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Des moyens créatifs pour désactiver l'alpha-amylase provenant de champignons

Des moyens créatifs pour désactiver l'alpha-amylase provenant de champignons


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Je peux désactiver la $alpha$-amylase par des moyens tels que des contrôles de température extrêmes, des contrôles de pH de la solution dans laquelle elle reste ou en ajoutant du sel à la solution.

Cependant, existe-t-il d'autres moyens uniques ou élaborés de désactiver l'enzyme ? (peut-être que l'hypothèse du verrouillage et de la clé fonctionne également pour les enzymes ET enzymes ?)


Les inhibiteurs de l'amylase ont attiré beaucoup d'attention en raison de leur potentiel dans le traitement du diabète de type 2.

Vous pouvez inactiver la plupart des enzymes en utilisant un inhibiteur spécifique. Une classe d'inhibiteurs est constituée de molécules qui ressemblent aux molécules de substrat mais ne sont pas sollicitées de la même manière. Ceux-ci se lieront au site actif et empêcheront le substrat de se lier. Un inhibiteur de nombreuses amylases est l'acarbose. Il s'agit d'un inhibiteur compétitif, ce qui signifie que l'inhibition est surmontée par des concentrations élevées de substrat.

Et si cela ne suffit pas pour vous lancer, voici une thèse complète sur le sujet des inhibiteurs de l'amylase.

Si vous souhaitez bloquer définitivement l'activité, le composé idéal serait un composé qui se lie au site actif et le modifie de manière covalente, détruisant ainsi l'activité enzymatique. Ce serait un inhibiteur irréversible. Je n'ai pas été en mesure de trouver une référence à un tel composé cependant.


Aeromonas

Amylases

Les amylases sont des hydrolases d'amidon avec plusieurs séquences d'acides aminés hautement conservées parmi les membres de la famille. Amylases de A. hydrophila les souches ont une taille d'environ 48 à 49 kDa, bien qu'une plus grande amylase (70 kDa) soit trouvée dans A. hydrophila JMP636. La amylase de UNE. hydrophile MCC-1 montre une conservation dans les résidus de liaison catalytique et de substrat. De plus, trois des quatre résidus de liaison au calcium (Asn100, Asp167, His201) ​​présents dans d'autres α-amylases sont retenus dans MCC-1, ce qui est cohérent avec le fait que cette enzyme nécessite du calcium pour son activité.


2. Fonction pancréatique

Localisation, régulation et carence en amylase

L'amylase pancréatique est similaire à d'autres protéines sécrétoires et est synthétisée dans le réticulum endoplasmique rugueux. Il se déplace ensuite dans l'appareil de Golgi et est stocké dans des granules sécrétoires jusqu'au moment où il subit une sécrétion régulée. L'immunocoloration révèle sa concentration dans les granules (Figure 1). Comme pour les autres enzymes pancréatiques, la quantité d'amylase dans le pancréas est régulée par la quantité de substrat alimentaire (8, 22, 55). Les rongeurs qui mangent une alimentation riche en glucides synthétisent plus d'amylase qui est l'enzyme digestive pancréatique la plus abondante chez ces espèces. Cet effet se produit au niveau transcriptionnel et l'effet est en grande partie médié par l'insuline. Avec le diabète, l'amylase pancréatique diminue, mais peut récupérer après un traitement à l'insuline (30, 61). Ceci est particulièrement important chez les rats où, dans le diabète expérimental, l'amylase pancréatique tombe à seulement quelques pour cent de la normale. Un élément sensible à l'insuline de 30 paires de bases a été identifié dans le gène Amy2-2 de la souris (28). Le fait que les souris expriment plus d'un gène Amy2 fonctionnel explique pourquoi l'amylase pancréatique totale ne diminue pas autant dans le diabète que chez le rat (18).

Figure 1: Localisation par immunofluorescence de l'amylase dans le pancréas de souris (vert). Les noyaux sont colorés en bleu avec du DAPI.

Les volontaires sains sont capables d'absorber près de 100 % d'une charge d'amidon. Cependant, dans la pancréatite chronique avec perte de tissu pancréatique fonctionnel, environ 90 % seulement sont digérés et absorbés avec une inhibition complète de l'amylase, ce taux est réduit à 80-85 % (31). Dans ce dernier cas, jusqu'à 20 % des glucides atteignent l'iléon et la montée du GIP plasmatique et du peptide C à partir de la proinsuline est bloquée. Des patients présentant un déficit isolé en amylase ont été signalés avec une malabsorption des glucides et les symptômes qui en résultent (37, 54). Les patients évalués ont un ARNm intact mais pas de protéine amylase. Ceci est similaire au déficit physiologique en amylase pancréatique à la naissance où l'absence de symptômes est en partie due à une faible teneur en amidon alimentaire nécessitant de l'amylase et en partie à l'action de l'amylase salivaire. Le déficit en amylase peut être sous-estimé en raison de symptômes bénins.

Récemment, il a été démontré que la quantité d'ARNm d'amylase pancréatique et l'activité d'amylase dans le jéjunum de rats sensibles aux glucides étaient liées à l'oxydation du glucose alimentaire et à l'accumulation de graisse viscérale (5).

Amylase sérique comme mesure de la fonction pancréatique dans la pancréatite

La détermination de l'amylase sérique a longtemps été un pilier dans le diagnostic de la pancréatite aiguë (1, 26). L'amylase sérique chez les individus normaux est environ à moitié salivaire et à moitié pancréatique et chacune existe sous plusieurs isoformes qui contribuent toutes à l'amylase totale. En raison de l'existence de tests et de normes différents, le seuil pour la pancréatite aiguë est généralement exprimé par rapport à la plage de la normale pour le laboratoire clinique particulier. Des niveaux supérieurs à trois fois la limite supérieure de la normale (LSN) sont généralement considérés comme indicatifs d'une pancréatite. Cependant, la spécificité diagnostique n'est que de 70 à 90 % selon la population étudiée et le gold standard utilisé (13, 64). Une spécificité plus élevée est obtenue lorsqu'un point de coupure plus élevé est utilisé tel que 5 ou même 9 fois la LSN, mais au prix d'une sensibilité plus faible. L'utilisation de tests pour inhiber l'amylase salivaire avec un inhibiteur de germe de blé ou des anticorps monoclonaux (59) ou son élimination avec un anticorps monoclonal immobilisé (40) augmente quelque peu la spécificité et aide à éliminer une contribution des tumeurs ou d'autres organes qui produisent principalement de l'amylase salivaire, mais ces tests ne sont pas toujours disponible. La combinaison de lipase sérique et d'amylase est généralement disponible et est utile lorsque les taux d'amylase sérique ont déjà atteint un pic et diminué. Une augmentation de l'amylase sérique peut également être due à une macroamylassémie où l'amylase est liée aux protéines plasmatiques (généralement IgA ou IgM), mais cela ne se produit que chez 1 à 3 % des humains normaux. L'amylase est également élevée dans diverses maladies chirurgicales, traumatiques et néoplasiques (13, 46, 64). L'insuffisance rénale peut réduire la filtration de l'amylase et augmenter les taux plasmatiques, mais cette augmentation est généralement faible car la filtration glomérulaire ne représente qu'une petite partie de la clairance de l'amylase (46). Une augmentation chronique de plusieurs enzymes pancréatiques sériques, y compris l'amylase, chez des sujets par ailleurs en bonne santé sans maladie pancréatique a été décrite par Gullo en 1996 et est maintenant appelée hyperenzyme pancréatique bénigne ou syndrome de Gullo (23). Des techniques d'imagerie avancées peuvent révéler une anomalie pancréatique chez certains de ces patients.

Il est également important de savoir que la pancréatite peut survenir sans augmentation de l'amylase sérique, en particulier avec la pancréatite alcoolique ou la pancréatite chronique récurrente (42). Dans certains de ces cas, la lipase est élevée. Ainsi, si l'amylase reste l'un des tests les plus utiles pour diagnostiquer la pancréatite aiguë, elle doit être réalisée en conjonction avec d'autres tests (1) avec une compréhension du métabolisme de l'amylase.

Sécrétion d'amylase comme mesure de la sécrétion pancréatique ou parotidienne régulée

La mesure de la sécrétion d'amylase est devenue largement adoptée pour mesurer la sécrétion régulée de protéines par des fragments de pancréas ou de parotides, des tranches ou des acini isolés. L'amylase a rempli ce rôle car elle est facile à mesurer, sensible et ne nécessite pas d'activation comme le font les protéases. Alors que pour la mesure de l'amylase sérique dans la pancréatite, une quantité absolue est souhaitable, la plupart des mesures sécrétoires impliquent de doser séparément le produit sécrétoire, généralement dans le milieu d'incubation, et le contenu tissulaire et de calculer le pourcentage de contenu libéré dans un temps spécifié. Alors que les premières mesures ont dosé les groupes réducteurs produits dans le produit hydrolytique, le plus souvent avec l'acide dinitrosalicylique, les études des 50 dernières années ont plus couramment utilisé les produits solubilisés de substrat ou un produit enzymatique coloré ou fluorescent produit dans une réaction couplée. Des exemples de cette approche sont l'amidon bleu Remazolbrilliant (48), l'amidon marqué au jaune Procion (27), l'anthranilate d'amylopectine (43) et le bleu Cibachron F3GA-amylose (29). Un substrat courant disponible dans le commerce est le réactif Phadebas dans lequel un colorant bleu non spécifié est lié à l'amidon (12). Le plus souvent, ces études de sécrétion sont des tests de point final où le tissu est incubé pendant une durée standard, puis des aliquotes du milieu sont incubées avec le substrat d'amidon pendant une durée définie, centrifugées et le produit lu dans un spectrophotomètre ou un fluoromètre (39, 67). Certains de ces dosages ont été adaptés à une lecture continue avec un système à flux continu (14, 34). Une deuxième approche utilise des substrats incolores solubles qui peuvent être incubés dans un lecteur de plaques avec des échantillons du milieu et conduire à un produit coloré ou fluorescent soit directement, soit par réaction couplée. Un substrat primaire est l'éthylidène-paranitrophénol-G7. Cela peut être lu directement ou le glucose libéré déterminé par la glucose oxydase (65). Ce type de dosage a également été adapté à la technique de l'autoanalyseur. Récemment, les deux types de tests ont été utilisés pour déterminer l'amylase duodénale humaine avec une forte corrélation (19).

Inhibiteurs de l'amylase en médecine clinique

Les inhibiteurs de l'amylase, en particulier l'acarbose, un pseudotétrasacharide, ont été utilisés dans le traitement du diabète de type 2 où ils ont des effets modérés pour réduire le pic de glucose postprandial et l'hémoglobine A1c. Normalement, ils sont utilisés comme médicament de deuxième intention souvent en association avec la metformine (36). Il existe également des preuves que l'acarbose peut réduire le syndrome de chasse après une chirurgie bariatrique (11). Une multitude de produits végétaux naturels ayant des activités d'inhibiteur de l'amylase ont été proposés ou étudiés comme traitement du diabète, mais il existe peu de preuves concluantes de leur efficacité.


Amylase et une expérience enzymatique simple

En matière de digestion, la mastication est le point de départ évident. Moins évidentes cependant sont toutes les enzymes contenues dans notre salive qui facilitent également la digestion. En termes simples, les enzymes sont des produits chimiques qui facilitent la dégradation des substances ou provoquent une certaine réaction chimique. Dans le cas de la salive, une enzyme particulière appelée Amylase facilite la décomposition ou la digestion des glucides et de l'amidon, les transformant en sucres. Une partie de la fonction de la mastication n'est pas seulement de briser nos aliments en petits morceaux, mais aussi de bien mélanger les aliments avec de l'amylase afin que nos aliments soient digérés plus efficacement. Nous avons peut-être ressenti consciemment les effets de l'amylase en mangeant des aliments riches en féculents ou en glucides et nous avons remarqué que la nourriture devient légèrement plus sucrée après avoir mâché un certain temps. Ce goût sucré est le résultat de la décomposition des glucides ou de l'amidon par l'amylase en sucres au goût plus sucré.

Nous avons développé une expérience de laboratoire simple démontrant les effets de l'amylase que n'importe qui peut faire avec un équipement de base. C'est probablement une expérience que d'autres ont développée, je ne l'ai tout simplement pas rencontrée auparavant. Tout ce dont vous avez besoin est un tube à essai, de l'eau sans chlore, des biscuits salés, de l'iodure de potassium et une broche. L'eau du robinet peut être déchlorée en la laissant reposer pendant 24 heures et l'iodure de potassium (IKI) et les tubes à essai peuvent être achetés en ligne.

Voici les étapes de cette expérience :
1. Concassez une partie d'un biscuit salé en une poudre fine. Vous n'avez pas besoin de beaucoup, juste assez pour couvrir le fond d'un tube à essai. (cela imite les effets de la mastication)
2. Placez le cracker broyé au fond d'un tube à essai, vous n'avez besoin que d'assez pour couvrir le fond.
3. Ajouter une quantité égale d'eau déchlorée dans le tube à essai et bien mélanger.
4. Ajoutez une ou deux gouttes d'iodure de potassium (IKI) au mélange de craquelins d'eau et mélangez à nouveau soigneusement. À ce stade, une grande partie du biscuit devrait prendre une couleur brune. Ceci est le résultat de la coloration des amidons IKI dans le cracker brown.
5. Doubler (ou légèrement plus) le volume total dans le tube à essai avec de la salive. Oui, il suffit de laisser un peu de salive s'accumuler dans votre bouche, puis de cracher dans le tube à essai.
6. Mélangez et attendez de voir ce qui se passe.


Recherche de la Faculté

Notre recherche relie les programmes universitaires et les laboratoires expérientiels pour cultiver une communauté active de recherche axée sur les résultats.

Les professeurs étudient le changement évolutif en utilisant une variété de techniques en capitalisant sur les progrès récents de la méthodologie de la génomique et l'évolution des virus, des plantes, des poissons et des humains.

Les généticiens étudient les processus biologiques en examinant les conséquences phénotypiques de la modification des gènes. Notre faculté étudie comment l'information codée dans l'ADN est interprétée pour produire des protéines fonctionnelles.

La faculté de signalisation étudie la communication cellulaire et les voies intracellulaires qui régulent l'activité. Ces facultés utilisent un large éventail d'organismes modèles et de techniques pour examiner un large éventail de voies de signalisation impliquées dans la régulation hormonale, la transduction sensorielle, ainsi que la croissance et le métabolisme cellulaires.

Les facultés cellulaires et moléculaires étudient la régulation de l'expression des protéines, de la transcription à la traduction en passant par la modification post-traductionnelle.

