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9.11 : Enzymes majeures - Biologie

9.11 : Enzymes majeures - Biologie


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Identifier les principales enzymes qui jouent un rôle dans la réplication de l'ADN

Le processus de Réplication de l'ADN est catalysé par un type d'enzyme appelé ADN polymérase (poly signifiant beaucoup, mer des morceaux de sens, et -ase signifiant enzyme; donc une enzyme qui attache de nombreux morceaux d'ADN). Au cours de la réplication, les deux brins d'ADN se séparent en plusieurs points le long du chromosome. Ces emplacements sont appelés origines de réplication car la réplication commence à ces points. Observez la figure 1 : la double hélice de la molécule d'ADN d'origine se sépare (bleu) et de nouveaux brins sont créés pour correspondre aux brins séparés. Le résultat sera deux molécules d'ADN, chacune contenant un ancien et un nouveau brin. Par conséquent, la réplication de l'ADN est appelée semi-conservatrice. Le terme semi-conservateur fait référence au fait que la moitié de la molécule d'origine (l'un des deux brins de la double hélice) est «conservée» dans la nouvelle molécule. Le brin d'origine est appelé le brin modèle car il fournit les informations, ou le modèle, pour le brin nouvellement synthétisé.

ADN polymérase a besoin d'une « ancre » pour commencer à ajouter des nucléotides : une courte séquence d'ADN ou d'ARN complémentaire au brin matrice fonctionnera pour fournir une extrémité 3' libre. Cette séquence est appelée un apprêt (Figure 2).

Comment ADN polymérase savoir dans quel ordre ajouter des nucléotides ? L'appariement de bases spécifique dans l'ADN est la clé pour copier l'ADN : si vous connaissez la séquence d'un brin, vous pouvez utiliser des règles d'appariement de bases pour construire l'autre brin. Les bases forment des paires (paires de bases) d'une manière très spécifique.

Questions pratiques

Vrai/Faux : la réplication de l'ADN nécessite une enzyme.

[practice-area rows="1″][/practice-area]
[reveal-answer q="527189″]Afficher la réponse[/reveal-answer]
[hidden-answer a=”527189″]Vrai. La plupart des réactions biologiques reposent sur l'enzyme pour accélérer la réaction. Dans le cas de la réplication de l'ADN, cette enzyme est l'ADN polymérase.

[/réponse-cachée]

Quels sont les éléments constitutifs de l'ADN ?

  1. Désoxyribonucléotides
  2. Les acides gras
  3. Ribonucléotides
  4. Acides aminés

[reveal-answer q="93495″]Afficher la réponse[/reveal-answer]
[hidden-answer a="93495″]Répondez a. L'ADN est une double hélice constituée de deux longues chaînes de désoxyribonucléotides.

[/réponse-cachée]

Vrai/Faux : la réplication de l'ADN nécessite de l'énergie.

[practice-area rows="1″][/practice-area]
[reveal-answer q="62103″]Afficher la réponse[/reveal-answer]
[hidden-answer a="62103″]Vrai. La fabrication de grosses molécules à partir de petites sous-unités (anabolisme) nécessite de l'énergie. Qu'est-ce qui fournit l'énergie ? Les blocs de construction eux-mêmes servent de source d'énergie. Au fur et à mesure qu'ils sont incorporés dans le polymère d'ADN, deux groupes phosphate sont rompus pour libérer de l'énergie, dont une partie est utilisée pour fabriquer le polymère. Les désoxyribonucléotides ne diffèrent des nucléotides comme l'ATP que par un atome d'oxygène manquant.

[/réponse-cachée]

Nous avons les éléments constitutifs, une source d'énergie et un catalyseur. Qu'est-ce qui manque ? Nous avons besoin d'instructions sur l'ordre des nucléotides dans le nouveau polymère. Quelle molécule fournit ces instructions ?

  1. Protéine
  2. ADN
  3. Glucides
  4. Lipide

[reveal-answer q="494506″]Afficher la réponse[/reveal-answer]
[hidden-answer a="494506″]Réponse b. Nous appelons cet ADN un modèle. Les informations d'origine stockées dans l'ordre des bases dirigeront la synthèse du nouvel ADN via l'appariement des bases.

