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Pourquoi mon ADN est-il en dessous de l'échelle ?

Pourquoi mon ADN est-il en dessous de l'échelle ?



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J'ai effectué une PCR dégradée… et la bande 6 après l'échelle est clairement la plus brillante. Mais toutes les bandes apparaissent en dessous de l'échelle. Qu'est-ce que ça veut dire? C'est l'ADNm extrait qui a été chargé.

Merci d'avance!


En dessous de l'échelle, on entend le dimère d'amorce. Vous n'avez aucun produit.


Qu'est-ce que l'ADN ?

L'acide désoxyribonucléique (ADN) est un produit chimique présent dans le noyau des cellules et contient les « instructions » pour le développement et le fonctionnement des organismes vivants.

Il est souvent comparé à un ensemble de plans car il contient les instructions nécessaires pour construire des cellules.

Ces instructions sont divisées en segments le long d'un brin d'ADN et sont appelées gènes.

Les gènes sont une séquence d'ADN qui code pour la production d'une protéine et contrôle les caractéristiques héréditaires telles que la couleur des yeux ou les comportements de personnalité.

Les protéines déterminent le type et la fonction d'une cellule, de sorte qu'une cellule sait s'il s'agit d'une cellule de la peau, d'une cellule sanguine, d'une cellule osseuse, etc., et comment effectuer ses tâches appropriées.

D'autres séquences d'ADN sont responsables à des fins structurelles ou sont impliquées dans la régulation et l'utilisation de l'information génétique.

Structure de l'ADN

La structure de l'ADN peut être comparée à une échelle.

Il a un squelette chimique alterné de phosphate et de sucre, constituant les "côtés" de l'échelle.

(Le désoxyribose est le nom du sucre présent dans l'épine dorsale de l'ADN.)

Entre les deux côtés de ce squelette sucre-phosphate se trouvent quatre bases azotées : l'adénine (A), la thymine (T), la cytosine (C) et la guanine (G).

(Un regroupement comme celui-ci d'un phosphate, d'un sucre et d'une base constitue une sous-unité d'ADN appelée nucléotide.)

Ces bases constituent les «échelons» de l'échelle et sont attachées à l'épine dorsale où se trouvent les molécules de désoxyribose (sucre).

Les bases chimiques sont connectées les unes aux autres par des liaisons hydrogène, mais les bases ne peuvent se connecter qu'à un partenaire de base spécifique - l'adénine et la thymine se connectent l'une à l'autre et la cytosine et la guanine se connectent l'une à l'autre.

La disposition de ces bases est très importante car elle détermine ce que sera l'organisme - une plante, un animal ou un champignon.

C'est ce qu'on appelle le codage génétique. Par exemple, un côté de l'ADN pourrait avoir le code génétique AAATTTCCCGGGATC. Son côté complémentaire devrait alors être TTTAAAGGGCCCTAG.

Même si la forme de l'ADN est souvent décrite comme une échelle, ce n'est pas une échelle droite.

Il est tordu vers la droite, faisant de la forme de la molécule d'ADN une double hélice droite. Cette forme permet de « bourrer » une grande quantité d'informations génétiques dans un très petit espace.

En fait, si vous aligniez chaque molécule d'ADN dans une cellule bout à bout, le brin mesurerait six pieds de long.

L'ADN se réplique

Avant qu'une cellule puisse se diviser et former une nouvelle cellule, elle doit d'abord dupliquer son ADN.

Ce processus est appelé réplication de l'ADN.

Lorsqu'il est temps de se répliquer, les liaisons hydrogène qui maintiennent les paires de bases ensemble se rompent, permettant aux deux brins d'ADN de se dérouler et de se séparer.

L'appariement spécifique des bases permet à l'ADN de se reproduire exactement. Chaque moitié de l'ADN d'origine a toujours une base attachée à son squelette sucre-phosphate.

Un nouveau brin d'ADN est fabriqué par une enzyme appelée ADN polymérase. Il lit le brin d'origine et fait correspondre les bases complémentaires au brin d'origine.

(Le squelette sucre-phosphate est fourni avec les nouvelles bases.)

De nouveaux brins se fixent des deux côtés de l'ADN d'origine, formant deux doubles hélices d'ADN identiques composées d'un brin original et d'un nouveau brin. Veuillez noter que l'explication ci-dessus de la réplication de l'ADN est très simplifiée.

Comment l'ADN est utilisé

Tous les êtres vivants - les plantes, les animaux et les humains - transmettent l'ADN des parents à la progéniture sous forme de chromosomes.

Chez l'homme, 23 chromosomes sont transmis par la mère et 23 chromosomes par le père, donnant à l'enfant 46 chromosomes.

Les chromosomes portent les gènes des parents, mais tous les gènes d'un parent ne sont pas transmis.

Pour chaque enfant, différents ensembles de gènes sont transmis par les parents, résultant en un ADN unique pour chaque enfant. Cela signifie que même si le code génétique de tous les êtres humains est identique à 99,9%, personne n'a exactement le même code ADN, sauf dans le cas de vrais jumeaux identiques.

Sachant cela, l'ADN peut être utilisé pour identifier des personnes dans diverses situations. Ce domaine est connu sous le nom de science médico-légale.

L'ADN est souvent utilisé pour résoudre des crimes en identifiant les victimes et les suspects tout en excluant des personnes innocentes comme suspects potentiels d'un crime.

Il est également utilisé pour prouver ou réfuter les relations familiales, identifier les personnes disparues et identifier les victimes de catastrophes qui ne sont plus physiquement identifiables.