Nos recherches portent sur la biologie évolutive des plantes, la phylogénétique moléculaire et la génomique des populations, la chromatine et l'expression des gènes, la stabilité du génome et la génétique des invertébrés aquatiques.

Notre faculté étudie une variété de systèmes modèles en utilisant des techniques d'électrophysiologie et d'imagerie pour comprendre la signalisation sensorielle et les processus cellulaires sous-jacents à d'importants troubles neuronaux.

Notre faculté étudie la biologie cellulaire et les voies de signalisation utilisées par les champignons filamenteux et les levures bourgeonnantes pour s'adapter à leur environnement. Notre recherche utilise la levure comme organisme modèle pour étudier les mécanismes d'expression des gènes.

La recherche de la faculté se concentre sur la photosynthèse, l'évolution des plantes, la génomique végétale, la régulation des gènes, l'assainissement de l'environnement et l'ingénierie métabolique des composés pharmaceutiques.


Musique de la nature

Ce graphique montre les niveaux d'alpha-amylase chez les femmes écoutant de la musique relaxante (RM), de l'eau ondulante (SW) ou rien (R). Cliquez pour plus de détails.

Ce graphique montre les niveaux d'alpha-amylase chez les femmes écoutant de la musique relaxante (RM), de l'eau ondulante (SW) ou rien (R). Cliquez pour plus de détails.

Les scientifiques ont testé comment la musique classique et les sons de la nature affectent les niveaux de cortisol et d'alpha-amylase. Cela suggère que la musique relaxante aide le corps à revenir plus rapidement à un état de non-stress.

Les personnes écoutant de la musique relaxante ont montré une réponse au stress plus courte que les autres groupes. La réponse plus courte aide à empêcher le corps de s'user. Cela signifie qu'écouter de la musique relaxante peut aider à améliorer la réponse au stress et la santé.

De plus, les femmes qui écoutaient de la musique avaient des niveaux de cortisol plus élevés après le stress que les personnes qui n'écoutaient rien. Ce sont les personnes qui écoutaient les sons de la nature qui avaient les niveaux de cortisol les plus bas. Cela signifie qu'écouter de la musique pendant le stress peut ne pas réellement diminuer le stress. Cependant, écouter les sons de la nature pourrait faire l'affaire.


Méthodes

Flux de travail de l'assemblage du génome des organites à l'aide de GetOrganelle

GetOrganelle v1.6.2 se compose de deux scripts majeurs (« get_organelle_from_reads.py » et « get_organelle_from_assembly.py ») et de 17 scripts mineurs (sous le répertoire « Utilities » pour traiter ou évaluer les assemblages d'organelles) (Fig. 1), une série de bibliothèques (sous le répertoire "GetOrganelleLib" comprenant la base de données de départ par défaut, la base de données d'étiquettes par défaut et les classes/fonctions Python) et les dépendances (sous le répertoire "GetOrganelleDep" comprenant Bowtie2, SPAdes, BLAST+). Le script principal "get_organelle_from_reads.py" pourrait regrouper les 5 étapes décrites ci-dessous (voir également les flèches vertes pleines sur la figure 1) en utilisant une seule ligne de commande pour assembler le(s) génome(s) des organites à partir de lectures brutes. Le script principal « get_organelle_from_assembly.py » pourrait extraire le(s) génome(s) des organites des graphes d'assemblage générés à l'aide de SPAdes [15] ou Velvet [54] (les étapes 4 à 5 voient également les flèches bleues pleines sur la figure 1).

Étape 1. Mappage des lectures à la graine et assemblage des lectures mappées à la graine pour l'estimation des paramètres

L'étape initiale d'assemblage du ou des génomes des organites cibles à partir des lectures via GetOrganelle ("get_organelle_from_reads.py") utilise Bowtie2 pour mapper les lectures aux séquences de graines (c'est-à-dire la base de données de graines par défaut), qui peut inclure le génome complet des organites de référence ( s) ou fragment(s) d'organite (Fig. 1, flèche verte pleine 1). Actuellement, la graine par défaut de GetOrganelle (sous le répertoire « GetOrganelleLib/SeedDatabase ») couvre les plastomes embryophytes, les plastomes non embryophytes, les mitogénomes embryophytes, l'ADN ribosomique nucléaire embryophyte, les mitogénomes animaux et les mitogénomes fongiques (dans l'option appelée « embplant_pt », « other_pt », « embplant_mt », « embplant_nr », « animal_mt », « fungus_mt », respectivement). Ces lectures mappées sont ici appelées lectures mappées par défaut (stockées dans *.initial.fq).

Les lectures mappées sur les semences seront traitées comme des «appâts» initiaux pour recruter davantage de lectures associées à la cible à l'étape suivante. En mode « auto » (voir le dernier paragraphe de l'étape 2 ci-dessous), les lectures mappées par graines seront également grossièrement assemblées en contigs de graines, qui seront utilisés pour l'estimation des paramètres à l'étape 2.

Étape 2. Recruter davantage de lectures associées à la cible en étendant les itérations

Après avoir créé des « appâts », GetOrganelle (« get_organelle_from_reads.py ») recrute de nouvelles lectures associées à la cible en comparant les lectures candidates aux « appâts » et en mettant à jour les « appâts » avec de nouvelles lectures superposées (Fig. 1, flèche verte pleine 2). Dans ce processus d'extension, la méthode de comparaison clé pour déterminer les chevauchements est le hachage de sous-chaîne classique. Les sous-chaînes sont appelées mot(s) ici pour les distinguer de k-mers, un concept similaire dans le processus d'assemblage. La longueur uniforme des mots est donc appelée taille de mot.

Avant les itérations de l'extension de base, « get_organelle_from_reads.py » crée un index et attribue des identifiants uniques pour chaque ensemble de lectures dupliquées afin d'éviter des calculs répétés (informations stockées dans le fichier « temp.indices.1 »). Ces lectures avec doublons peuvent également être utilisées pour le « pré-groupement » en aval. Le pré-regroupement est un algorithme permettant d'accélérer le recrutement en lecture cible.Cet algorithme est basé sur l'idée qu'il serait plus efficace de comparer d'abord les lectures qui sont plus susceptibles d'être associées à la cible. Étant donné que les génomes des organites ont généralement plus de copies, et donc une couverture de base plus élevée que la plupart des chromosomes non organites, les lectures dupliquées sont plus susceptibles d'être associées aux organites que les lectures non dupliquées. Le script "get_organelle_from_reads.py" regroupera un certain nombre de lectures dupliquées (après l'option "-P") en groupes basés sur le chevauchement des lectures en utilisant la même méthode de hachage de sous-chaîne mentionnée ci-dessus. Tous les groupes, y compris ceux avec une seule lecture, auront une table de hachage stockant les mots coupés de toutes les lectures de ce groupe. Deux groupes partageant au moins un seul mot dans leur table de hachage seront fusionnés. Après pré-groupement, un groupe ressemble à un ensemble de pseudo-contigs connectés (informations stockées dans le fichier « temp.indices.2 »). Au cours des itérations d'extension suivantes, une fois qu'une lecture est acceptée en tant que lecture associée à la cible, toutes les autres lectures (ID) du même groupe seront marquées comme acceptables.

Le script "get_organelle_from_reads.py" commence les itérations de l'extension de base par la construction d'une table de hachage, en coupant les lectures initiales ("appâts") en mots et en ajoutant ces mots initiaux à la table de hachage (AW). Si un mot d'une lecture candidate atteint l'AW, tous les mots de cette lecture sont également ajoutés à l'AW, et l'index de cette lecture sera marqué comme accepté (Index accepté, AI). Comme mentionné ci-dessus, tous les autres identifiants de lecture dans le même groupe seront traités comme acceptés. Au cours de chaque itération (tour), « get_organelle_from_reads.py » passe en revue toutes les lectures candidates une par une pour vérifier si une lecture est acceptable. Après un nombre de tours spécifié par l'utilisateur ou lorsqu'aucune nouvelle lecture n'a été acceptée dans un tour complet, "get_organelle_from_reads.py" arrêtera le processus d'extension et affichera toutes les lectures acceptées (stockées dans le fichier "filtered_*.fq"). Pour les machines à faible mémoire ou à des fins de test, les lectures acceptées par tour peuvent être sorties séparément après chaque tour (suivies du drapeau "--out-per-round") avec AW vidé après chaque tour.

Taille du mot (suivi de l'indicateur "-w"), comme k-La longueur de l'assemblage est cruciale pour la faisabilité et l'efficacité de ce processus. La meilleure taille de mot pour l'extension est affectée par la longueur de lecture, la qualité de lecture, le nombre total de lectures, le pourcentage de lectures du génome des organites, l'hétérogénéité de la couverture de base des organites et d'autres facteurs. En mode « auto », lorsqu'il n'y a pas de valeur de taille de mot attribuée par l'utilisateur, « get_organelle_from_reads.py » estimera automatiquement une taille de mot appropriée avec un ensemble de fonctions personnalisées de manière empirique, en fonction des caractéristiques des données.

Étape 3. Réalisation de l'assemblage de novo

Les lectures associées à la cible recrutées seront ensuite automatiquement assemblées à l'aide de SPAdes (Fig. 1, flèche verte pleine 3). Les lectures appariées et non appariées seront utilisées. Les sorties de chacun k-mer de SPAdes incluent un graphe d'assemblage (format FASTG), qui enregistre les connexions des contigs sous forme de graphe avec un certain polymorphisme allélique et une incertitude d'assemblage. D'autres assembleurs capables de générer le graphe d'assemblage, tels que Velvet, peuvent être utilisés pour effectuer cette étape, mais ne sont pas encore implémentés dans GetOrganelle. Les résultats intermédiaires sont stockés dans le sous-dossier « filtered_spades ».

Étape 4. Filtrage approximatif des contigs de type cible

Étant donné que les séquences sont souvent partagées entre les plastomes, les mitogénomes et les génomes nucléaires, les lectures acceptées à partir de l'étape 2 incluent parfois inévitablement des lectures non cibles. Par conséquent, le graphique d'assemblage de sortie peut également inclure des contigs non cibles. Cependant, les outils signalés précédemment ne tenaient pas compte ou n'abordaient pas adéquatement cette préoccupation.

GetOrganelle recherche les contigs de type cible à partir du fichier graphique d'assemblage d'origine en utilisant conjointement la table d'étiquettes de contig, les connexions de contig et les couvertures de contig (Fig. 1, flèche pleine verte 4 et flèche pleine bleue 1). Pour créer la table d'étiquettes de contig, GetOrganelle prend les contigs dans le graphe d'assemblage comme requêtes, effectue la recherche BLAST sur une base de données d'étiquettes locale (voir le paragraphe suivant), génère la table de hits BLAST et convertit la table de hits BLAST générée en contig table d'étiquettes, qui enregistre les identités des gènes et les types d'organites de ces correspondances BLAST. En supprimant de manière conservatrice les contigs non cibles, GetOrganelle génère un fichier graphique d'assemblage simplifié, ainsi qu'un fichier cognominal au format TAB enregistrant la table d'étiquettes contig (avec l'extension ".csv" pour être conforme à Bandage). Cette étape est complétée automatiquement par les deux scripts principaux ou peut être exécutée indépendamment à l'aide du script « slim_fastg.py ».

Pour GetOrganelle, la base de données d'étiquettes par défaut d'un certain organite est constituée des régions codantes de ce génome d'organite. Nous avons créé six bases de données d'étiquettes par défaut qui correspondent aux six types de génomes d'organites dans les bases de données de semences. Un contig qui a atteint la base de données des organites cibles sera étiqueté avec l'identité du gène dans le fichier ".csv" et appelé ici target-hit-contig. Tout contig qui se connecte directement ou indirectement à cette cible-hit-contig est appelé une cible-associée-contig. Ici, nous définissons un groupe de contigs interconnectés comme un composant connecté du graphe d'assemblage. GetOrganelle conserve par défaut tous les composants connectés avec le(s) target-hit-contig(s). De plus, en mode embplant_pt ou embplant_mt, GetOrganelle conserve par défaut les composants connectés au plastome et au mitogénome pour le regroupement en aval des contigs par couverture. Généralement, cette étape de filtrage grossier est conçue pour être conservée et éviter de supprimer les vrais contigs cibles.

Étape 5. Identification des contigs cibles et exportation de toutes les configurations

GetOrganelle utilise ensuite le fichier de graphique d'assemblage simplifié et le tableau d'étiquettes de contig pour (5a) identifier plus précisément (réduire) les contigs d'organites cibles, (5b) estimer les multiplicités (nombre de copies) de contigs dans un graphique d'organites uniquement, et (5c ) exporter tous les chemins distinctifs possibles [stockés sous forme de fichier(s) FASTA] à partir du graphique d'assemblage des organites (stocké sous forme de fichier au format GFA cognominal) (Fig. 1, flèche verte continue 5 et flèche bleue pleine 2). Chaque chemin représente une configuration possible du génome de l'organite cible. Cette étape est remplie par les deux scripts principaux ou peut être exécutée séparément à l'aide du script « disentangle_organelle_assembly.py ». En cas de génome organite avec un grand nombre de répétitions, GetOrganelle met en place une option pour limiter le temps de calcul du démêlage pour éviter de générer des combinaisons inépuisables. Lorsque les principaux scripts n'ont pas réussi à exporter la ou les séquences circulaires du graphe d'assemblage pour les raisons énumérées ci-dessous à l'étape 5 ou en raison du délai, ils exécuteront une deuxième exécution pour exporter les contigs, qui seraient principalement la cible. hit-contigs.

Trois notions doivent être clarifiées :

Un « graphe suffisant en organites » est un graphe d'assemblage dont les contigs couvrent complètement un génome d'organite complet.

Un "graphe d'organites uniquement" est un graphe d'assemblage uniquement avec de vrais contigs d'un génome d'organite.

Un « graphique équivalent d'organelles » est à la fois un graphique à organelles suffisantes et un graphique à organites uniquement.

GetOrganelle nécessite trois hypothèses pour démêler l'assemblage et déclarer le résultat comme un organite circulaire complet :

Hypothèse 1: Toutes les configurations, s'il y en a plus de deux, du génome de l'organite cible sont de composition identique. Cette hypothèse limite les multiplicités de contigs à être les mêmes parmi différentes configurations. En d'autres termes, les polymères se trouvent dans de vraies molécules d'ADN de plaste [55], alors que GetOrganelle ne peut exporter que le monomère sous forme de configurations sous-génomiques potentielles qui ne sont actuellement pas implémentées dans la version actuelle. S'il existe des contigs parallèles causés par le polymorphisme nucléotidique, tous les sous-graphes composés de l'un de ces polymorphismes seront démêlés indépendamment. Par conséquent, toutes les configurations de chaque sous-graphe seront identiques du point de vue de la composition.