[/réponse-cachée]

Il y a encore une chose requise par l'ADN polymérase. Il ne peut pas simplement commencer à faire une copie d'ADN du brin matrice ; il a besoin d'un court morceau d'ADN ou d'ARN avec un groupe hydroxyle libre au bon endroit pour attacher les nucléotides. (Rappelez-vous que la synthèse se produit toujours dans une direction - de nouveaux blocs de construction sont ajoutés à l'extrémité 3'.) Ce composant démarre le processus en donnant à l'ADN polymérase quelque chose à quoi se lier. Comment pourriez-vous appeler ce petit morceau d'acide nucléique ?

  1. Un solvant
  2. Une amorce
  3. Un convertisseur
  4. Un scellant

[reveal-answer q="529681″]Afficher la réponse[/reveal-answer]
[hidden-answer a="529681″]Réponse b. Une amorce est utilisée pour démarrer ce processus en donnant à l'ADN polymérase quelque chose auquel lier le nouveau nucléotide.[/hidden-answer]

Maintenant que vous comprenez les bases de Réplication de l'ADN, nous pouvons ajouter un peu de complexité. Les deux brins d'ADN doivent être temporairement séparés l'un de l'autre ; ce travail est effectué par une enzyme spéciale, hélicase, qui aide à dérouler et à séparer les hélices d'ADN (Figure 4). Un autre problème est que l'ADN polymérase ne fonctionne que dans une direction le long du brin (5′ à 3′), mais l'ADN double brin a deux brins orientés dans des directions opposées. Ce problème est résolu en synthétisant les deux brins légèrement différemment : un nouveau brin pousse en continu, l'autre en morceaux. Le brin principal se développe continuellement et le brin retardé est assemblé avec de courts morceaux appelés fragments d'Okazaki. Ces fragments sont connectés et liés entre eux par une enzyme appelée ADN ligase. De courts fragments d'ARN sont utilisés comme amorces pour l'ADN polymérase.

Questions pratiques

Lequel de ces éléments sépare les deux brins complémentaires de l'ADN ?

  1. ADN polymérase
  2. hélicase
  3. amorce d'ARN
  4. protéine de liaison simple brin

[reveal-answer q="197431″]Afficher la réponse[/reveal-answer]
[hidden-answer a="197431″]Réponse b. L'hélicase rompt les liaisons hydrogène qui maintiennent ensemble les deux brins d'ADN.

[/réponse-cachée]

Lequel de ces éléments attache des bases complémentaires au brin modèle ?

  1. ADN polymérase
  2. hélicase
  3. amorce d'ARN
  4. protéine de liaison simple brin

[reveal-answer q="381621″]Afficher la réponse[/reveal-answer]
[hidden-answer a="381621″]Répondez a. L'ADN polymérase construit le nouveau brin d'ADN.

[/réponse-cachée]

Lequel d'entre eux est ensuite remplacé par des bases d'ADN ?

  1. ADN polymérase
  2. hélicase
  3. amorce d'ARN
  4. protéine de liaison simple brin

[reveal-answer q=”2143″]Afficher les réponses[/reveal-answer]
[hidden-answer a=”2143″]Réponse c. l'amorce d'ARN est remplacée par des nucléotides d'ADN.[/hidden-answer]

En résumé : les principales enzymes

La réplication chez les eucaryotes commence à plusieurs origines de réplication. Une amorce est nécessaire pour initier la synthèse, qui est ensuite prolongée par l'ADN polymérase car elle ajoute les nucléotides un par un à la chaîne en croissance. Le brin principal est synthétisé en continu, tandis que le brin retardé est synthétisé en de courts tronçons appelés fragments d'Okazaki. Les amorces d'ARN sont remplacées par des nucléotides d'ADN ; l'ADN reste un brin continu en liant les fragments d'ADN avec l'ADN ligase.


Types et fonctions des enzymes digestives

Robert Burakoff, MD, MPH, est certifié en gastroentérologie. Il est vice-président des services ambulatoires du département de médecine du Weill Cornell Medical College de New York.

Les enzymes digestives sont des substances sécrétées par les glandes salivaires et les cellules tapissant l'estomac, le pancréas et l'intestin grêle pour faciliter la digestion des aliments. ??