Et puisque l'ADN peut être trouvé dans une variété de tissus et de fluides humains tels que les cheveux, l'urine, le sang, le sperme, les cellules de la peau, les os, les dents et la salive, il facilite grandement l'identification lorsque d'autres méthodes, telles que les empreintes digitales et la structure des dents, ne sont plus utilisables.

Le domaine médical utilise également l'ADN. Maintenant que les médecins comprennent au moins partiellement le fonctionnement de l'ADN, la médecine moderne a fait des progrès dans l'identification des maladies et la recherche de remèdes.

De nombreuses maladies, comme la mucoviscidose, sont des maladies héréditaires, ce qui signifie qu'elles se transmettent des parents à la progéniture.

En examinant l'ADN d'un individu, les médecins peuvent déterminer quelle est la maladie ou dans quelle mesure une personne ou ses enfants sont susceptibles d'avoir une maladie particulière. Les médecins étudient également comment les cellules dont l'ADN est endommagé se multiplient pour les aider à trouver des remèdes ou des traitements pour des maladies telles que le cancer et les tumeurs.

Mais la connaissance de l'ADN n'est pas seulement utilisée chez les humains. Les scientifiques de l'alimentation utilisent les informations ADN pour améliorer les cultures et développer de nouvelles sources de nourriture.

Les phytogénéticiens sélectionnent des plantes qui produisent des rendements alimentaires élevés, sont résistantes aux parasites et tolèrent mieux les stress environnementaux que les variétés de plantes similaires.

Ceci est particulièrement important dans les zones qui ont de mauvaises conditions de croissance et/ou la zone a une grande population à nourrir. Cependant, il y a eu un débat croissant sur la question de savoir si ces sources d'aliments génétiquement modifiés sont sûres et saines pour la consommation humaine.


Pourquoi devriez-vous choisir des échelles ADN expédiées dans des conditions ambiantes

L'avantage d'être « vert » sur le lieu de travail, c'est que cela peut profiter à tous. Cependant, travailler en laboratoire peut rendre difficile le respect de l'environnement. Bien que l'élimination des déchets dans les expériences de biologie moléculaire puisse ne pas être possible ou pratique, vous pouvez réduire considérablement les matériaux d'emballage et d'expédition à différentes étapes du flux de travail de biologie moléculaire.

Vous pouvez maintenant aider à minimiser les déchets tout en conservant les mêmes excellents résultats dans vos expériences d'électrophorèse d'acides nucléiques. Les tests ont montré que la qualité du produit et sa stabilité à long terme ne sont pas affectées par l'expédition ambiante des échelles d'ADN Thermo Scientific. Passez à l'ambient aujourd'hui et :


Bandes d'ADN visibles sans exposition aux UV

S'il s'agit d'une électrophorèse sur gel d'agarose, ce n'est pas votre ADN que vous voyez, c'est le colorant de votre échantillon. Ne faites pas confiance à tout ce que vous ne voyez pas sous la lumière UV.

pas vrai, les bandes rouges pâles sont de l'acide nucléique, je suppose que c'est EtBr. Digest de restriction d'un plasmide à partir de son apparence?

Vous pouvez voir l'ADN au-dessus et au-dessous du xylène cyanol.

Même dans les UV, vous voyez le bromure d'éthidium se lier à l'ADN, pas à l'ADN lui-même.

C'est probablement de l'ADN intercalé avec du bromure d'éthidium. Vous avez une bande d'ADN concentrée et, à son tour, vous avez concentré le bromure d'éthidium de couleur marron à l'intérieur de la bande.

Je reçois cela tout le temps lorsque mes PCR s'avèrent favorables :) Si vous avez un bon sens de l'échelle, vous pouvez même couper la bande sans UV - je l'ai fait plusieurs fois aussi. Nous utilisons des colonnes bon marché mais, avec des bandes aussi brillantes, mon rendement a été

3-6 microgrammes au total (en éluant avec

Vous voyez probablement un excès d'EtBr intercalé dans votre ADN car cela ressemble à un gel d'agarose standard après électrophorèse. Laissez-moi deviner, produits digérés par PCR ou enzymes de restriction ? La seule réponse sûre à propos de votre ADN est ce que vous voyez sous UV.

Dans la piste 1, je peux voir du bleu de bromophénol et dans la piste 2, je peux voir des colorants xylène cyanol et orange G. Je peux également voir deux bandes roses relativement serrées au-dessus et en dessous de la bande xylène cyanol, à en juger par la taille de la bande, je suggérerais que vous avez utilisé beaucoup trop de bromure d'éthidium.

Si vous avez introduit du bromure d'éthidium directement dans votre échantillon plutôt que de l'agarose fondu, c'est ici que réside votre problème, sinon je pense que vous venez d'en ajouter beaucoup trop au gel.

Cependant, cela ne devrait pas poser de problème, en fonction de l'application en aval, vous pouvez le supprimer de n'importe quel échantillon en effectuant une extraction au phénol suivie d'une précipitation.

Ça ressemble à du chargement de colorant, bourgeon. Ce que vous voyez est-il cohérent avec l'imagerie UV ?

Je ne sais pas ce que vous demandez. Mais la raison pour laquelle vous voyez beaucoup d'ADN est qu'il y a beaucoup d'ADN.