Hypothèse 2: La topologie de chaque génome d'organite sera représentée comme une seule molécule circulaire. Cette hypothèse est valable lorsque le génome réel des organites est une molécule circulaire ou organisée en polymères (la plupart des plastomes et les mitogénomes de type I et de type II) et que le graphe d'assemblage est un graphe suffisant en organites. Si cette hypothèse n'est pas respectée, GetOrganelle n'exporte que les contigs cibles.

Hypothèse 3: Les valeurs de couverture des contigs d'un même génome organite sont généralement proportionnelles à leurs multiplicités (nombre de copies). Par conséquent, les valeurs de couverture des contigs avec la même multiplicité du même génome d'organite sont généralement cohérentes.

5a. Identification plus poussée des contigs d'organites cibles

L'utilisation des informations de hit BLAST seules pour identifier les contigs d'organites cibles est risquée. Certains contigs, y compris les contigs mitochondriaux qui ont une courte séquence d'origine du plastome ou des contigs de contaminants de faible profondeur ressemblant à des cibles, seraient étiquetés de manière incorrecte comme des contigs cibles (faux positifs). D'un autre côté, certaines séquences peuvent être de véritables contigs cibles mais sont trop courtes ou divergentes des séquences de la base de données d'étiquettes pour être étiquetées comme cibles-hit-contigs (faux négatif). Par conséquent, nous avons utilisé des informations supplémentaires pour améliorer l'identification des contigs cibles, telles que les caractères du graphe d'assemblage (hypothèses 1 et 2) et les valeurs de couverture des contigs (hypothèse 3). GetOrganelle utilise une stratégie intégrée qui utilise de manière itérative tout ou partie des modules suivants pour aborder cette tâche jusqu'à ce que plus aucune modification ne soit apportée au graphe d'assemblage.

Utilisation des informations de hit BLAST pour regrouper approximativement les contigs avec les étiquettes cibles. Plus précisément, GetOrganelle calcule d'abord une valeur de poids de hit (HW) personnalisée pour chaque enregistrement de hit BLAST (étiquette d'identité génétique restaurée à partir de la table d'étiquettes contig). Pour les enregistrements représentant le même gène dans la base de données BLAST locale, seul l'enregistrement avec le meilleur HW est conservé comme seul enregistrement de frappe valide pour ce gène. Le HW d'un enregistrement d'accès est simplement défini comme le produit de la longueur d'accès de la requête (HL) et de la couverture de contig de requête (QC) (HW = HL * QC). Compte tenu de notre expérience selon laquelle les faux positifs correspondent généralement à des contigs de longueur plus courte et de profondeur plus faible, HW peut être un critère pour exclure les enregistrements de faux positifs. Chaque gène de la base de données BLAST est ainsi aligné sur un seul contig dans le graphe d'assemblage. Ensuite, GetOrganelle calcule une valeur de poids de contig personnalisée (CW) d'un génome d'organite cible pour chaque contig en tant que CWcible = HWcible. Par exemple, le CW du plaste pour un contig est défini comme la somme des HW de tous les enregistrements de hit de gène de plaste de ce contig, tandis que le CW mitochondrial pour le même contig est défini comme la somme des HW de tous les enregistrements de hit de gène mitochondrial de le même contig. Pour un contig, si le CW cible est beaucoup plus grand (facteur par défaut : 3 fois) que le CW de l'organite non cible, ce contig serait étiqueté comme un contig cible-ancre (très susceptible d'être un véritable contig cible), et vice-versa versa. En utilisant le HW et le CW, GetOrganelle élimine approximativement la plupart des contigs non cibles avec des résultats BLAST faussement positifs.

Ajout de plus d'étiquettes cibles à certains contigs cibles qui n'atteignent pas la base de données d'étiquettes en fonction des caractères du graphique d'assemblage. Sur la base de l'hypothèse 2, toute configuration du génome de l'organite cible est une seule molécule circulaire. En conséquence, dans un graphique à organelles suffisantes, les deux extrémités de tout véritable contig cible doivent être connectées à au moins un véritable contig cible. Si la queue d'un véritable contig cible, le contig A (marqué comme Aqueue) n'a qu'une arête qui relie Aqueue et la tête d'un autre contig inconnu, le contig B (Bdiriger), alors le contig B doit être un vrai contig cible. Cependant, dans un graphe d'assemblage réel avec des contigs manquants (génome d'organite incomplet), le contig B peut être manquant et le contig inconnu connecté à Aqueue peut être un contig non cible. Compte tenu de situations compliquées comme celle-ci, uniquement lorsque le contig B est entre deux contigs cible-ancre (Contig A et Contig C) avec la séquence (Aqueue-Bdiriger-Bqueue-Cdiriger), et quand Aqueue se connecte uniquement à Bdiriger et Cdiriger se connecte uniquement à Bqueue, GetOrganelle étiquette Contig B comme contig cible-ancre avec CW = 0.

Utilisation des valeurs de couverture des contigs pour supprimer les contigs dont la valeur de couverture s'écarte considérablement des contigs cible-ancre. Sur la base de l'hypothèse 3, GetOrganelle utilise la distribution de mélange gaussienne pour approximer les valeurs de couverture de tous les contigs dans le graphe d'assemblage simplifié, qui est un mélange de différents contigs d'organites et de contigs nucléaires. Dans la plupart des cas de données empiriques d'écrémage du génome végétal, le plastome a une couverture significativement plus élevée que le mitogénome, dont la couverture est à son tour plus élevée que le génome nucléaire, à l'exception des régions hautement répétées. Par conséquent, dans un ensemble de données WGS de plante, les valeurs de couverture des contigs plastidiques et mitochondriaux et nucléaires devraient être classées en différentes composantes gaussiennes de la distribution du mélange gaussien. GetOrganelle pourrait ainsi supprimer les contigs avec une valeur de couverture éloignée de la distribution de couverture cible. Plus précisément, GetOrganelle applique un algorithme EM (Attente-Maximisation) avec l'apprentissage semi-supervisé et le modèle de mélange gaussien pondéré pour regrouper les valeurs de couverture de tous les contigs candidats. Ici, l'apprentissage semi-supervisé signifie que les valeurs de couverture des contigs cible-ancre (les données étiquetées) ne sont pas mises à jour pendant les itérations EM. La valeur de couverture d'un contig dans le modèle de mélange gaussien est pondérée par la longueur du contig.

Suppression des contigs isolés du composant connecté cible principal qui inclut les contigs cible-ancre. Sur la base de l'hypothèse 2, les véritables contigs cibles dans un graphe d'assemblage suffisant en organelles devraient se produire dans un composant connecté. Ainsi, pour un véritable graphe d'assemblage suffisant en organelles, GetOrganelle conserve le composant connecté avec le plus de contigs d'ancrage cible et supprime les autres composants connectés de ce type. Plus précisément, GetOrganelle calcule une valeur de poids cible (TW) personnalisée pour chaque composant connecté du graphique d'assemblage. Le TW d'un composant connecté est défini comme la somme des CW cibles de tous les contigs dans ce composant connecté. En supposant que les organelles suffisent, GetOrganelle trie les composants connectés par leurs TW, trouve le composant connecté avec le TW considérablement le plus grand (100 fois plus grand que le deuxième plus grand TW par défaut) et supprime les contigs des autres composants connectés du graphe d'assemblage. Si GetOrganelle ne parvient pas à trouver un tel composant connecté, le démêlage du graphe d'assemblage en tant que génome d'organite circulaire échoue et GetOrganelle revient en « mode linéaire ». Dans un "mode linéaire", lorsque GetOrganelle essaie de démêler le graphe d'assemblage en contigs ou en échafaudages, plusieurs composants connectés avec un grand TW sont conservés, et seuls les composants connectés avec un TW 10 000 fois (par défaut) inférieur au plus grand TW seront supprimés .

Suppression des contigs de pointe. Un contig de pointe est un contig avec une ou les deux extrémités qui ne se connectent à aucun autre contig dans le graphe d'assemblage ni à lui-même en tant que circulaire. Sur la base de l'hypothèse 2, un graphique d'équivalent organite ne contiendra aucun contig de pointe, car toute séquence partielle d'une molécule d'ADN circulaire aura à la fois des séquences en amont et en aval. GetOrganelle vérifiera si un contig de pointe est un contig cible-ancre avant de le supprimer. Si le contig de pointe est un contig cible-ancre, il est probable que l'hypothèse 2 soit violée, et dans la plupart des cas, le graphe d'assemblage n'est pas un graphe suffisant en organites mais plutôt « un graphe d'organites brisé ».

5b. Estimation des multiplicités de contigs dans un graphe d'organites uniquement

Il existe des sources de ressources d'informations pour estimer les multiplicités des contigs dans GetOrganelle. L'un est la valeur de couverture contig (k-mer couverture en pratique mais désignée comme couverture dans ce paragraphe). Selon l'hypothèse 3, nous pourrions estimer grossièrement la multiplicité de chaque contig en fonction de sa couverture. Étant donné que tout contig dans un graphe d'organites uniquement aurait au moins une copie, GetOrganelle suppose d'abord que tous les contigs ont la multiplicité d'un et estime une valeur primaire de la couverture moyenne du génome cible. Ensuite, GetOrganelle optimise les multiplicités de tous les contigs en divisant la valeur de couverture d'un contig par la couverture moyenne et en arrondissant le résultat à l'entier le plus proche. GetOrganelle optimise itérativement la couverture moyenne du génome cible et les multiplicités des contigs, avec la contrainte que la couverture moyenne du génome ne doit pas être inférieure à la couverture minimale de tous les contigs selon l'hypothèse 1. Ici, les multiplicités stabilisées estimées sur la base de les valeurs de couverture des contigs sont appelées multiplicités observées (OCje, avec Cje désignant le nom du contig) (Fig. 2).

Un autre type d'information provient des caractéristiques du graphe, qui offre un ensemble de contraintes dures pour les multiplicités de contigs (MCje, avec Cje désignant le nom du contig). À l'aide de la bibliothèque Python Sympy, GetOrganelle crée un ensemble d'équations linéaires pour caractériser la relation de multiplicité entre les contigs connectés. Dans le détail, il y a principalement quatre contraintes pour construire cet ensemble d'équations. Premièrement, la multiplicité d'un contig d'auto-boucle n'a pas de contraintes. Deuxièmement, si le contig A n'est pas un contig de pointe ni un contig d'auto-boucle, MCalifornie est égal à la somme des multiplicités des contigs reliés à Adiriger et égal à la somme des multiplicités des contigs reliés à Aqueue. Troisièmement, la multiplicité d'un contig de pointe est arbitrairement fixée à 1 pour éviter une surestimation, bien que cela risque d'échouer dans la résolution des équations. Enfin, en considérant la symétrie des grandes répétitions inversées (telles que les IR dans le plastome), la multiplicité d'un contig de répétition séquentielle est contrainte d'être un multiple entier de la multiplicité de l'un de ses contigs proches, par exemple, la multiplicité d'une répétition séquentielle à l'intérieur la région IR d'un graphe d'assemblage de plastome doit être un nombre pair et non inférieur à 4. Cet ensemble d'équations serait ensuite simplifié à l'aide de Sympy.solve.Les valeurs de multiplicité de tous les contigs seraient représentées comme une expression linéaire de plusieurs variables libres.

En minimisant la différence des multiplicités basées sur les deux types d'informations ci-dessus en utilisant les moindres carrés, ce qui signifie minimiser ( _^>>_i>->_i> ight)>^2 ) , GetOrganelle a atteint les valeurs de ces variables de liberté, donc tous les MCje (Fig. 2).

5c. Exportation de tous les chemins distinctifs possibles

GetOrganelle recherche ensuite de manière exhaustive tous les chemins possibles à partir de ce graphe d'organelles uniquement avec des multiplicités contig. Chaque combinaison de configuration serait enregistrée en tant que fichier FASTA indépendant, avec le même style de nom de séquence pour la complétion manuelle à l'aide de Bandage [30] (voir ci-dessous). Une séquence circulaire serait également marquée « (circulaire) » dans le nom de la séquence. Pour les plastomes avec des répétitions à l'intérieur des grands IR, il y aurait 6 chemins, ce qui signifie 6 isomères potentiels (voir Fig. 2 un autre exemple similaire mais plus compliqué est SRR5602601 avec 12 chemins). Cependant, en considérant la symétrie, seuls les isomères avec de grands IR identiques (path1 & 2 sur la figure 2) sont des chemins biologiquement possibles. Dans ces cas, GetOrganelle marquerait ces résultats avec des IR identiques comme premier motif de répétition dans le nom de fichier.

Étape 5′. Complétion manuelle

Si GetOrganelle ne parvient pas à exporter un génome d'organite circulaire complet, en raison d'un graphique d'assemblage cible insuffisant, d'un temps d'exécution de démêlage trop court, d'un trop grand nombre de séquences de configuration possibles ou d'une identification erronée des contigs cibles, une exécution manuelle est nécessaire pour nettoyer « bruyant » et non cible connexions contig/échafaudage (Fig. 1, flèches pleines grises 4 et 5). Le graphe d'assemblage simplifié peut être visualisé à l'aide de Bandage [30]. Pendant ce temps, le fichier d'annotation "csv" concomitant peut être importé dans Bandage et ajouté au graphique en tant qu'étiquettes, ce qui permet d'identifier manuellement les contigs/échafaudages de type cible. Le graphe d'assemblage nettoyé semi-manuellement peut ensuite être finalisé à l'aide d'un autre script principal « get_organelle_from_assembly.py » (Fig. 1) ou être exporté manuellement à partir du graphe d'assemblage nettoyé à l'aide de Bandage.

Évaluation des caractéristiques de performance de GetOrganelle

Pour étudier les caractéristiques de performance de GetOrganelle, nous avons fait varier les paramètres pertinents du programme : valeurs de taille de mot (sous la forme de WSR, c'est-à-dire 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9), le nombre de tours (illimité vs minimum) et le pré-groupement soit activé (-P 2E5, c'est-à-dire utilisant les 2E5 premières lectures dupliquées pour effectuer le pré-groupement) ou désactivé (-P 0). Le mode du nombre minimum de tours est défini comme le moins de tours d'itérations d'extension nécessaires pour obtenir un plastome complet ou stabiliser un plastome incomplet.