Ils le font en divisant les grosses molécules complexes qui composent les protéines, les glucides et les graisses (macronutriments) en plus petites, permettant aux nutriments de ces aliments d'être facilement absorbés dans la circulation sanguine et transportés dans tout le corps.

Les enzymes digestives sont libérées à la fois en prévision de manger, lorsque nous sentons et goûtons pour la première fois les aliments, ainsi que tout au long du processus digestif. Certains aliments contiennent des enzymes digestives naturelles qui contribuent à la dégradation de certains nutriments spécifiques.

Les carences en enzymes digestives sont associées à une variété de problèmes de santé, en particulier ceux qui affectent le pancréas car il sécrète plusieurs enzymes clés.

Souvent, ces carences peuvent être corrigées par des changements alimentaires, tels que la restriction de certains aliments ou l'ajout de ceux contenant des enzymes digestives naturelles, ou en prenant des suppléments enzymatiques sur ordonnance ou en vente libre (OTC).


Introduction

Les parties de plantes sont utilisées pour le traitement et la gestion de la douleur et de l'inflammation depuis des temps immémoriaux. Des travaux antérieurs et en cours avec des extraits de plantes ont identifié certains composés antinociceptifs prometteurs, par exemple, C-flavones glycosylées (CGF) qui se sont avérées présenter une activité analgésique à la fois dans les extraits partiellement purs 1,2 et les formes purifiées 3,4. Les CGF comprennent une ou plusieurs fractions de sucre liées à un échafaudage aglycone par une liaison glycosidique directe C-C (Fig. supplémentaire 1). Comparé à d'autres classes de flavones et étroitement liés O-flavonoïdes glycosylés, on en sait moins sur C-les flavonoïdes glycosylés en termes de leur modèle de distribution dans le règne végétal, l'histoire évolutive des gènes spécifiques à une voie et leur mécanisme pharmacologique pour l'activité anti-nociceptive et d'autres fonctionnalités biologiques.

En tant que l'une des sources les plus riches de flavonoïdes naturels, les plantes de la famille des graminées fournissent un large éventail de CGF chimiquement divers dans leurs parties comestibles et non comestibles. Au cours du dernier demi-siècle, d'immenses études phytochimiques sur les cultures agricoles importantes, à savoir le riz 5,6 , le blé 7 , le maïs 8 , l'orge 9 et même les cultures de rente comme la canne à sucre 10,11 ont documenté et profilé d'abondantes C-glycosides dans les feuilles, les coques et les grains, représentés par la vitexine (Vit), l'orientine (Ori), le schaftoside, le carlinoside et la maysine (tableau supplémentaire 1). Le bambou, bien qu'il ne soit pas cultivé pour la production alimentaire, fait également partie de la famille des graminées largement répandue dans le monde et contient divers produits utiles à l'homme. Les parties comestibles du bambou comme les pousses et les graines sont couramment consommées en Asie orientale et méridionale en tant que riche source alimentaire de fibres et de nutriments, ainsi que de métabolites phénoliques spécifiques aux plantes 12,13. Cependant, comme c'est le cas pour de nombreuses cultures vivrières, les feuilles de bambou non comestibles riches en CGF sont généralement considérées comme beaucoup moins précieuses et largement abandonnées. Même si les anciens Chinois croyaient que certains médicaments populaires ou tisanes à base de feuilles de bambou pouvaient aider à éliminer la « chaleur toxique », entraînant un soulagement de l'inflammation et de la douleur 14 , une mauvaise compréhension à la fois de la machinerie biosynthétique des CGF dans les bambous et de la des mécanismes pharmacologiques définis ont gravement entravé l'utilisation efficace et extensive des feuilles de bambou comme analgésiques.