Qu'essayez-vous de faire exactement ici ? Génotypage ? Si c'est le cas, envoyez-moi un message et je pourrai vous donner quelques protocoles différents. Vos bandes semblent très larges et vous ne pourrez peut-être pas voir de "bandes", juste des taches, qui ne sont pas vraiment utiles pour le génotypage.

20 ug d'ADN est une quantité folle. J'utilise 1 microlitre de solution d'ADN à une concentration inférieure à 100 ng/uL. Tu devrais le diluer !

Pour mes gels, j'utilise SyberRed au lieu d'EB. Ma recette est de 2,25 g d'agarose avec 150 mL de tampon TAE et 5 microlitres de SyberRed pour 50 mL de tampon. (Donc, 15 ml SyberRed.)

La chose que vous voyez est votre colorant/tampon de chargement. La partie jaune sert à vous aider à visualiser l'ADN en mouvement afin qu'il ne s'écoule pas du gel. Lorsque le jaune se rapproche du bord, il est temps de s'arrêter !

Le bleu représente le colorant de chargement et c'est à peu près où se trouvera votre bande d'ADN. L'ADN n'est pas vraiment visible sans lumière UV. L'ADN apparaît, sous forme de précipité, sous forme de poudre blanchâtre et dans le gel, sans aucun colorant, il apparaîtra clair.


Échelle d'ADN de 100 pb :

Dans l'échelle d'ADN de 100 pb, le plus petit fragment est de 100 pb.

L'autre fragment varie d'un fabricant à l'autre. Voir l'image ci-dessous,

Idéalement, l'échelle d'ADN de 100 pb contient 10 fragments de 100 pb, 200 pb, 300 pb, 400 pb, 500 pb, 600 pb, 700 pb, 800 pb, 900 pb et 1000 pb.

Cependant, certains constructeurs prévoient 100 à 1500 pb.

Idéalement, la concentration de chaque fragment d'ADN est

25ng sauf 500 pb et 1000 pb.

La concentration du fragment de 500 pb et de 1000 pb est de 100 ng, par conséquent, il peut sembler plus net et plus concentré que les autres fragments.

L'échelle d'ADN de 100 pb est l'un des marqueurs de poids moléculaire standard couramment utilisés au cours de la PCR.

Une concentration de gel d'agarose à 2% est idéale pour cela, bien qu'une concentration de gel à 2,5% donne des bandes d'ADN plus nettes (nos propres observations).


Pourquoi mon ADN est-il en dessous de l'échelle ? - La biologie

Les médecins légistes doivent de temps à autre reconstituer le profil ADN d'une personne disparue à partir de l'analyse des profils ADN de parents proches. Dans ce cas, une mère de quatre enfants est portée disparue. Tous les enfants ont le même père biologique. Les résultats d'une analyse d'empreintes digitales d'ADN par sonde de locus unique pour les quatre enfants et leur père sont présentés dans la figure. Malheureusement, le médecin légiste a oublié d'étiqueter la voie avec l'ADN du père.

Néanmoins, vous pouvez en déduire que les allèles de la mère disparue sont :

Didacticiel

Reconstituer le profil de la mère disparue
Chaque parent apporte un ensemble d'allèles à chaque enfant. L'autoradiographie dans ce cas contient l'ADN de quatre enfants et de leur père. Chaque enfant partagera une bande avec la mère et une avec le père. Vous pouvez utiliser le processus d'élimination pour déterminer quelle voie contient l'ADN du père. Alors vous savez que les bandes chez les enfants non partagées avec le père doivent avoir été apportées par la mère disparue. Ainsi, vous pouvez utiliser le processus d'élimination pour reconstituer le profil de la mère disparue.
Recherchez les voies qui ne partagent pas les bandes
Regardez les bandes dans les pistes 2 et 5. La piste 2 contient les allèles A et B, tandis que la piste 5 contient les allèles C et D. Parce que ces pistes n'ont pas de bandes en commun, aucune piste ne peut contenir l'ADN du père. N'oubliez pas que chaque enfant partagera une bande avec le père et une avec la mère, dont l'ADN ne figure pas sur cette autoradiographie.
Regardez les bandes dans les pistes 3 et 4. Encore une fois, il n'y a pas d'allèles correspondants, donc ces pistes ne contiennent pas l'ADN du père. Gardez à l'esprit que les frères et sœurs n'héritent pas nécessairement les mêmes allèles de leurs parents et auront généralement des profils ADN différents les uns des autres.
Élimine les possibilités de déterminer les allèles du père et de la mère

Ayant exclu 4 des 5 voies, la voie du père est facile à identifier. Vérifiez votre travail en faisant correspondre la voie du père avec chaque voie pour les quatre enfants. Encore une fois, une bande du père doit correspondre à au moins une bande pour chaque enfant.

Une fois que vous avez identifié les allèles appartenant au père, déterminer le génotype de la mère est facile, elle a les 2 allèles qui se trouvent chez leurs enfants mais pas dans le profil du père.


Résumé de restriction diagnostique

Les digestions diagnostiques peuvent être utilisées pour confirmer la structure approximative du plasmide en fonction des tailles et de l'organisation prédites des différentes caractéristiques au sein du plasmide. L'analyse de restriction peut également être utilisée avec succès même si vous ne disposez pas de la séquence plasmidique complète. Une fois que vous avez purifié l'ADN plasmidique, cette méthode peut être effectuée directement dans votre laboratoire en moins d'une journée. Les digestions de restriction diagnostiques sont composées de 2 étapes distinctes : 1) l'incubation de votre ADN avec des enzymes de restriction qui clivent les molécules d'ADN sur des sites spécifiques et 2) l'exécution de la réaction sur un gel d'agarose pour déterminer les tailles relatives des fragments d'ADN résultants.