Nous avons utilisé ces différents réglages pour assembler le plastome de l'espèce angiosperme Haberlea rhodopensis Friv. (Gesneriaceae) à partir d'un jeu de données publié réduit (500 Mo, SRA : SRR4428742), avec le plastome complet d'une espèce de gymnosperme, Gnetum parvifolium (Warb.) W.C.Cheng (GBK : NC_011942.1) comme graine. De plus, nous n'utilisons que le rbcL séquence de gènes de Gnetum parvifolium (GBK : NC_011942.1) comme graine et le WSR de 0,75 pour assembler le même ensemble de données.

Pour évaluer les caractéristiques des lectures recrutées par tour, l'option "--out-per-round" a été spécifiée pour le script "get_organelle_from_reads.py". Le script "round_statistics.py" a été utilisé pour évaluer l'augmentation du pourcentage de couverture du génome des organites à l'aide d'une approche de mappage de lecture. À l'aide de Bowtie2, ce script mappe les lectures de chaque tour sur les plastomes assemblés finaux et calcule le pourcentage de bases dans le plastome qui sont couvertes par les lectures mappées au-dessus d'un certain seuil de couverture (les valeurs par défaut étaient 0 et 10). Le nombre minimum de tours intervient lorsque le pourcentage de socles recouverts atteint 100 % ou reste inchangé et lorsque l'assemblage final est stabilisé. En outre, si la bibliothèque Python Matplotlib est disponible, le script "round_statistics.py" pourrait générer la couverture de base sur le tracé du génome des organites pour chaque cycle d'extension afin de visualiser le processus d'extension.

Assemblage de novo des plastomes de 50 jeux de données végétales à l'aide de GetOrganelle et NOVOplasty

Pour évaluer l'efficacité de travail et le succès de l'assemblage, nous avons sélectionné 50 ensembles de données de plantes vasculaires avec des lectures brutes à partir de GenBank Sequence Reads Archive (SRA) (Fichier supplémentaire 2 : Tableau S1). Les 50 plantes vasculaires représentaient 42 espèces d'angiospermes (de huit clades principaux, 21 ordres et 29 familles), quatre espèces de gymnospermes, trois espèces de fougères et une espèce de lycophytes. Notamment, les lectures brutes de ces 50 échantillons sont associées à des plastomes publiés [56,57,58,59], permettant une comparaison avec un plastome nouvellement réassemblé à l'aide de GetOrganelle. Depuis 2018, NOVOplasty a reçu plus de 400 citations pour l'assemblage du génome de chloroplastes dans Google Scholar (consulté le 31 décembre 2019) et est devenu l'un des outils les plus utilisés pour l'assemblage de plastomes. Nous avons ainsi réassemblé 50 échantillons en utilisant NOVOplasty pour les comparaisons.

Les ressources de données sont des lectures appariées. La longueur de lecture variait de 100 à 300 pb (Fichier supplémentaire 2 : Tableau S1). Dans tous les tests, si les données testées comprenaient moins de 10 000 000 de lectures pour chaque extrémité, nous avons utilisé toutes les lectures si les données comprenaient plus de 10 000 000 de lectures de chaque extrémité, nous sélectionnons uniquement les 10 000 000 premières lectures pour chaque extrémité. Nous avons mis en place quatre groupes de test, c'est-à-dire trois groupes avec des valeurs de taille de mot différentes (w = 0,6, 0,7, 0,8) (c'est-à-dire GetOrganelle-W0.6, GetOrganelle-W0.7, GetOrganelle-W0.8) et un auto- groupe de taille de mot estimée (c.-à-d. GetOrganelle-auto). Les séries d'extensions de tous les tests ont été définies sur 10. Toutes les autres options, y compris la valeur de départ, ont été définies par défaut. Étant donné que les assemblages incomplets ne conviennent pas pour comparer les qualités de cartographie dans la partie suivante, nous avons en outre ajouté des analyses supplémentaires pour huit échantillons, dans lesquels GetOrganelle-auto n'a pas pu obtenir des plastomes complets, avec des options personnalisées (GetOrganelle-customized) pour la comparaison de la qualité de cartographie. Un enregistrement détaillé des commandes, ainsi que les résultats finaux et les fichiers journaux enregistrant l'utilisation de la mémoire et le coût en temps de tous les tests sont disponibles sur https://github.com/Kinggerm/GetOrganelleComparison (version 1.1.1).

Les plastomes des mêmes 50 jeux de données ont également été réassemblés par NOVOplasty à l'aide de quatre k-valeurs mer, c'est-à-dire 23, 31, 39 et 47. Le fichier de configuration de NOVOplasty a été téléchargé à partir du référentiel NOVOplasty GitHub (https://github.com/ndierckx/NOVOPlasty/blob/master/config.txt), avec " Tapez » comme « chloro », « Genome Range » comme 15 000 à 180 000, « Enregistrer les lectures assemblées » comme « oui », « Seed Input » comme la même graine que l'exécution de GetOrganelle et « Read Length » comme longueur de lecture moyenne de chacun échantillon (graine Fichier supplémentaire 2), avec tous les autres paramètres inchangés.

Lire la cartographie pour évaluer les assemblages de plastomes

Le script "evaluate_assembly_using_mapping.py" a été utilisé pour évaluer les assemblages circulaires/non circulaires (Fig. 1, flèche grise pleine 8). Il utilise Bowtie2 pour mapper les lectures aux assemblages circulaires/non circulaires analyse le fichier SAM compte le nombre de lectures appariées et non appariées compte les bases correspondantes pour chaque site (M), les bases non concordantes pour chaque site (X), les insertions entre deux sites (I), et les suppressions pour chaque site (D) et calcule la moyenne et l'écart type de la profondeur appariée (ΣM et var(M)), la moyenne et l'écart type de la profondeur non appariée (ΣX et var(X)), moyenne et standard écart des insertions entre deux sites de référence quelconques (ΣI et var(I)), et écart moyen et standard des délétions par site de référence (ΣD et var(D)) pour chaque contig et l'ensemble de l'assemblage. Si ΣM > 0, un taux d'erreur personnalisé serait également calculé comme (ΣX + ΣI + ΣD)/ΣM avec un écart personnalisé comme (var(X) + var(I) + var(D))/ΣM. Si "--draw" est choisi, le script "evaluate_assembly_using_mapping.py" génère le tracé de M/X/I/D à chaque site/intervalle de site sur l'ensemble de l'assemblage à l'aide de la bibliothèque Python Matplotlib. Pour la reproductibilité lors de l'utilisation de la même graine aléatoire, une séquence assemblée circulaire a été relinéarisée pour s'assurer que biologiquement le même plastome circulaire aurait un début et une fin identiques depuis une séquence linéaire identique. Par défaut, Bowtie2 ne prend pas en charge les lectures de mappage vers une séquence circulaire, le script "evaluate_assembly_using_mapping.py" contourne ce problème en ajoutant un fragment supplémentaire de la tête de la séquence d'origine à la queue et en comptant les statistiques de mappage (M/X /I/D) des sites dans le fragment supplémentaire pour revenir aux statistiques de la partie de tête de la séquence d'origine.

Le script "evaluate_assembly_using_mapping.py" a été utilisé pour évaluer tous les plastomes assemblés. Les caractères anormaux, tels que « * » et « - » dans les assemblages au format FASTA de NOVOplasty, ont été remplacés par « N ». NOVOplasty produirait également plusieurs séquences complètement différentes avec le même nom de séquence dans les assemblages, qui seraient également modifiées avec des noms différents avant évaluation. Pour NOVOplasty, les statistiques d'évaluation de chaque échantillon étaient basées sur le meilleur résultat parmi ceux utilisant différents k-valeurs mer. Ici, le meilleur résultat est déterminé à son tour en étant véritablement circularisé, le plus grand nombre de lectures appariées mappées, le plus grand nombre de lectures non appariées mappées, la plus grande profondeur appariée, le plus petit taux d'erreur, le plus petit écart de profondeur appariée et le plus petit écart du taux d'erreur. Pour GetOrganelle, à l'exception de 8 échantillons qui ont été générés à l'aide des paramètres personnalisés, d'autres statistiques d'évaluation étaient basées sur les assemblages des analyses « GetOrganelle-auto ».

Pour chaque échantillon, lors de la comparaison des statistiques d'évaluation de différents assemblages, les « meilleures » lectures mappées (le chapeau dans le tableau S3) sont définies comme le plus grand nombre de lectures appariées mappées ou le nombre égal de lectures appariées mappées avec le plus grand nombre de lectures non appariées mappées la « meilleure » profondeur mappée est définie comme la plus grande profondeur appariée ou la plus grande profondeur appariée égale avec le plus petit écart de la profondeur appariée le « meilleur » taux d'erreur est défini comme le taux d'erreur le plus petit ou le taux d'erreur égal au plus petit avec le plus petit écart du taux d'erreur.

Assemblage de novo et évaluation des mitogénomes à l'aide de GetOrganelle et NOVOplasty

Au total, 56 échantillons animaux (les échantillons tests de MitoZ [14], voir Fichier supplémentaire 2 : Tableau S3) et 50 échantillons fongiques (Fichier supplémentaire 2 : Tableau S4) ont été utilisés pour tester la capacité de GetOrganelle à assembler des mitogénomes. Les mitogénomes des plantes ont généralement un taux de substitution de nucléotides relativement lent [9, 60], par conséquent, il est possible pour GetOrganelle d'obtenir des lectures suffisantes pour construire le graphique d'assemblage suffisant pour le mitogénome, même avec une graine apparentée à distance, à condition qu'il y ait une couverture suffisante. Cependant, il existe deux défis principaux pour les données de séquençage à lecture courte pour confirmer l'architecture du mitogénome. Premièrement, de nombreuses répétitions dans le mitogénome de la plante provoquent des enchevêtrements gênants dans le graphe d'assemblage [47, 61, 62]. Deuxièmement, la plupart des mitogénomes végétaux ne sont pas une structure circulaire unique, ils consistent souvent en une grande molécule circulaire et de petites molécules de type plasmide circulaires (type III), ou des molécules linéaires homogènes (type V) [63]. Il existe également de fréquents transferts horizontaux du plastome au mitogénome. Dans ce cas, lorsque la couverture du plastome est bien supérieure à celle du mitogénome, la multiplicité des contigs partagés serait difficile à estimer. Lorsque la couverture du plastome est similaire à celle du mitogénome, les contigs parallèles entre les contigs partagés seraient difficiles à distinguer. Ainsi, nous n'avons pas inclus les tests de mitogénome végétal en raison de l'impossibilité générale d'assembler un mitogénome végétal circularisé complet à partir des données WGS.

Les ressources de données sont des lectures appariées. La longueur de lecture variait de 92 à 301 pb (voir Fichier complémentaire 2 : Tableau S3, Tableau S4). Dans les tests sur animaux, si les données testées comprenaient moins de 75 000 000 de lectures pour chaque extrémité, nous avons utilisé toutes les lectures si les données étaient supérieures à 75 000 000 de lectures de chaque extrémité, nous n'avons utilisé que les 75 000 000 premières lectures pour chaque extrémité. Le même nombre maximum de lectures pour les champignons était de 15 000 000. Tous les tests GetOrganelle ont été effectués avec les paramètres par défaut avec le k-valeurs mer définies sur 21,43,65,87,127. Tous les tests NOVOplasty ont été effectués avec la valeur par défaut k-mer 39 (également été le meilleur k-mer dans l'analyse du plastome). Les commandes, les résultats et les fichiers journaux de tous les tests sont disponibles sur https://github.com/Kinggerm/GetOrganelleComparison (version 1.1.1).

Le script « slim_fastg.py » a été utilisé pour évaluer les assemblages de mitogénomes en générant le tableau des occurrences de gènes. « slim_fastg.py » pourrait effectuer une recherche BLAST dans la base de données d'étiquettes et générer un fichier cognominal au format TAB enregistrant de nombreuses informations de frappe des contigs. En résumant les hits de gènes de chaque contig, nous avons calculé le nombre de hits de gènes pour chaque assemblage.

Ressources informatiques pour les tests

Tous les assemblages ont été exécutés sur une machine CPU Intel Xeon contenant 144 cœurs de 2,40 GHz, un total de 3 To de RAM (64 Go de RAM sont suffisants pour tous les tests, tandis que les 3 To de RAM permettent d'exécuter différents tests simultanément), et configuré avec Linux (Linux version 3.10.0-514.el7.x86 (Red Hat 4.8.5-11)). L'environnement de test comprend également Python v3.6.5, Perl v5.16.3, GetOrganelle v1.6.2, Bowtie2 v2.3.5.1, SPAdes v3.13.0, BLAST 2.2.30+, Numpy v1.13.3, Scipy v0.19.1, Sympy v1 .1.1, Matplotlib v3.0.2, Psutil v5.4.7 et NOVOplasty 2.7.2 [23]. GetOrganelle est capable de multi-traitement dans le processus de mappage et d'assemblage, ce qui a été désactivé dans ce test pour être comparable à NOVOplasty. Les tests peuvent être reproduits en accédant à zenodo (doi : https://doi.org/10.5281/zenodo.3943877) ou à Github (https://github.org/Kinggerm/GetOrganelleComparison version 1.1.1).


Vaccin inactivé

Un vaccin inactivé (ou vaccin tué) est un vaccin composé de particules virales, de bactéries ou d'autres agents pathogènes qui ont été cultivés en culture puis tués pour détruire la capacité de production de maladies. En revanche, les vaccins vivants utilisent des agents pathogènes encore vivants (mais presque toujours atténués, c'est-à-dire affaiblis). Les agents pathogènes pour les vaccins inactivés sont cultivés dans des conditions contrôlées et sont tués afin de réduire l'infectiosité et ainsi prévenir l'infection par le vaccin. [1] Le virus est tué en utilisant une méthode telle que la chaleur ou le formaldéhyde. En plus des méthodes chimiques et physiques utilisées pour inactiver le virus, les bactéries et les champignons peuvent être inactivés en utilisant des méthodes de porosité douces pour produire des vaccins fantômes. Les fantômes bactériens sont des enveloppes cellulaires bactériennes intactes qui sont vidées de leur contenu par des méthodes de porosité biologiques ou chimiques douces. Les techniques fantômes augmentent la sécurité des vaccins tués, tout en maintenant leur antigénicité grâce à des procédures de préparation douces. De plus, les plates-formes fantômes peuvent exprimer et/ou porter plusieurs antigènes ou ADN plasmidique codant pour des épitopes protéiques. Selon le schéma de réponse immunitaire qu'ils suscitent, les vaccins fantômes sont considérés comme une phase intermédiaire entre les vaccins inactivés et atténués. [2]

Les vaccins inactivés sont en outre classés en fonction de la méthode utilisée pour inactiver le virus. [3] Vaccins à virus entier utiliser la particule virale entière, entièrement détruite par la chaleur, des produits chimiques ou des radiations. [4] Vaccins contre les virus fractionnés sont produits en utilisant un détergent pour perturber le virus. [3] Vaccins sous-unitaires sont produites en purifiant les antigènes qui stimulent le mieux le système immunitaire à monter une réponse au virus, tout en éliminant les autres composants nécessaires à la réplication ou à la survie du virus ou qui peuvent provoquer des effets indésirables. [3] [4]

Étant donné que les virus inactivés ont tendance à produire une réponse plus faible du système immunitaire que les virus vivants, des adjuvants immunologiques et de multiples injections de "rappel" peuvent être nécessaires pour fournir une réponse immunitaire efficace contre l'agent pathogène. [1] [3] [4] Les vaccins atténués sont souvent préférables pour les personnes généralement en bonne santé car une dose unique est souvent sûre et très efficace. Cependant, certaines personnes ne peuvent pas prendre de vaccins atténués car l'agent pathogène présente trop de risques pour elles (par exemple, les personnes âgées ou les personnes immunodéprimées). Pour ces patients, un vaccin inactivé peut fournir une protection.