La biosynthèse in planta du CGF (Fig. 1) a été jusqu'à présent partiellement établie dans quelques plantes monocotylédones et dicotylédones 15,16,17,18,19,20,21,22,23. Il est entendu que la voie implique la biosynthèse des précurseurs en amont et plusieurs enzymes de modification en aval, notamment les cytochromes P450 et les glycosyltransférases. Après formation par condensation de p-coumaroyl-CoA de la voie de la phénylalanine et malonyl-CoA de la biosynthèse des acides gras, la naringénine (Nar), le démarreur commun de tous les flavonoïdes, est détournée vers l'hydroxylation sur l'échafaudage des flavanones par deux oxygénases P450, les flavanone 2-hydroxylases (F2H) et flavanone 3′-hydroxylases (F3′H). Alors que les F3′H sont généralement présents dans la plupart des plantes, les F2H sont très spécifiques aux voies du CGF et les quelques cas sont signalés dans les céréales 19,20,24. Par la suite, un C-glycosyltransférase (CGT) qui agit sur une forme à cycle ouvert de l'intermédiaire 2-hydroxylé est la clé de C-formation de glycosides (Fig. 1). Les CGT appartiennent à la famille des glycosyltransférases dépendantes de l'UDP (UGT) qui utilisent les sucres UDP activés comme donneur. Malgré ce direct C-glycosylation sur le squelette flavonoïde final ont été documentées dans Pueraria lobée 25 , Gentiane triflore 26 et Trollius chinensis 27, les autres CGT existants proviennent exclusivement de la sous-famille UGT708 et d'intermédiaires glycosylés 2-hydroxylés avec l'UDP-glucose (UDP-Glc). Compte tenu de la diversité chimique des CGF connus portant divers sucres et différents modèles de glycosylation autres que la substitution glucosyle, il existe encore un énorme écart entre les CGT connus et les diverses structures des CGF. Les C-les intermédiaires glucosylés sont instables et subissent donc une déshydratation spontanée en solvant acide (Fig. 1), conduisant à un mélange de Vit (apigénine 8-C-β- d -glucoside)/isovitexine (Isovit, apigénine 6-C-β- d -glucoside) et Ori (lutéoline 8-C-β- d -glucoside)/isoorientine (Isoori, lutéoline 6-C-β- d -glucoside).

Les flèches grises représentent les principales enzymes responsables de la biosynthèse de la naringénine. Les flèches bleues sont les flavanone 2-hydroxylases (F2H) et les flavanone 3'-hydroxylases (F3'H) décorant le squelette de la flavanone. CLes -glycosyltransférases (CGT) sont indiquées par des flèches rouges. Après la formation de C-intermédiaires glycosylés, une réaction de déshydratation se produit spontanément dans un solvant acide (flèches jaunes), produisant un mélange de 6-C- ou 8-C-glucosides. TAL tyrosine ammoniac lyase, 4CL 4-coumarate CoA ligase, CHS chalcone synthase, CHI chalcone isomérase, Nar naringenin, Eri eriodictyol, 2OHNar 2-hydroxylnaringenin, 2OHEri 2-hydroxyleriodictyol, Vitvitexine, Isovit isovitexin,orientin, Isovit isovitexin,orient

Une meilleure compréhension de la voie biosynthétique des CGF ainsi que la dissection des cibles pharmacologiques de l'activité biologique peuvent permettre une utilisation plus efficace des parties classiquement rejetées du bambou et des cultures, ainsi qu'accélérer la production durable de CGF grâce à la biologie synthétique. Dans cette étude, nous avons profité de la disponibilité récente des génomes de la famille des graminées pour découvrir de manière exhaustive les gènes CGT et P450 impliqués dans la biosynthèse du CGF. Par des approches génomiques et biochimiques comparatives, bifonctionnelles C-arabinosyle/C-les enzymes de transfert de glucosyle, une branche jusqu'alors inconnue dans les CGT de céréales et de bambous, ont été profilées fonctionnellement. Nous avons également démontré le succès de l'expression hétérologue de protéines d'origine du bambou par ingénierie métabolique dans un Escherichia coli châssis et en outre évalué l'efficacité des principaux CGF de bambous dans un modèle de souris in vivo.


La Division offre à ceux qui ne poursuivent pas une majeure en biologie, la possibilité d'obtenir une mineure en biologie générale. La Division des sciences biologiques offre une mineure sans spécialités disciplinaires.

La Division des sciences biologiques propose un programme contigu BS / MS menant à une maîtrise ès sciences en biologie. Le programme contigu est conçu spécifiquement pour certains étudiants de premier cycle de l'UC San Diego inscrits dans l'une des majeures en biologie proposées par la Division des sciences biologiques. Les étudiants qualifiés postulent au programme au début de leur dernière année en tant qu'étudiant de premier cycle. Les étudiants admis au programme qui remplissent avec succès toutes les exigences peuvent obtenir le MS. dans les trois à cinq trimestres suivant la réception du BS.