Les digestions par restriction sont couramment utilisées pour confirmer la présence d'un insert dans un vecteur particulier en excisant l'insert du squelette. Pour ce faire, vous utiliserez des enzymes avec des sites de restriction qui flanquent l'insert. Vous aurez besoin de connaître à la fois la taille approximative du squelette vectoriel ainsi que la taille prévue de l'insert. Vous pouvez rechercher NCBI pour YGOI pour trouver la séquence de référence particulière si nécessaire.

L'exemple de plasmide sur la droite a une taille totale de 7,3 kb, y compris un insert de 1,2 kb. Le plasmide a été digéré avec 2 enzymes uniques (HindIII et BamHI) et passé sur un gel d'agarose. L'image de gel résultante comprend une échelle de 1 kb (piste 1) qui a des bandes allant d'environ 500 pb à 10 kb, le fragment de 3,0 kb ayant une intensité accrue pour servir de bande de référence. L'ADN non coupé (piste 2) montre 3 conformations plasmidiques possibles, avec relaxé et entaillé marqués d'astérisques (*). Lorsque le plasmide est digéré avec HindIII et BamHI seuls (pistes 4 à 5), il y a une seule bande de 7,3 kb représentant la taille complète du plasmide. La double digestion avec HindIII et BamHI (piste 3) produit des bandes à 6 kb et 1,2 kb (boîte rouge), correspondant respectivement au squelette et à l'insert. Les résultats sur gel correspondent aux tailles prédites.

Regardez cette vidéo pour un aperçu rapide de la façon d'analyser un résumé de restriction :


Contenu

Développement Modifier

Bien que le concept de marqueurs de poids moléculaire ait été retenu, les techniques de développement ont varié au cours des années. Les nouvelles inventions de marqueurs de poids moléculaire sont distribuées dans des kits spécifiques au type de marqueur.

Un problème précoce dans le développement des marqueurs était d'obtenir une haute résolution sur toute la longueur du marqueur. [1] Selon les conditions de fonctionnement de l'électrophorèse sur gel, des fragments peuvent avoir été compressés, perturbant la clarté. Pour résoudre ce problème, un kit d'analyse Southern Blot a été développé en 1990, fournissant le premier marqueur à combiner l'ADN cible et l'ADN sonde. Cette technique tire parti de l'espacement logarithmique et peut être utilisée pour identifier des bandes cibles s'étendant sur une longueur de 20 000 nucléotides. [2]

Conception Modifier

Il existe deux méthodes courantes pour construire un marqueur de taille de poids moléculaire d'ADN. [3] Une telle méthode utilise la technique de la ligature partielle. [3] La ligature d'ADN est le processus par lequel des morceaux d'ADN linéaires sont connectés les uns aux autres via des liaisons covalentes plus spécifiquement, ces liaisons sont des liaisons phosphodiester. [4] Ici, un morceau d'ADN duplex de 100 pb est partiellement ligaturé. La conséquence en est que des dimères de 200 pb, des trimères de 300 pb, des tétramères de 400 pb, des pentamères de 500 pb, etc. vont se former. De plus, une partie de l'ADNdb de 100 pb restera. En conséquence, une "échelle" d'ADN composée de morceaux d'ADN de masse moléculaire connue est créée sur le gel. [3]

La seconde méthode emploie l'utilisation d'enzymes de restriction et d'une séquence d'ADN reconnue. [3] L'ADN est digéré par une enzyme de restriction particulière, ce qui donne des morceaux d'ADN de masses moléculaires variables. L'un des avantages de cette méthode est que davantage de marqueurs peuvent être facilement créés simplement en digérant davantage d'ADN connu. [3] D'autre part, la taille des morceaux d'ADN est basée sur les sites où l'enzyme de restriction coupe. Cela rend plus difficile le contrôle de la taille des fragments dans le marqueur. [5]

Plus récemment, une autre méthode pour construire des marqueurs de taille de poids moléculaire d'ADN est utilisée par les laboratoires. Cette stratégie implique l'utilisation de la réaction en chaîne par polymérase (PCR). [5] Ceci est réalisé d'une ou deux manières : 1) une cible d'ADN est amplifiée en même temps via des ensembles d'amorces, ou 2) différentes cibles d'ADN sont amplifiées indépendamment via des amorces particulières. [5]

Effets des conditions de gel Modifier

Comme pour les échantillons expérimentaux, les conditions du gel peuvent affecter le marqueur de taille de poids moléculaire qui les accompagne. Des facteurs tels que le tampon, la charge/tension et la concentration de gel peuvent affecter la mobilité et/ou l'apparence de votre marqueur/échelle/étalon. Ces éléments doivent être pris en considération lors de la sélection d'un marqueur et lors de l'analyse des résultats finaux sur gel.

Développement Modifier

Auparavant, des marqueurs protéiques avaient été développés en utilisant une variété de protéines entières. Le développement d'un kit comprenant un marqueur de taille de poids moléculaire basé sur des fragments de protéines a commencé en 1993. Ce marqueur de protéine, composé de 49 séquences d'acides aminés différentes, comprenait des protéines multidomaines et permettait l'analyse de protéines clivées à différents sites. [9]

Les améliorations techniques actuelles des marqueurs protéiques impliquent l'utilisation de l'auto-développement. Le premier marqueur protéique de poids régulier auto-développé a été inventé en 2012. [10]

Conception Modifier

Semblables aux marqueurs d'ADN, ces marqueurs sont typiquement composés de protéines purifiées dont les masses moléculaires sont déjà connues. [3] La liste ci-dessous décrit certaines des protéines, ainsi que la masse moléculaire, qui sont couramment utilisées lors de la construction d'un marqueur protéique.