Les particules pathogènes sont détruites et ne peuvent pas se diviser, mais les pathogènes conservent une partie de leur intégrité pour être reconnus par le système immunitaire et provoquer une réponse immunitaire adaptative. Lorsqu'il est fabriqué correctement, le vaccin n'est pas infectieux, mais une inactivation incorrecte peut entraîner des particules intactes et infectieuses.


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L'ARNi est un processus de silençage génique dépendant de l'ARN qui est contrôlé par le complexe de silençage induit par l'ARN (RISC) et est initié par de courtes molécules d'ARN double brin dans le cytoplasme d'une cellule, où elles interagissent avec le composant catalytique RISC argonaute. [5] Lorsque l'ARNdb est exogène (provenant d'une infection par un virus avec un génome à ARN ou de manipulations en laboratoire), l'ARN est importé directement dans le cytoplasme et clivé en fragments courts par Dicer. L'ARNdb initiateur peut également être endogène (provenant de la cellule), comme dans les pré-microARN exprimés à partir de gènes codant pour l'ARN dans le génome. Les transcrits primaires de ces gènes sont d'abord traités pour former la structure tige-boucle caractéristique du pré-miARN dans le noyau, puis exportés vers le cytoplasme. Ainsi, les deux voies ARNdb, exogène et endogène, convergent au niveau du RISC. [6]

L'ARNdb exogène initie l'ARNi en activant la protéine ribonucléase Dicer, [7] qui se lie et clive les ARN double brin (ARNdb) chez les plantes, ou les ARN en épingle à cheveux courts (ARNsh) chez l'homme, pour produire des fragments double brin de 20 à 25 paires de bases avec un surplomb de 2 nucléotides à l'extrémité 3'. [8] Les études bioinformatiques sur les génomes de plusieurs organismes suggèrent que cette longueur maximise la spécificité du gène cible et minimise les effets non spécifiques. [9] Ces courts fragments double brin sont appelés petits ARN interférents (siARN). Ces siRNA sont ensuite séparés en simple brin et intégrés dans un RISC actif, par RISC-Loading Complex (RLC).RLC comprend Dicer-2 et R2D2, et est crucial pour unir Ago2 et RISC. [10] Le facteur 11 associé à la protéine de liaison à TATA (TAF11) assemble le RLC en facilitant la tétramérisation de Dcr-2-R2D2, ce qui augmente de 10 fois l'affinité de liaison à l'ARNsi. L'association avec TAF11 convertirait le complexe R2-D2-Initiator (RDI) en RLC. [11] R2D2 porte des domaines de liaison à l'ARN double brin en tandem pour reconnaître l'extrémité thermodynamiquement stable des duplex siARN, tandis que Dicer-2 est l'autre extrémité moins stable. Le chargement est asymétrique : le domaine MID d'Ago2 reconnaît l'extrémité thermodynamiquement stable du siRNA. Par conséquent, le brin "passager" (sens) dont l'extrémité 5' est rejetée par MID est éjecté, tandis que le brin "guide" (antisens) enregistré coopère avec AGO pour former le RISC. [dix]

Après intégration dans le RISC, les siARN s'apparient à leur ARNm cible et le clivent, l'empêchant ainsi d'être utilisé comme matrice de traduction. [12] À la différence du siARN, un complexe RISC chargé de miARN scanne les ARNm cytoplasmiques pour une complémentarité potentielle. Au lieu d'un clivage destructeur (par Ago2), les miARN ciblent plutôt les régions 3' de la région non traduite (UTR) des ARNm où ils se lient généralement avec une complémentarité imparfaite, bloquant ainsi l'accès des ribosomes pour la traduction. [13]

L'ARNdb exogène est détecté et lié par une protéine effectrice, connue sous le nom de RDE-4 dans C. elegans et R2D2 en Drosophile, qui stimule l'activité des dés. [14] Le mécanisme produisant cette spécificité de longueur est inconnu et cette protéine ne lie que les longs ARNdb. [14]

Dans C. elegans cette réponse d'initiation est amplifiée par la synthèse d'une population de siRNA « secondaires » au cours de laquelle les siRNA initiateurs ou « primaires » produits par le dicer sont utilisés comme matrices. [15] Ces siRNA « secondaires » sont structurellement distincts des siRNA produits par dicer et semblent être produits par une ARN polymérase dépendante de l'ARN (RdRP). [16] [17]

MicroARN Modifier

Les microARN (miARN) sont des ARN non codants codés génomiquement qui aident à réguler l'expression des gènes, en particulier pendant le développement. [18] Le phénomène d'interférence ARN, au sens large, comprend les effets de silençage génique induits de manière endogène par les miARN ainsi que le silençage déclenché par l'ARNdb étranger. Les miARN matures sont structurellement similaires aux siARN produits à partir d'ARNdb exogène, mais avant d'atteindre la maturité, les miARN doivent d'abord subir une modification post-transcriptionnelle étendue. Un miARN est exprimé à partir d'un gène codant pour l'ARN beaucoup plus long en tant que transcrit primaire connu sous le nom de pri-miARN qui est transformé, dans le noyau cellulaire, en une structure tige-boucle de 70 nucléotides appelée pré-miARN par le complexe de microprocesseurs. Ce complexe se compose d'une enzyme RNase III appelée Drosha et d'une protéine de liaison à l'ARNdb DGCR8. La partie ARNdb de ce pré-miARN est liée et clivée par Dicer pour produire la molécule de miARN mature qui peut être intégrée dans le complexe RISC. Ainsi, le miARN et le siARN partagent la même machinerie cellulaire en aval. [19] Tout d'abord, le miARN viral codé a été décrit dans le virus d'Epstein-Barr (EBV). [20] Par la suite, un nombre croissant de microARN ont été décrits dans les virus. VIRmiRNA est un catalogue complet couvrant les microARN viraux, leurs cibles et les miARN anti-viraux [21] (voir aussi la ressource VIRmiRNA : http://crdd.osdd.net/servers/virmirna/).

Les siARN dérivés de longs précurseurs d'ARNdb diffèrent des miARN en ce que les miARN, en particulier ceux des animaux, ont généralement un appariement de bases incomplet à une cible et inhibent la traduction de nombreux ARNm différents avec des séquences similaires. En revanche, les siARN s'apparient généralement parfaitement et n'induisent le clivage de l'ARNm que dans une seule cible spécifique. [22] Dans Drosophile et C. elegans, les miARN et les siARN sont traités par des protéines argonautes et des enzymes dicer distinctes. [23] [24]

Trois régions et microARN non traduits principaux Modifier

Trois régions principales non traduites (3'UTR) des ARN messagers (ARNm) contiennent souvent des séquences régulatrices qui provoquent une interférence ARN post-transcriptionnelle. Ces 3'-UTR contiennent souvent à la fois des sites de liaison pour les microARN (miARN) ainsi que pour les protéines régulatrices. En se liant à des sites spécifiques dans la 3'-UTR, les miARN peuvent diminuer l'expression génique de divers ARNm en inhibant la traduction ou en provoquant directement la dégradation du transcrit. Le 3'-UTR peut également avoir des régions de silence qui se lient à des protéines répresseurs qui inhibent l'expression d'un ARNm.

Le 3'-UTR contient souvent des éléments de réponse microARN (MRE). Les MRE sont des séquences auxquelles les miARN se lient. Ce sont des motifs répandus dans les 3'-UTR. Parmi tous les motifs régulateurs au sein des 3'-UTR (par exemple, y compris les régions de silencieux), les MRE représentent environ la moitié des motifs.

En 2014, le site Web miRBase, [25] une archive de séquences et d'annotations de miARN, répertoriait 28 645 entrées dans 233 espèces biologiques. Parmi ceux-ci, 1 881 miARN se trouvaient dans des loci de miARN humains annotés. Les miARN devaient avoir en moyenne environ quatre cents ARNm cibles (affectant l'expression de plusieurs centaines de gènes). [26] Friedman et al. [26] estiment que >45 000 sites cibles de miARN dans les 3'UTR d'ARNm humains sont conservés au-dessus des niveaux de fond, et >60% des gènes codant pour des protéines humaines ont été soumis à une pression sélective pour maintenir l'appariement aux miARN.

Des expériences directes montrent qu'un seul miARN peut réduire la stabilité de centaines d'ARNm uniques. [27] D'autres expériences montrent qu'un seul miARN peut réprimer la production de centaines de protéines, mais que cette répression est souvent relativement légère (moins de 2 fois). [28] [29]

Les effets de la dérégulation de l'expression des gènes par les miARN semblent être importants dans le cancer. [30] Par exemple, dans les cancers gastro-intestinaux, neuf miARN ont été identifiés comme étant épigénétiquement modifiés et efficaces pour réguler à la baisse les enzymes de réparation de l'ADN. [31]

Les effets de la dérégulation de l'expression des gènes par les miARN semblent également être importants dans les troubles neuropsychiatriques, tels que la schizophrénie, le trouble bipolaire, la dépression majeure, la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer et les troubles du spectre autistique. [32] [33] [34]

Activation et catalyse RISC Modifier

L'ARNdb exogène est détecté et lié par une protéine effectrice, connue sous le nom de RDE-4 dans C. elegans et R2D2 en Drosophile, qui stimule l'activité des dés. [14] Cette protéine ne lie que les longs ARNdb, mais le mécanisme produisant cette spécificité de longueur est inconnu. [14] Cette protéine de liaison à l'ARN facilite ensuite le transfert des siARN clivés vers le complexe RISC. [35]

Dans C. elegans cette réponse d'initiation est amplifiée par la synthèse d'une population de siRNA « secondaires » au cours de laquelle les siRNA initiateurs ou « primaires » produits par le dicer sont utilisés comme matrices. [15] Ces siARN «secondaires» sont structurellement distincts des siARN produits par dicer et semblent être produits par une ARN polymérase dépendante de l'ARN (RdRP). [16] [17]

Pré-ARN en épingle à cheveux 60-70nt. Ce pré-miARN est transporté à travers le complexe de pores nucléaires (NPC) dans le cytoplasme, où Dicer le réduit davantage à un

Duplex de miARN 20nt (les pré-siARN entrent également dans la voie à cette étape). Ce duplex est ensuite chargé dans Ago pour former le "pré-RISC (complexe de silençage induit par l'ARN)" et le brin passager est libéré pour former le RISC actif.

Les composants actifs d'un complexe de silençage induit par l'ARN (RISC) sont des endonucléases appelées protéines argonaute, qui clivent le brin d'ARNm cible complémentaire de leur ARNsi lié. [5] Comme les fragments produits par dicer sont bicaténaires, ils pourraient chacun en théorie produire un siRNA fonctionnel. Cependant, un seul des deux volets, connu sous le nom de toron de guidage, se lie à la protéine argonaute et dirige le silençage génique. L'autre brin anti-guidage ou brin de passagers se dégrade lors de l'activation du RISC. [36] Bien que l'on ait d'abord cru qu'une hélicase dépendante de l'ATP séparait ces deux brins, [37] le processus s'est avéré être indépendant de l'ATP et exécuté directement par les composants protéiques de RISC. [38] [39] Cependant, un in vitro L'analyse cinétique de l'ARNi en présence et en l'absence d'ATP a montré que l'ATP peut être nécessaire pour dérouler et éliminer le brin d'ARNm clivé du complexe RISC après catalyse. [40] Le brin guide a tendance à être celui dont l'extrémité 5' est appariée de manière moins stable à son complément, [41] mais la sélection du brin n'est pas affectée par la direction dans laquelle dicer clive l'ARNdb avant l'incorporation de RISC. [42] Au lieu de cela, la protéine R2D2 peut servir de facteur de différenciation en se liant à l'extrémité 5' plus stable du brin passager. [43]

La base structurelle de la liaison de l'ARN à la protéine argonaute a été examinée par cristallographie aux rayons X du domaine de liaison d'une protéine argonaute liée à l'ARN. Ici, l'extrémité 5' phosphorylée du brin d'ARN pénètre dans une poche de surface basique conservée et établit des contacts via un cation divalent (un atome avec deux charges positives) tel que le magnésium et par empilement aromatique (un processus qui permet à plus d'un atome de partager un électron en le faisant passer dans les deux sens) entre le nucléotide 5' dans l'ARNsi et un résidu tyrosine conservé. On pense que ce site forme un site de nucléation pour la liaison de l'ARNsi à son ARNm cible. [44] L'analyse de l'effet inhibiteur des mésappariements à l'extrémité 5' ou 3' du brin guide a démontré que l'extrémité 5' du brin guide est probablement responsable de l'appariement et de la liaison de l'ARNm cible, tandis que l'extrémité 3' est responsable de l'agencement physique de l'ARNm cible dans une région RISC favorable au clivage. [40]

On ne comprend pas comment le complexe RISC activé localise les ARNm complémentaires dans la cellule. Bien qu'il ait été proposé que le processus de clivage soit lié à la traduction, la traduction de la cible d'ARNm n'est pas essentielle pour la dégradation médiée par l'ARNi. [45] En effet, l'ARNi peut être plus efficace contre les cibles d'ARNm qui ne sont pas traduites. [46] Les protéines Argonaute sont localisées dans des régions spécifiques du cytoplasme appelées corps P (également corps cytoplasmiques ou corps GW), qui sont des régions avec des taux élevés de désintégration de l'ARNm [47] l'activité des miARN est également regroupée dans les corps P. [48] ​​La perturbation des corps P diminue l'efficacité de l'interférence ARN, suggérant qu'ils sont un site critique dans le processus ARNi. [49]