Kinase

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Kinase, une enzyme qui ajoute des groupements phosphate (PO4 3− ) à d'autres molécules. Il existe un grand nombre de kinases : le génome humain contient au moins 500 gènes codant pour les kinases. Parmi les cibles de ces enzymes pour l'addition de groupes phosphate ( phosphorylation) figurent les protéines, les lipides et les acides nucléiques.

Pour les cibles protéiques, les kinases peuvent phosphoryler les acides aminés sérine, thréonine et tyrosine. La phosphorylation réversible des protéines, par l'action antagoniste (opposée) des kinases et des phosphatases, est une composante importante de la signalisation cellulaire car les états phosphorylés et non phosphorylés de la protéine cible peuvent avoir différents niveaux d'activité. Edwin Gerhard Krebs et Edmond H. Fischer ont reçu le prix Nobel de physiologie ou médecine en 1992 pour leur travail dans l'établissement de ce paradigme.

La phosphorylation des molécules lipidiques par les kinases est importante pour contrôler la composition moléculaire des membranes dans les cellules, ce qui permet de préciser les propriétés physiques et chimiques des différentes membranes. L'inositol, un composé de structure similaire à un glucide, est phosphorylé par des kinases pour créer une gamme diversifiée de lipides phosphoinositol et phosphoinositide. Ces molécules fonctionnent alors comme des seconds messagers pour propager des informations de signalisation dans toute la cellule.

Les nucléotides, les unités fondamentales de l'ARN (acide ribonucléique) et de l'ADN (acide désoxyribonucléique), contiennent une molécule de phosphate attachée à un nucléoside, un composé constitué d'un fragment ribose et d'une base purine ou pyrimidine. Dans les polymères d'ARN et d'ADN, le squelette est composé d'unités phospho-ribose répétées. Les kinases attachent le phosphate au nucléoside, créant un nucléotide monophosphate. Par exemple, une enzyme appelée nucléoside phosphorylase joue ce rôle lorsque les cellules passent à la synthèse de nucléotides à partir de purines recyclées au lieu de nouveaux matériaux de départ. Des mutations dans le gène codant pour la nucléoside phosphorylase peuvent provoquer une forme sévère de déficit immunitaire.

Le métabolisme des sucres alimentaires (glycolyse) implique plusieurs étapes différentes de phosphorylation par des kinases distinctes. Ces groupes phosphate sont finalement utilisés pour former le composé à haute énergie connu sous le nom d'ATP (adénosine triphosphate).

Les inhibiteurs de kinases peuvent être des traitements importants pour les maladies humaines dans lesquelles les processus hyperactifs doivent être amortis. Par exemple, une forme de leucémie humaine, la LMC (leucémie myéloïde chronique), est causée par une activité excessive de la tyrosine kinase d'Abelson. L'imatinib (Gleevec) est un produit chimique qui se lie au site actif de cette kinase, bloquant ainsi la capacité de l'enzyme à phosphoryler les cibles. L'imatinib a été utile dans le traitement initial de la LMC, cependant, dans de nombreux cas, l'enzyme kinase mute, rendant le médicament inefficace.


Reconnaissance du nucléosome par les facteurs et enzymes de la chromatine

Nous possédons maintenant des structures tant attendues de facteurs de chromatine liés au nucléosome.

Les structures mettent en évidence le rôle de la multivalence dans la reconnaissance des nucléosomes.

Le motif d'ancrage arginine est en train de devenir un paradigme pour la liaison aux nucléosomes.

L'expression dynamique du génome nécessite une liaison coordonnée des facteurs de la chromatine et des enzymes qui effectuent les processus modélisés du génome. Jusqu'à récemment, les mécanismes moléculaires régissant la façon dont ces facteurs et enzymes reconnaissent et agissent sur l'unité fondamentale de la chromatine, la particule centrale du nucléosome, sont restés un mystère. Un ensemble restreint mais croissant de structures du nucléosome en complexe avec des facteurs et des enzymes de la chromatine met en évidence l'importance de la multivalence dans la définition de la liaison et de la spécificité du nucléosome. De nombreuses interactions de ce type incluent un motif d'ancrage arginine, qui cible un patch acide unique sur la surface du nucléosome. Ces paradigmes émergents pour la reconnaissance de la chromatine seront discutés, en se concentrant sur plusieurs percées structurelles récentes.