Choisir le bon marqueur de protéine Modifier

Les marqueurs de taille de poids moléculaire peuvent être divisés en deux catégories : les marqueurs de poids moléculaire par rapport aux marqueurs d'échelle moléculaire. [14] Les marqueurs sont soit tachés, soit non tachés, et selon les circonstances, l'un peut être plus approprié qu'un autre. Les marqueurs de taille de poids moléculaire peuvent également être modifiés biochimiquement. [15] La conjugaison avec la biotine est la plus courante. Les marqueurs de taille de poids moléculaire sont le plus couramment utilisés dans l'électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide et le transfert de Western. Avec tous les différents types et utilisations de marqueurs de taille de poids moléculaire, il est important de choisir la protéine standard appropriée. Outre l'utilisation la plus courante, comme moyen de calculer le poids moléculaire des échantillons, d'autres utilisations incluent la mise en évidence visuelle de la migration des protéines et de l'efficacité du transfert et sont parfois même utilisées pour le contrôle positif. [16]

Un marqueur de poids moléculaire est un type d'étalon protéique. Ils peuvent être précolorés ou non colorés avant le chargement, selon le type d'expérience, un peut être plus avantageux. Dans les deux cas, ils sont normalement exécutés sur la piste externe d'un gel, tandis que l'échantillon est chargé dans les pistes médianes. [14] Les marqueurs moléculaires sont différents des échelles protéiques en ce qu'ils sont composés d'un mélange de protéines natives dont les spécifications sont bien catégorisées mais ne correspondent pas à des nombres entiers. [14] En général, ceux-ci sont beaucoup moins chers, mais l'analyse ne permet qu'une valeur approximative des protéines séparées par électrophorèse. [14] Une échelle de protéines est un autre type de norme de protéines. Ils sont presque toujours tachés. [14] Les échelles protéiques diffèrent des marqueurs moléculaires en ce qu'elles sont composées d'un mélange de protéines hautement purifiées dont les spécifications sont connues et correspondent à des nombres entiers. [14] Généralement, les échelles de protéines sont composées de 10 à 12 protéines. [14] À la fin de l'expérience, après la migration de taille, une seule bande représentera la taille de chaque protéine contenue dans l'échelle. [17] Les marqueurs sont régulièrement espacés et l'analyse de la taille utilisant ces marqueurs permet une valeur précise de la protéine d'intérêt. Dans certains cas, en tant que méthode de confirmation moléculaire, les marqueurs MW sont exécutés avec des échelles de protéines pour vérification. [14] Les marqueurs protéiques peuvent être non colorés ou précolorés, mais les deux ont leurs avantages et leurs inconvénients. [18] La visualisation simple de la séparation et du transfert des protéines est rendue possible grâce à l'utilisation de marqueurs précolorés. [18] Ils sont couramment utilisés à la fois dans l'électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide et dans le buvardage occidental. En SDS-PAGE, il permet de surveiller la migration des protéines, car les bandes de protéines se séparent et peuvent être vues lors d'une analyse électrophorétique. Dans les transferts western, les normes de protéines colorées permettent le transfert de protéines de visualisation sur la membrane. [17] Cependant, les déterminations de taille ne sont pas aussi précises avec ces marqueurs (voir la section Recombinant et marqueur naturel pour plus d'explications). [18] Bien que les marqueurs non colorés permettent des déterminations de taille plus exactes, ils ne peuvent pas être visualisés pendant que le gel est en marche. En tant que tel, le gel doit être coloré afin de visualiser les bandes. [19] Outre les marqueurs colorés et non colorés, les marqueurs protéiques peuvent être considérés en termes de recombinants et naturels. [18] Les marqueurs recombinants sont constitués de protéines recombinantes qui ont été fortement purifiées. Ces marqueurs sont conçus de manière à mettre en évidence des caractéristiques particulières. [18] Des exemples de ces caractéristiques comprennent des marqueurs d'affinité et des poids moléculaires qui sont uniformément positionnés les uns par rapport aux autres. [18] Les marqueurs naturels, comme leur nom l'indique, sont un mélange de protéines qui se produisent naturellement. [18] Les marqueurs naturels précolorés fonctionnent bien pour la visualisation de la séparation sur gel. Cependant, ces marqueurs ont tendance à se lier à la tache de manière covalente en quantités variables et à diverses positions. [18] Par conséquent, les bandes résultantes peuvent être plus larges. Cela est particulièrement vrai lorsqu'on fait des comparaisons avec des marqueurs recombinants précolorés. En raison de cet effet, les déterminations de poids moléculaire sont susceptibles d'être moins précises avec les marqueurs naturels précolorés. [18] Les standards de protéines peuvent également être modifiés chimiquement. Une altération courante est due à l'utilisation de biotine. La biotine a une très grande affinité pour la streptavidine et, par conséquent, la liaison forme un complexe très puissant. Pour la visualisation, une étiquette de couleur est attachée à la streptavidine. [15]

Effets des conditions de gel Modifier

Comme pour l'électrophorèse de l'ADN, des conditions telles que les tampons, la charge/tension et la concentration doivent être prises en compte lors de la sélection d'un marqueur protéique.