Silencieux transcriptionnel Modifier

Les composants de la voie ARNi sont utilisés chez de nombreux eucaryotes dans le maintien de l'organisation et de la structure de leurs génomes. La modification des histones et l'induction associée de la formation d'hétérochromatine servent à réguler à la baisse les gènes de manière pré-transcriptionnelle [51] ce processus est appelé silençage transcriptionnel induit par l'ARN (RITS) et est réalisé par un complexe de protéines appelé complexe RITS. Dans la levure à fission, ce complexe contient de l'argonaute, une protéine chromodomaine Chp1 et une protéine appelée Tas3 de fonction inconnue. [52] En conséquence, l'induction et la propagation des régions hétérochromatiques nécessitent les protéines argonaute et RdRP. [53] En effet, la délétion de ces gènes chez la levure à fission S. pombe perturbe la méthylation des histones et la formation de centromères, [54] provoquant une anaphase lente ou bloquée pendant la division cellulaire. [55] Dans certains cas, des processus similaires associés à la modification des histones ont été observés pour réguler à la hausse la transcription des gènes. [56]

Le mécanisme par lequel le complexe RITS induit la formation et l'organisation de l'hétérochromatine n'est pas bien compris. La plupart des études se sont concentrées sur la région de type d'accouplement chez la levure à fission, qui peut ne pas être représentative des activités dans d'autres régions/organismes génomiques. Dans le maintien des régions d'hétérochromatine existantes, RITS forme un complexe avec des siARN complémentaires des gènes locaux et se lie de manière stable aux histones méthylées locales, agissant de manière co-transcriptionnelle pour dégrader tous les transcrits pré-ARNm naissants initiés par l'ARN polymérase. La formation d'une telle région d'hétérochromatine, mais pas son maintien, est dépendante de dicer, probablement parce que dicer est nécessaire pour générer le complément initial de siRNA qui ciblent les transcrits ultérieurs. [57] Il a été suggéré que le maintien de l'hétérochromatine fonctionne comme une boucle de rétroaction auto-renforçante, car de nouveaux siARN sont formés à partir des transcrits naissants occasionnels par RdRP pour être incorporés dans des complexes RITS locaux. [58] La pertinence des observations des régions de type accouplement de levure de fission et des centromères pour les mammifères n'est pas claire, car le maintien de l'hétérochromatine dans les cellules de mammifères peut être indépendant des composants de la voie ARNi. [59]

Diaphonie avec l'édition d'ARN Modifier

Le type d'édition d'ARN le plus répandu chez les eucaryotes supérieurs convertit les nucléotides d'adénosine en inosine dans les ARNdb via l'enzyme adénosine désaminase (ADAR). [60] Il a été initialement proposé en 2000 que les voies d'édition de l'ARNi et de l'ARN A→I pourraient rivaliser pour un substrat d'ARNdb commun. [61] Certains pré-miARN subissent une édition d'ARN A→I [62] [63] et ce mécanisme peut réguler le traitement et l'expression des miARN matures. [63] En outre, au moins un ADAR mammifère peut séquestrer les siARN des composants de la voie ARNi. [64] Un support supplémentaire pour ce modèle provient d'études sur ADAR-null C. elegans souches indiquant que l'édition de l'ARN A→I peut contrecarrer l'inhibition de l'ARNi des gènes et des transgènes endogènes. [65]

Variation parmi les organismes Modifier

Les organismes varient dans leur capacité à absorber l'ARNdb étranger et à l'utiliser dans la voie de l'ARNi. Les effets de l'interférence ARN peuvent être à la fois systémiques et héréditaires chez les plantes et C. elegans, mais pas dans Drosophile ou des mammifères. Chez les plantes, on pense que l'ARNi se propage par le transfert de siARN entre les cellules à travers les plasmodesmes (canaux dans les parois cellulaires qui permettent la communication et le transport). [37] L'héritabilité provient de la méthylation des promoteurs ciblés par l'ARNi, le nouveau modèle de méthylation est copié dans chaque nouvelle génération de la cellule. [67] Une large distinction générale entre les plantes et les animaux réside dans le ciblage des miARN produits de manière endogène chez les plantes, les miARN sont généralement parfaitement ou presque parfaitement complémentaires à leurs gènes cibles et induisent un clivage direct de l'ARNm par RISC, tandis que les miARN des animaux ont tendance à être plus divergentes en séquence et induisent une répression traductionnelle. [66] Cet effet traductionnel peut être produit en inhibant les interactions des facteurs d'initiation de la traduction avec la queue polyadénine de l'ARN messager. [68]

Certains protozoaires eucaryotes tels que Leishmania majeure et Trypanosoma cruzi manquent complètement de la voie ARNi. [69] [70] La plupart ou tous les composants sont également manquants dans certains champignons, notamment l'organisme modèle Saccharomyces cerevisiae. [71] La présence d'ARNi dans d'autres espèces de levures en herbe telles que Saccharomyces castellii et Candida albicans, démontre en outre que l'induction de deux protéines liées à l'ARNi à partir de S. castellii facilite l'ARNi dans S. cerevisiae. [72] Le fait que certains ascomycètes et basidiomycètes soient dépourvus de voies d'interférence ARN indique que les protéines nécessaires à l'extinction de l'ARN ont été perdues indépendamment de nombreuses lignées fongiques, peut-être en raison de l'évolution d'une nouvelle voie avec une fonction similaire, ou du manque d'avantage sélectif dans certains créneaux. [73]

Systèmes procaryotes apparentés Modifier

L'expression des gènes chez les procaryotes est influencée par un système basé sur l'ARN similaire à certains égards à l'ARNi. Ici, les gènes codant pour l'ARN contrôlent l'abondance ou la traduction de l'ARNm en produisant un ARN complémentaire qui s'hybride à un ARNm. Cependant, ces ARN régulateurs ne sont généralement pas considérés comme analogues aux miARN car l'enzyme dicer n'est pas impliquée. [74] Il a été suggéré que les systèmes d'interférence CRISPR chez les procaryotes sont analogues aux systèmes d'interférence d'ARN eucaryotes, bien qu'aucun des composants protéiques ne soit orthologue. [75]

Immunité Modifier

L'interférence ARN est une partie vitale de la réponse immunitaire aux virus et autres matériels génétiques étrangers, en particulier dans les plantes où elle peut également empêcher l'auto-propagation des transposons. [76] Des plantes telles que Arabidopsis thaliana expriment plusieurs homologues de dicer qui sont spécialisés pour réagir différemment lorsque la plante est exposée à différents virus. [77] Même avant que la voie de l'ARNi ne soit pleinement comprise, on savait que le silençage génique induit dans les plantes pouvait se propager dans toute la plante avec un effet systémique et pouvait être transféré du stock aux plants de scion par greffage. [78] Ce phénomène a depuis été reconnu comme une caractéristique du système immunitaire adaptatif de la plante et permet à la plante entière de répondre à un virus après une première rencontre localisée. [79] En réponse, de nombreux virus végétaux ont développé des mécanismes élaborés pour supprimer la réponse ARNi. [80] Ceux-ci incluent des protéines virales qui se lient à de courts fragments d'ARN double brin avec des extrémités en surplomb simple brin, telles que celles produites par dicer. [81] Certains génomes végétaux expriment également des siARN endogènes en réponse à une infection par des types spécifiques de bactéries. [82] Ces effets peuvent faire partie d'une réponse généralisée aux agents pathogènes qui régulent à la baisse tout processus métabolique chez l'hôte qui facilite le processus d'infection. [83]

Bien que les animaux expriment généralement moins de variantes de l'enzyme dicer que les plantes, l'ARNi chez certains animaux produit une réponse antivirale. Chez les juvéniles et les adultes Drosophile, l'interférence ARN est importante dans l'immunité innée antivirale et est active contre les agents pathogènes tels que le virus Drosophila X. [84] [85] Un rôle similaire dans l'immunité peut opérer dans C. elegans, car les protéines de l'argonaute sont régulées à la hausse en réponse aux virus et les vers qui surexpriment les composants de la voie ARNi sont résistants à l'infection virale. [86] [87]

Le rôle de l'interférence ARN dans l'immunité innée des mammifères est mal compris et relativement peu de données sont disponibles. Cependant, l'existence de virus qui codent pour des gènes capables de supprimer la réponse ARNi dans les cellules de mammifères peut être une preuve en faveur d'une réponse immunitaire mammifère dépendante de l'ARNi, [88] [89] bien que cette hypothèse ait été contestée car mal étayée. [90] Des preuves de l'existence d'une voie fonctionnelle antivirale ARNi dans les cellules de mammifères ont été présentées. [91] [92]

D'autres fonctions de l'ARNi dans les virus de mammifères existent également, telles que les miARN exprimés par le virus de l'herpès qui peuvent agir comme déclencheurs de l'organisation de l'hétérochromatine pour médier la latence virale. [93]

Régulation à la baisse des gènes Modifier

Les miARN exprimés de manière endogène, y compris les miARN introniques et intergéniques, sont les plus importants dans la répression traductionnelle [66] et dans la régulation du développement, en particulier sur le calendrier de la morphogenèse et le maintien de types cellulaires indifférenciés ou incomplètement différenciés tels que les cellules souches. [94] Le rôle des miARN exprimés de manière endogène dans la régulation négative de l'expression des gènes a été décrit pour la première fois dans C. elegans en 1993. [95] Chez les plantes, cette fonction a été découverte lorsque le "microARN JAW" de Arabidopsis s'est avéré impliqué dans la régulation de plusieurs gènes qui contrôlent la forme des plantes. [96] Chez les plantes, la majorité des gènes régulés par les miARN sont des facteurs de transcription [97] donc l'activité des miARN est particulièrement étendue et régule des réseaux de gènes entiers au cours du développement en modulant l'expression de gènes régulateurs clés, y compris les facteurs de transcription ainsi que F -boîte de protéines. [98] Dans de nombreux organismes, y compris les humains, les miARN sont liés à la formation de tumeurs et à la dérégulation du cycle cellulaire. Ici, les miARN peuvent fonctionner à la fois comme oncogènes et comme suppresseurs de tumeurs. [99]

Sur la base d'une analyse phylogénétique basée sur la parcimonie, l'ancêtre commun le plus récent de tous les eucaryotes possédait probablement déjà une voie d'interférence ARN précoce. L'absence de la voie chez certains eucaryotes est considérée comme une caractéristique dérivée. [100] Ce système ancestral d'ARNi contenait probablement au moins une protéine de type dicer, un argonaute, une protéine PIWI et une ARN polymérase dépendante de l'ARN qui pourrait également avoir joué d'autres rôles cellulaires. Une étude de génomique comparative à grande échelle indique également que le groupe couronne eucaryote possédait déjà ces composants, qui pourraient alors avoir eu des associations fonctionnelles plus étroites avec des systèmes de dégradation généralisés de l'ARN tels que l'exosome. [101] Cette étude suggère également que la famille des protéines argonautes liant l'ARN, qui est partagée entre les eucaryotes, la plupart des archées et au moins certaines bactéries (telles que Aquifex aeolicus), est homologue et a évolué à l'origine à partir des composants du système d'initiation de la traduction.

Renversement de gène Modifier

La voie d'interférence ARN est souvent exploitée en biologie expérimentale pour étudier la fonction des gènes en culture cellulaire et in vivo dans des organismes modèles. [5] L'ARN double brin est synthétisé avec une séquence complémentaire d'un gène d'intérêt et introduit dans une cellule ou un organisme, où il est reconnu comme matériel génétique exogène et active la voie ARNi. Grâce à ce mécanisme, les chercheurs peuvent provoquer une diminution drastique de l'expression d'un gène ciblé. L'étude des effets de cette diminution peut montrer le rôle physiologique du produit du gène. Étant donné que l'ARNi peut ne pas totalement abolir l'expression du gène, cette technique est parfois appelée « knockdown », pour la distinguer des procédures de « knockout » dans lesquelles l'expression d'un gène est entièrement éliminée. [102] Dans une étude récente, la validation de l'efficacité de l'inhibition de l'ARNi à l'aide de données de matrices génétiques a montré un taux d'échec de 18,5% dans 429 expériences indépendantes. [103]

Des efforts considérables en biologie computationnelle ont été dirigés vers la conception de réactifs ARNdb efficaces qui maximisent le knock-down des gènes mais minimisent les effets « hors cible ». Des effets hors cible surviennent lorsqu'un ARN introduit a une séquence de bases qui peut s'apparier avec et ainsi réduire l'expression de plusieurs gènes. De tels problèmes surviennent plus fréquemment lorsque l'ARNdb contient des séquences répétitives. Il a été estimé à partir de l'étude des génomes humains, C. elegans et S. pombe qu'environ 10% des siARN possibles ont des effets hors cible substantiels. [9] Une multitude d'outils logiciels ont été développés mettant en œuvre des algorithmes pour la conception d'ARNsi généraux [104] [105] spécifiques aux mammifères, [106] et spécifiques au virus [107] qui sont automatiquement vérifiés pour une éventuelle réactivité croisée.

