interact with their DNA. See our Gel Stains Comparison Flyer or Gel Stains Comparison White Paper for details.

Choose the Right Stain for Your Application

GelRed® 3X in water (catalog no. 41001) is ready-to-use for post-electrophoresis gel staining, and is supplied in a 4L Cubitainer®. Biotium also offers GelRed® 10,000X in water (catalog no. 41003) and GelRed® 10,000X in DMSO (catalog no. 41002). GelRed® in water is a newer, safer formulation and our recommended format. We continue to offer GelRed® in DMSO for established users who do not wish to alter their protocols. We also offer GelRed® Agarose and GelRed® Prestain Plus 6X Loading Dye.

Also see GelGreen® Nucleic Acid Gel Stain, a safer replacement for SYBR® gel stains, which is compatible with visible light excitation.


Voir la vidéo: Cosmetic Ingredients - Thickener Comparison (Juillet 2022).


Commentaires:

  1. Mezilkis

    C'est inutile.

  2. Raanan

    C'est ce dont j'avais besoin. Merci pour l'aide dans cette affaire.



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