Les tampons peuvent affecter la mobilité du marqueur et des échantillons. Le pH du tampon varie avec le système utilisé et par conséquent, chaque système tampon aura un effet différent sur la charge d'une protéine ou de protéines. [20] De plus, dans le cas de SDS-PAGE, l'affinité de liaison pour SDS peut être affectée par le système de tamponnage. [20] Même en utilisant le même pourcentage et le même type de gel, les mêmes protéines migreront à des vitesses différentes en fonction du tampon utilisé. [20] La tension joue un rôle dans la mobilité des protéines sur un gel. Les protéines migreront plus rapidement à des tensions plus élevées. Par conséquent, le temps de fonctionnement du gel sera plus court. Inversement, des tensions plus élevées peuvent entraîner une plus grande diffusion de bande. [20] De plus, si la tension est trop élevée, la température dans la chambre d'électrophorèse peut devenir telle que le gel commence à fondre. [20] La tension à laquelle un gel doit être utilisé dépend du type de gel. Pour certains gels, la tension reste constante tout au long de l'analyse, tandis que, avec d'autres gels, la tension initiale peut rester constante pendant un temps spécifié avant d'être augmentée. [20] Cette deuxième tension est ensuite utilisée pendant une période de temps spécifique, après quoi, elle peut également être augmentée. [20] En termes de pourcentage, les gels utilisés pour l'électrophorèse des protéines peuvent être décomposés en gels à pourcentage unique et gels à gradient. [18] Les gels à pourcentage unique sont également appelés gels linéaires. [20] Pour les gels linéaires, le pourcentage choisi se situe généralement entre 7,5% et 20%. [18] Les plages de pourcentage courantes pour les gels à gradient sont de 4 à 15 % et de 10 à 20 %. Chaque type de gel a ses propres avantages. [18] Par exemple, les gels linéaires sont préférés lorsque plusieurs protéines ont des poids moléculaires similaires, une meilleure séparation entre ces protéines sera affichée par un gel linéaire. [18] D'autre part, les gels à gradient sont un meilleur choix lorsque les échantillons d'intérêt contiennent des protéines de poids moléculaires très différents ou qui couvrent une large gamme de poids moléculaires. [18] [20]

Développement Modifier

Des échelles d'ARN composées de marqueurs de taille de poids moléculaire d'ARN ont été initialement développées en utilisant la méthode du cercle synthétique [21] pour produire des marqueurs de différentes tailles. Cette technique a été améliorée par l'inventeur Eric T. Kool pour utiliser des vecteurs d'ADN circulaires comme méthode de production de marqueurs de taille de poids moléculaire d'ARN. Appelée méthode du cercle roulant, les améliorations de cette technique découlent de son efficacité dans la synthèse d'oligonucléotides d'ARN. A partir de la matrice d'ADN circulaire, un ARN simple brin variant en longueur de 4 à 1500 pb peut être produit sans avoir besoin d'amorces et en recyclant le nucléotide triphosphate. L'ADN peut également être synthétisé à partir du modèle circulaire, ajoutant à la polyvalence de cette technique. Par rapport à la transcription par ruissellement, la méthode du cercle synthétique produit des oligonucléotides d'ARN sans ruissellement. Par rapport à la PCR, la méthode du cercle synthétique produit des oligonucléotides d'ARN sans avoir besoin de polymérase ni de thermocycleur. Cette méthode est également rentable dans sa capacité à synthétiser de grandes quantités de produits à un taux d'erreur inférieur à celui des synthétiseurs de machines. [21]

Conception Modifier

Les marqueurs d'ARN sont constitués de transcrits d'ARN de différentes longueurs incrémentielles. Par exemple, le marqueur Lonza 0,5-9 kpb [22] a des bandes marquant 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6 et 9 paires de kilobases. Les marqueurs sont dissous dans un tampon de stockage, tel que l'EDTA, et peuvent avoir une durée de conservation allant jusqu'à 2 ans lorsqu'ils sont stockés à -80 °C. Pour utiliser le marqueur, comme pour l'analyse Northern Blot, il est d'abord décongelé, puis coloré de manière à être détectable sur une électrophorèse sur gel. L'un des colorants les plus couramment utilisés pour les marqueurs est le bromure d'éthidium.

La plage d'un marqueur particulier fait référence à la variété de bandes qu'il peut cartographier. Une plage "élevée" fait référence à des fragments relativement grands (mesurés en kb) tandis qu'une plage "faible" fait référence à des marqueurs qui font la distinction entre de petits fragments (mesurés en pb). Certains marqueurs peuvent même être décrits comme « ultra-bas de gamme », [16] mais le marqueur microARN est encore plus précis. Un marqueur microARN peut être utilisé pour mesurer des fragments d'ARN dans une douzaine de nucléotides, comme le marqueur microARN 17-25 nt. [23]

Utiliser Modifier

A poids moléculaires équivalents, l'ARN migrera plus rapidement que l'ADN. Cependant, l'ARN et l'ADN ont une pente linéaire négative entre leur distance de migration et leur poids moléculaire logarithmique. [24] C'est-à-dire que les échantillons de poids inférieur sont capables de migrer sur une plus grande distance. Cette relation est une considération lors du choix des marqueurs d'ARN ou d'ADN comme standard.