Selon l'organisme et le système expérimental, l'ARN exogène peut être un long brin conçu pour être clivé par dicer, ou des ARN courts conçus pour servir de substrats de siRNA. Dans la plupart des cellules de mammifères, des ARN plus courts sont utilisés car de longues molécules d'ARN double brin induisent la réponse à l'interféron des mammifères, une forme d'immunité innée qui réagit de manière non spécifique au matériel génétique étranger. [108] Les ovocytes de souris et les cellules d'embryons de souris précoces n'ont pas cette réaction à l'ARNdb exogène et constituent donc un système modèle commun pour étudier les effets de neutralisation des gènes chez les mammifères. [109] Des techniques de laboratoire spécialisées ont également été développées pour améliorer l'utilité de l'ARNi dans les systèmes de mammifères en évitant l'introduction directe de siARN, par exemple, par transfection stable avec un plasmide codant la séquence appropriée à partir de laquelle les siARN peuvent être transcrits, [110] soit par des systèmes de vecteurs lentiviraux plus élaborés permettant l'activation ou la désactivation inductible de la transcription, appelés ARNi conditionnel. [111] [112]

Génomique fonctionnelle Modifier


Les approches de la conception de bibliothèques d'ARNi à l'échelle du génome peuvent nécessiter plus de sophistication que la conception d'un seul ARNsi pour un ensemble défini de conditions expérimentales. Les réseaux de neurones artificiels sont fréquemment utilisés pour concevoir des bibliothèques d'ARNsi [113] et pour prédire leur efficacité probable lors de la suppression des gènes. [114] Le criblage génomique de masse est largement considéré comme une méthode prometteuse pour l'annotation du génome et a déclenché le développement de méthodes de criblage à haut débit basées sur les puces à ADN. [115] [116] Cependant, l'utilité de ces écrans et la capacité des techniques développées sur des organismes modèles à se généraliser à des espèces même étroitement apparentées ont été remises en question, par exemple à partir de C. elegans aux nématodes parasites apparentés. [117] [118]

Médecine Modifier

Histoire de l'utilisation de l'ARNi en médecine

Le premier cas de silençage de l'ARN chez les animaux a été documenté en 1996, lorsque Guo et Kemphues ont observé qu'en introduisant de l'ARN sens et antisens à l'ARNm par-1 dans Caenorhabditis elegans a causé la dégradation du message par-1. [119] On pensait que cette dégradation était déclenchée par l'ARN simple brin (ARNss), mais deux ans plus tard, en 1998, Fire et Mello ont découvert que cette capacité à faire taire l'expression du gène par-1 était en fait déclenchée par ARN (ARNdb). [119] Ils finiraient par partager le prix Nobel de physiologie ou de médecine pour cette découverte. [120] Juste après la découverte révolutionnaire de Fire et Mello, Elbashir et al. découvert, en utilisant de petits ARN interférents synthétiques (ARNsi), il était possible de cibler le silence de séquences spécifiques dans un gène, plutôt que de faire taire le gène entier. [121] Seulement un an plus tard, McCaffrey et ses collègues ont démontré que ce silençage spécifique à une séquence avait des applications thérapeutiques en ciblant une séquence du virus de l'hépatite C chez des souris transgéniques. [122] Depuis lors, plusieurs chercheurs ont tenté d'étendre les applications thérapeutiques de l'ARNi, en cherchant spécifiquement à cibler les gènes qui causent divers types de cancer. [123] [124] En 2006, les premières applications pour atteindre les essais cliniques étaient dans le traitement de la dégénérescence maculaire et du virus respiratoire syncytial. [125] Quatre ans plus tard, le premier essai clinique de phase I chez l'homme a été lancé, utilisant un système de délivrance de nanoparticules pour cibler les tumeurs solides. [126] Bien que la plupart des recherches se penchent actuellement sur les applications de l'ARNi dans le traitement du cancer, la liste des applications possibles est longue. L'ARNi pourrait potentiellement être utilisé pour traiter les virus, [127] les maladies bactériennes, [128] les parasites, [129] les mutations génétiques inadaptées, [130] contrôler la consommation de médicaments, [131] soulager la douleur, [132] et même moduler le sommeil. [133]

Applications thérapeutiques Modifier

Infection virale Modifier

Le traitement antiviral est l'une des premières applications médicales proposées basées sur l'ARNi, et deux types différents ont été développés. Le premier type consiste à cibler les ARN viraux. De nombreuses études ont montré que le ciblage des ARN viraux peut supprimer la réplication de nombreux virus, dont le VIH, [134] HPV, [135] hépatite A, [136] hépatite B, [137] influenza virus, [138] [139] [140 ] [141] virus respiratoire syncytial (RSV), [141] coronavirus du SRAS (SARS-CoV), [141] adénovirus [141] et virus de la rougeole. [142] L'autre stratégie consiste à bloquer les entrées virales initiales en ciblant les gènes de la cellule hôte. [143] Par exemple, la suppression des récepteurs des chimiokines (CXCR4 et CCR5) sur les cellules hôtes peut empêcher l'entrée du virus VIH. [144]

Cancer Modifier

Alors que la chimiothérapie traditionnelle peut tuer efficacement les cellules cancéreuses, le manque de spécificité pour discriminer les cellules normales et les cellules cancéreuses dans ces traitements provoque généralement des effets secondaires graves. De nombreuses études ont démontré que l'ARNi peut fournir une approche plus spécifique pour inhiber la croissance tumorale en ciblant les gènes liés au cancer (c'est-à-dire l'oncogène). [145] Il a également été proposé que l'ARNi puisse améliorer la sensibilité des cellules cancéreuses aux agents chimiothérapeutiques, offrant une approche thérapeutique combinatoire avec la chimiothérapie. [146] Un autre traitement potentiel basé sur l'ARNi consiste à inhiber l'invasion et la migration cellulaires. [147]

Maladies neurologiques Modifier

Les stratégies d'ARNi montrent également un potentiel pour le traitement des maladies neurodégénératives. Des études sur des cellules et sur des souris ont montré que le ciblage spécifique des gènes producteurs de bêta-amyloïde (par exemple BACE1 et APP) par l'ARNi peut réduire considérablement la quantité de peptide Aβ qui est corrélée à la cause de la maladie d'Alzheimer. [148] [149] [150] En outre, ces approches basées sur le silence fournissent également des résultats prometteurs dans le traitement de la maladie de Parkinson et de la maladie de la polyglutamine. [151] [152] [153]

Difficultés d'application thérapeutique Modifier

Pour atteindre le potentiel clinique de l'ARNi, l'ARNsi doit être efficacement transporté vers les cellules des tissus cibles. Cependant, il existe diverses barrières qui doivent être levées avant qu'il puisse être utilisé en clinique. Par exemple, le siRNA « nu » est sensible à plusieurs obstacles qui réduisent son efficacité thérapeutique. [154] De plus, une fois que l'ARNsi est entré dans la circulation sanguine, l'ARN nu peut être dégradé par les nucléases sériques et peut stimuler le système immunitaire inné. [154] En raison de sa taille et de sa nature hautement polyanionique (contenant des charges négatives sur plusieurs sites), les molécules d'ARNsi non modifiées ne peuvent pas facilement pénétrer dans les cellules à travers la membrane cellulaire. Par conséquent, des siARN artificiels ou encapsulés dans des nanoparticules doivent être utilisés. Cependant, le transport de l'ARNsi à travers la membrane cellulaire a toujours ses propres défis uniques. Si l'ARNsi est transféré à travers la membrane cellulaire, des toxicités involontaires peuvent survenir si les doses thérapeutiques ne sont pas optimisées, et les ARNsi peuvent présenter des effets hors cible (par exemple, une régulation négative involontaire des gènes avec une complémentarité de séquence partielle). [155] Même après avoir pénétré dans les cellules, des doses répétées sont nécessaires car leurs effets sont dilués à chaque division cellulaire. Comme décrit précédemment, les parties du vecteur qui transportent l'ARNdb peuvent également avoir des effets régulateurs. Par conséquent, les effets secondaires non spécifiques doivent être pris en compte et contrôlés. [156]

Traitement du cancer Modifier

Par rapport à la chimiothérapie ou à d'autres médicaments anticancéreux, le médicament siRNA présente de nombreux avantages. [157] SiRNA agit sur le stade post-transcriptionnel de l'expression génique, il ne modifie pas ou ne change pas l'ADN avec un effet délétère. [157] L'ARNsi peut également être utilisé pour produire une réponse spécifique d'un certain type de manière, par exemple en dégradant la suppression de l'expression génique. [157] Dans une seule cellule cancéreuse, l'ARNsi peut provoquer une suppression dramatique de l'expression des gènes avec seulement plusieurs copies. [157] Cela se produit en faisant taire les gènes favorisant le cancer avec l'ARNi, ainsi qu'en ciblant une séquence d'ARNm. [157]

Les médicaments ARNi traitent le cancer en faisant taire certains gènes favorisant le cancer. [157] Cela se fait en complétant les gènes du cancer avec l'ARNi, par exemple en conservant les séquences d'ARNm conformément au médicament ARNi. [157] Idéalement, l'ARNi doit être injecté et/ou modifié chimiquement afin que l'ARNi puisse atteindre les cellules cancéreuses plus efficacement. [157] L'absorption et la régulation de l'ARNi sont surveillées par les reins. [157]

Stimulation de la réponse immunitaire Modifier

Le système immunitaire humain est divisé en deux branches distinctes : le système immunitaire inné et le système immunitaire adaptatif. [158] Le système immunitaire inné est la première défense contre l'infection et répond aux agents pathogènes de manière générique. [158] D'autre part, le système immunitaire adaptatif, un système qui a évolué plus tard que l'inné, est composé principalement de cellules B et T hautement spécialisées qui sont entraînées à réagir à des portions spécifiques de molécules pathogènes. [158]

Le défi entre les anciens et les nouveaux agents pathogènes a contribué à créer un système de cellules et de particules protégées qui sont appelées cadre sûr. [158] Ce cadre a donné aux humains une armée de systèmes qui recherchent et détruisent les particules envahissantes, telles que les agents pathogènes, les organismes microscopiques, les parasites et les infections. [158] Le cadre sécuritaire pour les mammifères s'est développé pour incorporer le siRNA comme un outil pour indiquer la contamination virale, ce qui a permis au siRNA de créer une réponse immunitaire innée intense. [158]

Le siRNA est contrôlé par le système immunitaire inné, qui peut être divisé en réponses inflammatoires aiguës et réponses antivirales. [158] La réponse inflammatoire est créée avec des signaux provenant de petites molécules de signalisation, ou cytokines. [158] Ceux-ci incluent l'interleukine-1 (IL-1), l'interleukine-6 ​​(IL-6), l'interleukine-12 (IL-12) et le facteur de nécrose tumorale α (TNF-α). [158] Le système immunitaire inné génère une inflammation et des réponses antivirales, qui provoquent la libération des récepteurs de reconnaissance de formes (PRR). [158] Ces récepteurs aident à identifier les agents pathogènes qui sont des virus, des champignons ou des bactéries. [158] De plus, l'importance des siARN et du système immunitaire inné est d'inclure plus de PRR pour aider à reconnaître différentes structures d'ARN. [158] Cela rend plus probable que le siRNA provoque une réponse immunostimulante dans le cas de l'agent pathogène. [158]

Les perspectives comme technique thérapeutique Modifier

Des études cliniques de phase I et II sur les thérapies par siRNA menées entre 2015 et 2017 ont démontré un knock-down puissant et durable des gènes dans le foie, avec quelques signes d'amélioration clinique et sans toxicité inacceptable. [155] Deux études de phase III sont en cours pour traiter les syndromes familiaux neurodégénératifs et cardiaques causés par des mutations de la transthyrétine (TTR). [155] De nombreuses publications ont montré que les systèmes de délivrance in vivo sont très prometteurs et présentent des caractéristiques diverses, permettant de nombreuses applications. Le système d'administration de nanoparticules est le plus prometteur, mais cette méthode présente des défis supplémentaires dans l'intensification du processus de fabrication, tels que la nécessité de processus de mélange étroitement contrôlés pour obtenir une qualité constante du produit médicamenteux. [154]

Le tableau ci-dessous montre différents médicaments utilisant l'interférence ARN et quels étaient leurs phases et leur statut dans les essais cliniques en 2013. [154]

Médicament Cible Système de livraison Maladie Phase Statut Société Identifiant
ALN–VSP02 KSP et VEGF TNL Tumeurs solides je Complété Produits pharmaceutiques alnylam NCT01158079
siRNA–EphA2–DOPC EphA2 TNL Cancers avancés je Recrutement Centre de cancérologie MD Anderson NCT01591356
Atu027 PKN3 TNL Tumeurs solides je Complété Thérapeutique du silence NCT00938574
TKM–080301 PLK1 TNL Cancer je Recrutement Tekmira Pharmaceutique NCT01262235
TKM–100201 VP24, VP35, Zaïre Ebola L-polymérase TNL Infection à virus Ebola je Recrutement Tekmira Pharmaceutique NCT01518881
ALN–RSV01 nucléocapside du VRS ARNsi nu Infections à virus respiratoire syncytial II Complété Produits pharmaceutiques alnylam NCT00658086
PRO-040201 ApoB TNL Hypercholestérolémie je Terminé Tekmira Pharmaceutique NCT00927459
ALN–PCS02 PCSK9 TNL Hypercholestérolémie je Complété Produits pharmaceutiques alnylam NCT01437059
ALN–TTR02 TTR TNL Amylose médiée par la transthyrétine II Recrutement Produits pharmaceutiques alnylam NCT01617967
CALAA-01 RRM2 Cyclodextrine NP Tumeurs solides je actif Pharmacie Calando NCT00689065
TD101 K6a (mutation N171K) ARNsi nu Pachyonychie congénitale je Complété Projet Pachyonychia Congenita NCT00716014
AGN211745 VEGFR1 ARNsi nu Dégénérescence maculaire liée à l'âge, néovascularisation choroïdienne II Terminé Allergan NCT00395057
QPI-1007 CASP2 ARNsi nu Atrophie optique, neuropathie optique ischémique antérieure non artéritique je Complété Quark Pharmaceuticals NCT01064505
I5NP p53 ARNsi nu Lésion rénale, insuffisance rénale aiguë je Complété Quarks pharmaceutiques NCT00554359
Fonction du greffon retardée, complications de la greffe de rein je, je Recrutement Quarks pharmaceutiques NCT00802347
PF-655 (PF-04523655) RTP801 (cible propriétaire) ARNsi nu Néovascularisation choroïdienne, rétinopathie diabétique, œdème maculaire diabétique II actif Quark Pharmaceuticals NCT01445899
CHARGEUR siG12D KRAS polymère LODER Cancer du pancréas II Recrutement Silenseed NCT01676259
Bévasiranib VEGF ARNsi nu odème maculaire diabétique, dégénérescence maculaire II Complété Santé Opko NCT00306904
SYL1001 TRPV1 ARNsi nu Douleur oculaire, syndrome des yeux secs je, je Recrutement Sylentis NCT01776658
SYL040012 ADRB2 ARNsi nu Hypertension oculaire, glaucome à angle ouvert II Recrutement Sylentis NCT01739244
CEQ508 CTNNB1 ARNsh porteur d'Escherichia coli Polypose adénomateuse familiale je, je Recrutement Marina Biotech Inconnu
RXi-109 CTGF Composé ARNi auto-délivrant Prévention des cicatrices cicatricielles je Recrutement Produits pharmaceutiques RXi NCT01780077
ALN–TTRsc TTR Conjugué siARN–GalNAc Amylose médiée par la transthyrétine je Recrutement Produits pharmaceutiques alnylam NCT01814839
ARC-520 Régions conservées du VHB DPC VHB je Recrutement Recherche de pointe de flèche NCT01872065

Biotechnologie Modifier

L'interférence ARN a été utilisée pour des applications en biotechnologie et est sur le point d'être commercialisée dans d'autres domaines. L'ARNi a abouti à l'invention de nouvelles cultures telles que le tabac sans nicotine, le café décaféiné, la végétation enrichie en nutriments et les cultures hypoallergéniques. Les pommes arctiques génétiquement modifiées ont reçu l'approbation de la FDA en 2015. [159] Les pommes ont été produites par suppression par ARNi du gène PPO (polyphénol oxydase), créant des variétés de pommes qui ne bruniront pas après avoir été tranchées. Les pommes sans PPO sont incapables de convertir l'acide chlorogénique en produit de quinone standard. [1]