Lors de l'exécution de marqueurs d'ARN et d'échantillons d'ARN sur un gel, il est important d'éviter la contamination par la nucléase, car l'ARN est très sensible à la dégradation de la ribonucléase (RNase) par catalyse. [25] [26] Ainsi, tous les matériaux à utiliser dans la procédure doivent être pris en considération. Toute verrerie qui doit entrer en contact avec l'ARN doit être prétraitée avec du diéthylpyrocarbonate (DEPC) et les matières plastiques doivent être jetables. [25]

L'une des utilisations les plus courantes des marqueurs de taille de poids moléculaire est l'électrophorèse sur gel. Le but de l'électrophorèse sur gel est de séparer les protéines par leurs propriétés physiques ou chimiques, notamment la charge, la taille moléculaire et le pH.< Lors de la séparation en fonction de la taille, la méthode idéale est la SDS-PAGE ou l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide et les marqueurs de taille de poids moléculaire sont les normes appropriées à utiliser.

Les gels peuvent varier en taille. Le nombre d'échantillons à analyser déterminera la taille de gel appropriée. Tous les gels sont divisés en voies parallèles à travers le gel. Chaque voie contiendra un échantillon spécifique. Typiquement, les étalons de taille de poids moléculaire sont placés dans une voie extérieure. Si un gel a un nombre particulièrement élevé de voies, plusieurs échelles peuvent être placées sur le gel pour une plus grande clarté.

Les protéines et les standards sont pipetés sur le gel dans les couloirs appropriés. Le dodécyl sulfate de sodium (SDS) interagit avec les protéines, les dénature et leur confère une charge négative. Étant donné que toutes les protéines ont le même rapport charge/masse, la mobilité des protéines à travers le gel sera uniquement basée sur le poids moléculaire. Une fois le champ électrique activé, la migration des protéines commencera. Une fois terminé, un mécanisme de détection tel que le western blot peut être utilisé, qui révélera la présence de bandes. Chaque bande représente une protéine spécifique. La distance de déplacement est uniquement basée sur le poids moléculaire, par conséquent, le poids moléculaire de chaque protéine peut être déterminé en comparant la distance d'une protéine inconnue à la norme de poids moléculaire connu. [27]

Il existe de nombreux types de marqueurs de taille de poids moléculaire et chacun possède des caractéristiques uniques, ce qui explique leur implication dans un certain nombre de techniques biologiques. La sélection d'un marqueur de taille de poids moléculaire dépend du type de marqueur (ADN, ARN ou protéine) et de la plage de longueurs qu'il offre (par exemple 1 Ko). Avant de sélectionner un marqueur de taille de poids moléculaire, il est important de se familiariser avec ces caractéristiques et propriétés. Dans un cas particulier, un type peut être plus approprié qu'un autre. Bien que les marqueurs spécifiques puissent varier entre les protocoles pour une technique donnée, cette section décrira les marqueurs généraux et leurs rôles.

Allozymes Modifier

Le premier type de marqueur moléculaire développé et exécuté sur électrophorèse sur gel était les allozymes. Ces marqueurs sont utilisés pour la détection de la variation des protéines. Le mot « allozyme » (également appelé « alloenzyme ») vient de « variantes alléliques des enzymes ». [28] Lorsqu'elles sont exécutées sur un gel, les protéines sont séparées par taille et charge. Bien que les allozymes puissent sembler datés par rapport aux autres marqueurs disponibles, ils sont encore utilisés aujourd'hui, principalement en raison de leur faible coût. Un inconvénient majeur est que, comme il n'y a qu'une quantité limitée disponible, la spécificité est un problème. [28]

Marqueurs basés sur l'ADN (années 1960) Modifier

Bien que les allozymes puissent détecter des variations dans l'ADN, c'est par une méthode indirecte et peu précise. Les marqueurs basés sur l'ADN ont été développés dans les années 1960. [28] Ces marqueurs sont beaucoup plus efficaces pour distinguer les variantes de l'ADN. Today these are the most commonly used markers. DNA-based markers work by surveying nucleotides, which can serve a variety of functions, such as detecting differences in nucleotides or even quantifying the number of mutations. [28]

Restriction fragment length polymorphism is a technique used to detect variations in homologous DNA. [29] Specific restriction endonucleases are used to digest DNA. The RFLP molecular marker is specific to a single fragment. Along with alleic RFLP markers, a molecular-weight size marker, in this case a DNA marker, [30] is also included on an electorphoresed agarose gel. The DNA marker allows for the size of the restriction fragments to be estimated. Similar to RFLP, this technique also uses restriction endonucleases to digest the genomic DNA. Minisatellites are short sequences of tandem repeats, approximately 10-60 base pairs. Minisatellites can be used in DNA footprinting and as regulators of gene control. [28]

PCR-based markers (1980s) Edit

The success of DNA based markers lead to the development of PCR. PCR (polymerase chain reaction) is a DNA amplification technique that can be applied to various types of fragments. Prior to this development, to amplify DNA, it had to be cloned or isolated. Shortly after the discovery of PCR came the idea of using PCR-based markers for gel electrophoresis. These type of markers are based on PCR primers and are categorized as DNA sequence polymorphism. [28]

DNA sequence polymorphism Edit

Although technically speaking, DNA sequence polymorphism has been going on since the use of RFLP in the 1960s, the analysis has changed significantly over the years. DNA sequence polymorphism uses older techniques like RFLP, but on a larger scale. Sequencing is much faster and more efficient. The analysis is automated, as it uses a technique known as shotgun sequencing. This high-throughput method is commonly used in population genetics. [28]

SNPs (single nucleotide polymorphism), are used to detect variations in single nucleotides. The technique is very similar to that of RFLP. SNPs are used frequently for population genetic studies. [35] After amplification through PCR, these small fragments can be visualized using gel electrophoresis, and again DNA markers play a role in determining fragment length.

Polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis Edit

Carbohydrate markers are employed in a technique known as polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE), which is a measurable separation technique. [36] It allows for the analysis of enzyme hydrolysis products. [36] It has been used in applications such as characterizing enzymes involved in hemicellulose degradation, determining the structure of hemicellulose polysaccharides, and analysis of enzymatic cleavage of cellulose products. [36]

PACE depends on derivitization, which is the conversion of a chemical compound into a derivative. [36] [37] Here monosaccharides, oligosaccharides, and polysaccharides are the compounds of interest. They are labeled at their reducing ends with a fluorescent label (i.e. a fluorophore). [36] This derivitization with a fluorophore permits both separation on a gel under the desired circumstances and fluorescence imaging of the gel. In this case, a polyacrylamide gel is used. [36]

As with DNA, RNA, and protein electrophoresis, markers are run alongside the samples of interest in carbohydrate gel electrophoresis. [36] The markers consist of oligosaccharides of known molecular weight. Like the samples of interest, the marker is also derivitized with a fluorophore (usually with 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid (ANTS) or 2-aminoacridone). [36]


James Watson (1928-)

James Dewey Watson was born in Chicago. As a child, he was bright and inquisitive. One of his favorite words was "why?" and he wasn't satisfied with simple answers. He accumulated a lot of knowledge by reading the World Almanac, and won $100 as a "Quiz Kid" on a popular radio program. He used this money to buy binoculars for bird-watching ? a serious hobby for himself and his father.

Watson entered the University of Chicago at 15 under the gifted youngster program. He did well in courses that interested him, like biology and zoology, and not as well in other courses. He decided that he would go to graduate school and study to become the curator of ornithology at the Museum of Natural History.

In his senior year at Chicago, Watson read Erwin Schrödinger's book: Qu'est ce que la vie? L'aspect physique de la cellule vivante. He was fascinated by the idea that genes and chromosomes hold the secrets of life. When Watson went to do a Ph.D. with Salvador Luria, a pioneer in bacteriophage research, at Indiana University, it seemed the perfect opportunity to work on some of these problems.

After his Ph.D. in 1950, Watson spent time in Europe, first in Copenhagen and then at the Cavendish Laboratory of the University of Cambridge. By now, Watson knew that DNA was the key to understanding life and he was determined to solve its structure. He was lucky to share an office with Francis Crick, a Ph.D. student who was also interested in the structure of DNA. Although both were supposed to be working on other projects, in 1953, they built the first accurate model of DNA ? one of the great scientific advances of all time.

In 1962, Watson shared the Nobel Prize for Physiology or Medicine with Francis Crick and Maurice Wilkins who, with Rosalind Franklin, provided the data on which the structure was based. Watson wrote The Double Helix: A Personal Account of the Discovery of the Structure of DNA, which was published in 1968. This book was the first of its kind, being a gossipy account of the inner workings of the scientific world, and has never been out of print.

In 1956, Watson accepted a position in the Biology department at Harvard University where the focus of his research was RNA and its role in the transfer of genetic information. Although he continued to be a member of the Harvard faculty until 1976, Watson took over the directorship of Cold Spring Harbor Laboratory in 1968.

Watson has had a long association with Cold Spring Harbor Lab. Salvador Luria and Max Delbrück taught a popular summer course on phage genetics, and during his graduate days, Watson enjoyed this "summer camp" for scientists. Watson has made Cold Spring Harbor Laboratory one of the world's premier research facilities for cancer, neurobiology, and basic molecular genetics. Watson retired as the President of Cold Spring Harbor Laboratory in 2004, and is now Chancellor Emeritus.

Watson has played a significant role in the development of science policy, from the War on Cancer, through the debates over the use of recombinant DNA, to promoting the Human Genome Project. From 1988 to 1992, he ran the Human Genome Project at the National Institutes of Health while still directing Cold Spring Harbor Laboratory.

One of his major interests is education. His first textbook, Biologie moléculaire du gène, set new standards for biology textbooks, and it was followed by Biologie moléculaire de la cellule, et ADN recombinant. He is actively exploring the avenue of multimedia education and the WWW through projects being developed at the DNA Learning Center, the educational arm of Cold Spring Harbor Laboratory. He was and is one of the main motivators of this project, L'ADN du commencement.

Watson has been described by many as brilliant, outspoken and eccentric. He is energized by intelligent people and doesn't suffer fools. Watson is an avid tennis player and has been ever since his grad school days. He still tries to play tennis every day.

DNA was first crystallized in the late 70's &mdash remember, the 1953 X-ray data were from DNA fibers. So, the real "proof" for the Watson-Crick model of DNA came in 1982 after the B-form of DNA was crystallized and the X-ray pattern was solved.

If the DNA of one human cell is stretched out, it would be almost 6 feet long and contain over three billion base pairs. How does all this fit into the nucleus of one cell?


Sequencing Genomes

Traditional sequencing of genomes was a long and tedious process that cloned fragments of genomic DNA into plasmids to generate a genomic DNA library ( gDNA ). These plasmids were individually sequenced using Sanger sequencing methodology and computational was performed to identify overlapping pieces, like a jigsaw puzzle. This assembly would result in a draft scaffold.

The video below is taken from yourgenome.org (CC-BY) and illustrates the sequencing of the human genome through the shotgun sequencing approach.