Il existe plusieurs opportunités pour les applications de l'ARNi en phytotechnie pour son amélioration, telles que la tolérance au stress et l'amélioration du niveau nutritionnel. L'ARNi prouvera son potentiel d'inhibition de la photorespiration pour améliorer la productivité des plantes C3. Cette technologie knockdown peut être utile pour induire une floraison précoce, une maturation retardée, une sénescence retardée, briser la dormance, des plantes sans stress, surmonter l'auto-stérilité, etc. [1]

Aliments Modifier

L'ARNi a été utilisé pour modifier génétiquement des plantes afin de produire des niveaux inférieurs de toxines végétales naturelles. De telles techniques tirent parti du phénotype ARNi stable et héréditaire dans les stocks de plantes. Les graines de coton sont riches en protéines alimentaires mais contiennent naturellement le produit terpénoïde toxique gossypol, les rendant impropres à la consommation humaine. L'ARNi a été utilisé pour produire des stocks de coton dont les graines contiennent des niveaux réduits de delta-cadinène synthase, une enzyme clé dans la production de gossypol, sans affecter la production de l'enzyme dans d'autres parties de la plante, où le gossypol est lui-même important pour prévenir les dommages causés par les ravageurs des plantes. [160] Des efforts similaires ont été dirigés vers la réduction de la linamarine, produit naturel cyanogène dans les plants de manioc. [161]

Aucun produit végétal utilisant le génie génétique basé sur l'ARNi n'est encore sorti du stade expérimental. Les efforts de développement ont réussi à réduire les niveaux d'allergènes dans les plants de tomates [162] et à fortifier des plantes telles que les tomates avec des antioxydants alimentaires. [163] Les produits commerciaux précédents, y compris la tomate Flavr Savr et deux cultivars de papaye résistante aux taches annulaires, ont été développés à l'origine à l'aide de la technologie antisens, mais ont probablement exploité la voie ARNi. [164] [165] Le silençage par ARNi de l'alpha-amylase a également été utilisé pour diminuer la croissance fongique d'Aspergillus flavus dans le maïs qui aurait autrement contaminé les grains avec des aflatoxines dangereuses. [166] L'inactivation du facteur lacrymogène synthase dans les oignons a produit des oignons sans larmes et l'ARNi a été utilisé dans les gènes BP1 des graines de colza pour améliorer la photosynthèse. [167] Les gènes SBEIIa et SBEIIb du blé ont été ciblés dans le blé afin de produire des niveaux plus élevés d'amylose afin d'améliorer la fonction intestinale. [168]

Autres cultures Modifier

Un autre effort a diminué les précurseurs de substances cancérigènes probables dans les plants de tabac. [169] D'autres traits végétaux qui ont été modifiés en laboratoire comprennent la production de produits naturels non narcotiques par le pavot à opium [170] et la résistance aux virus végétaux courants. [171]

Insecticide Modifier

L'ARNi est en cours de développement en tant qu'insecticide, en utilisant plusieurs approches, y compris le génie génétique et l'application topique. [3] Les cellules de l'intestin moyen de certains insectes absorbent les molécules d'ARNdb dans le processus appelé ARNi environnemental. [172] Chez certains insectes, l'effet est systémique car le signal se propage dans tout le corps de l'insecte (appelé ARNi systémique). [173]

Les animaux exposés à l'ARNi à des doses des millions de fois supérieures aux niveaux d'exposition humaine anticipés ne présentent aucun effet indésirable. [174]

L'ARNi a des effets variables chez différentes espèces de lépidoptères (papillons et mites). [175] Peut-être parce que leur salive et leur jus intestinal décomposent mieux l'ARN, le ver de la capsule du coton, la légionnaire de la betterave et le foreur du riz asiatique n'ont jusqu'à présent pas été prouvés sensibles à l'ARNi en se nourrissant. [3]

Des preuves récentes suggèrent que la résistance à l'ARNi pourrait être à large spectre, ce qui signifie que la résistance à une séquence pourrait conférer une résistance à d'autres séquences d'ARNdb. Dans une population de laboratoire de chrysomèle des racines du maïs, la résistance s'est produite en raison d'un manque d'absorption de l'ARNdb DvSnf7 dans l'intestin. [176] Lorsque d'autres séquences d'ARNdb ont été testées contre DvSnf7, les autres séquences n'étaient plus efficaces, ce qui suggère que la gestion de la résistance serait plus difficile que de simplement changer les séquences d'ARNdb. En combinant plusieurs stratégies, telles que l'ingénierie de la protéine Cry, dérivée d'une bactérie appelée Bacillus thuringiensis (Bt) et l'ARNi dans une plante retardent l'apparition de la résistance. [3] [177]

Plantes transgéniques Modifier

Des cultures transgéniques ont été conçues pour exprimer l'ARNdb, soigneusement choisies pour faire taire les gènes cruciaux des ravageurs cibles. Ces ARNdb sont conçus pour affecter uniquement les insectes qui expriment des séquences de gènes spécifiques. Comme preuve de principe, en 2009, une étude a montré des ARN qui pouvaient tuer l'une des quatre espèces de mouches des fruits sans nuire aux trois autres. [3]

En 2012, Syngenta a acheté la société belge d'ARNi Devgen pour 522 millions de dollars et Monsanto a payé 29,2 millions de dollars pour les droits exclusifs de propriété intellectuelle d'Alnylam Pharmaceuticals. Le Centre international de la pomme de terre à Lima, au Pérou, recherche des gènes à cibler chez le charançon de la patate douce, un coléoptère dont les larves ravagent les patates douces dans le monde. D'autres chercheurs tentent de faire taire les gènes chez les fourmis, les chenilles et les coléoptères. Monsanto sera probablement le premier à commercialiser, avec une graine de maïs transgénique qui exprime l'ARNdb basé sur le gène Snf7 de la chrysomèle des racines du maïs, un coléoptère dont les larves causent chaque année un milliard de dollars de dégâts aux seuls États-Unis. Un article de 2012 a montré que le silence Snf7 retarde la croissance des larves, les tuant en quelques jours. En 2013, la même équipe a montré que l'ARN affecte très peu d'autres espèces. [3]

Modifier l'actualité

Alternativement, l'ARNdb peut être fourni sans génie génétique. Une approche consiste à les ajouter à l'eau d'irrigation. Les molécules sont absorbées dans le système vasculaire des plantes et empoisonnent les insectes qui s'en nourrissent. Une autre approche consiste à pulvériser de l'ARNdb comme un pesticide conventionnel. Cela permettrait une adaptation plus rapide à la résistance. De telles approches nécessiteraient des sources d'ARNdb à faible coût qui n'existent pas actuellement. [3]

Dépistage à l'échelle du génome Modifier

La recherche sur l'ARNi à l'échelle du génome repose sur la technologie de criblage à haut débit (HTS). La technologie ARNi HTS permet un criblage de perte de fonction à l'échelle du génome et est largement utilisée dans l'identification de gènes associés à des phénotypes spécifiques. Cette technologie a été saluée comme une deuxième vague génomique potentielle, après la première vague génomique de microarrays d'expression génique et de plates-formes de découverte du polymorphisme d'un seul nucléotide. [178] Un avantage majeur du criblage d'ARNi à l'échelle du génome est sa capacité à interroger simultanément des milliers de gènes. Avec la capacité de générer une grande quantité de données par expérience, le criblage d'ARNi à l'échelle du génome a conduit à une explosion des taux de génération de données. L'exploitation d'ensembles de données aussi volumineux est un défi fondamental, nécessitant des méthodes statistiques/bioinformatiques adaptées. Le processus de base du criblage d'ARNi basé sur les cellules comprend le choix d'une bibliothèque d'ARNi, de types de cellules robustes et stables, la transfection avec des agents d'ARNi, le traitement/incubation, la détection de signaux, l'analyse et l'identification de gènes importants ou de cibles thérapeutiques. [179]

Le processus de l'ARNi a été appelé « co-suppression » et « suppression » lorsqu'il était observé avant la connaissance d'un mécanisme lié à l'ARN. La découverte de l'ARNi a été précédée d'abord par des observations d'inhibition transcriptionnelle par l'ARN antisens exprimé dans des plantes transgéniques, [181] et plus directement par des rapports de résultats inattendus dans des expériences menées par des scientifiques des plantes aux États-Unis et aux Pays-Bas au début des années 1990. [182] Dans une tentative de modifier les couleurs des fleurs des pétunias, les chercheurs ont introduit des copies supplémentaires d'un gène codant pour la chalcone synthase, une enzyme clé pour la pigmentation des fleurs dans les plantes de pétunia de couleur normalement rose ou violette. Le gène surexprimé devait entraîner des fleurs plus foncées, mais à la place, certaines fleurs avaient un pigment violet moins visible, parfois dans des motifs panachés, indiquant que l'activité de la chalcone synthase avait été considérablement réduite ou avait été supprimée d'une manière spécifique au contexte. Cela s'expliquerait plus tard comme le résultat de l'insertion du transgène adjacent aux promoteurs dans la direction opposée dans diverses positions à travers les génomes de certains transformants, conduisant ainsi à l'expression de transcrits antisens et à l'extinction du gène lorsque ces promoteurs sont actifs. Une autre observation précoce de l'ARNi est venue d'une étude du champignon Neurospora crassa, [183] ​​bien qu'il n'ait pas été immédiatement reconnu comme apparenté. Une étude plus approfondie du phénomène chez les plantes a indiqué que la régulation négative était due à une inhibition post-transcriptionnelle de l'expression génique via un taux accru de dégradation de l'ARNm. [184] Ce phénomène a été appelé co-suppression de l'expression des gènes, mais le mécanisme moléculaire est resté inconnu. [185]

Peu de temps après, des virologistes végétaux travaillant sur l'amélioration de la résistance des plantes aux maladies virales ont observé un phénomène inattendu similaire. Alors qu'il était connu que les plantes exprimant des protéines spécifiques du virus présentaient une tolérance ou une résistance accrue à l'infection virale, on ne s'attendait pas à ce que les plantes portant uniquement de courtes régions non codantes de séquences d'ARN viral présentent des niveaux de protection similaires. Les chercheurs pensaient que l'ARN viral produit par les transgènes pouvait également inhiber la réplication virale. [186] L'expérience inverse, dans laquelle de courtes séquences de gènes végétaux ont été introduites dans des virus, a montré que le gène ciblé était supprimé dans une plante infectée. [187] Ce phénomène a été étiqueté « induction de gène induite par le virus » (VIGS), et l'ensemble de ces phénomènes a été collectivement appelé silençage génique post-transcriptionnel. [188]

Après ces premières observations chez les plantes, les laboratoires ont recherché ce phénomène chez d'autres organismes. [189] [190] Craig C. Mello et Andrew Fire's 1998 La nature article a rapporté un puissant effet de silençage génique après l'injection d'ARN double brin dans C. elegans. [191] En étudiant la régulation de la production de protéines musculaires, ils ont observé que ni les injections d'ARNm ni d'ARN antisens n'avaient d'effet sur la production de protéines, mais que l'ARN double brin a réussi à faire taire le gène ciblé. À la suite de ce travail, ils ont inventé le terme ARNi. Cette découverte a représenté la première identification de l'agent causal du phénomène. Fire et Mello ont reçu en 2006 le prix Nobel de physiologie ou médecine. [5]

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Éditeur de numéros spéciaux

Tous les organismes vivants sont constamment en contact avec des xénobiotiques, par exemple des médicaments, des colorants et additifs alimentaires, des préparations cosmétiques et des contaminants environnementaux. Chaque xénobiotique, qu'il soit pris intentionnellement ou par inadvertance, représente une charge et un danger potentiels pour le consommateur. Par conséquent, les organismes ont des systèmes par lesquels ils métabolisent, désactivent et excrètent les xénobiotiques et les enzymes dites métabolisant les médicaments. Les xénobiotiques et leurs métabolites diffèrent par leur structure, leurs propriétés physico-chimiques, leur activité biologique et leurs comportements dans les organismes. L'identification des métabolites émergents est essentielle pour la formation de la pharmacocinétique, de la toxicocinétique et la détermination de la toxicité de chaque xénobiotique dans les tests de médicaments ainsi que dans les études toxicologiques et environnementales. Récemment, le développement rapide des méthodes analytiques a permis de découvrir des métabolites auparavant indétectables.

Ce numéro spécial de IJMS couvrira une sélection de sujets de recherche récents et d'articles de revue en cours dans le domaine de l'identification et de la quantification des métabolites xénobiotiques dans divers organismes (humains, animaux, invertébrés, plantes, etc.). Les chercheurs sont cordialement invités à soumettre des travaux pertinents à ces sujets.

Prof. Dr. Barbora Szotáková
Éditeur invité

Informations sur la soumission du manuscrit

Les manuscrits doivent être soumis en ligne sur www.mdpi.com en s'inscrivant et en se connectant à ce site Web. Une fois inscrit, cliquez ici pour accéder au formulaire de soumission. Les manuscrits peuvent être soumis jusqu'à la date limite. Tous les articles seront évalués par des pairs. Les articles acceptés seront publiés en continu dans la revue (dès leur acceptation) et seront répertoriés ensemble sur le site Web du numéro spécial. Des articles de recherche, des articles de synthèse ainsi que de courtes communications sont invités. Pour les articles prévus, un titre et un court résumé (environ 100 mots) peuvent être envoyés au bureau éditorial pour annonce sur ce site.

Les manuscrits soumis ne doivent pas avoir été publiés auparavant, ni être à l'étude pour publication ailleurs (à l'exception des actes de conférence). Tous les manuscrits sont soumis à une évaluation approfondie par le biais d'un processus d'examen par les pairs en simple aveugle. Un guide pour les auteurs et d'autres informations pertinentes pour la soumission de manuscrits sont disponibles sur la page Instructions pour les auteurs. Revue internationale des sciences moléculaires est une revue bimensuelle internationale à comité de lecture en libre accès publiée par MDPI.

Veuillez visiter la page Instructions pour les auteurs avant de soumettre un manuscrit. Il y a des frais de traitement d'article (APC) pour la publication dans cette revue en libre accès. Pour plus de détails sur l'APC, veuillez cliquer ici. Les articles soumis doivent être bien formatés et utiliser un bon anglais. Les auteurs peuvent utiliser le service d'édition en anglais de MDPI avant la publication ou pendant les révisions d'auteur.


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