Biocapteurs : caractéristiques, principe et types (avec diagramme)

Un biocapteur est un dispositif analytique contenant un matériel biologique immobilisé (enzyme, anticorps, acide nucléique, hormone, organite ou cellule entière) qui peut spécifiquement interagir avec un analyte et produire des signaux physiques, chimiques ou électriques qui peuvent être mesurés. Un analyte est un composé (par exemple glucose, urée, médicament, pesticide) dont la concentration doit être mesurée.

Les biocapteurs impliquent essentiellement l'analyse quantitative de diverses substances en convertissant leurs actions biologiques en signaux mesurables. Une grande majorité de biocapteurs ont des enzymes immobilisées. La performance des biocapteurs dépend principalement de la spécificité et de la sensibilité de la réaction biologique, en plus de la stabilité de l'enzyme.

Caractéristiques générales des biocapteurs:

Un biocapteur a deux composants distincts (Fig. 21.13).

1. Composant biologique—enzyme, cellule, etc.

2. Composant physique—transducteur, amplificateur, etc.

Le composant biologique reconnaît et interagit avec l'analyte pour produire un changement physique (un signal) qui peut être détecté par le transducteur. En pratique, le matériel biologique est immobilisé de manière appropriée sur le transducteur et les biocapteurs ainsi préparés peuvent être utilisés de manière répétée plusieurs fois (peut être environ 10 000 fois) pendant une longue période (plusieurs mois).

Principe d'un biocapteur:

Le matériel biologique souhaité (généralement une enzyme spécifique) est immobilisé par des méthodes conventionnelles (piégeage physique ou membranaire, liaison non covalente ou covalente). Ce matériel biologique immobilisé est en contact intime avec le transducteur. L'analyte se lie au matériel biologique pour former un analyte lié qui produit à son tour la réponse électronique qui peut être mesurée.

Dans certains cas, l'analyte est converti en un produit qui peut être associé à la libération de chaleur, de gaz (oxygène), d'électrons ou d'ions hydrogène. Le transducteur peut convertir les changements liés au produit en signaux électriques qui peuvent être amplifiés et mesurés.

Types de biocapteurs:

Il existe plusieurs types de biocapteurs en fonction des dispositifs de détection et du type de matériel biologique utilisé. Quelques-uns d'entre eux sont examinés ci-dessous.

Biocapteurs électrochimiques:

Les biocapteurs électrochimiques sont des dispositifs simples basés sur les mesures des changements de courant électrique, ionique ou de conductance effectuées par des bioélectrodes.

Biocapteurs ampérométriques:

Ces biocapteurs sont basés sur le mouvement des électrons (c'est-à-dire la détermination du courant électrique) à la suite de réactions redox catalysées par des enzymes. Normalement, une tension constante passe entre les électrodes qui peut être déterminée. Dans une réaction enzymatique qui se produit, le substrat ou le produit peut transférer un électron avec la surface de l'électrode à oxyder ou à réduire (Fig. 21.14).

Il en résulte un flux de courant altéré qui peut être mesuré. L'amplitude du courant est proportionnelle à la concentration du substrat. Électrode à oxygène Clark qui détermine la réduction de O2, est la forme la plus simple de biocapteur ampérométrique. La détermination du glucose par la glucose oxydase en est un bon exemple.

Dans les biocapteurs ampérométriques de première génération (décrits ci-dessus), il y a un transfert direct des électrons libérés vers l'électrode qui peut poser quelques difficultés pratiques. Des biocapteurs ampérométriques de deuxième génération ont été développés dans lesquels un médiateur (par exemple des ferrocènes) capte les électrons et les transfère ensuite à l'électrode. Cependant, ces biocapteurs ne sont pas encore devenus populaires.

Biocapteur de glycémie :

C'est un bon exemple de biocapteurs ampérométriques, largement utilisés dans le monde entier par les patients diabétiques. Le biocapteur de glycémie ressemble à un stylo de montre et possède une électrode jetable à usage unique (constituée d'une électrode de référence Ag/AgCI et d'une électrode de travail au carbone) avec de la glucose oxydase et un dérivé du ferrocène (comme médiateur). Les électrodes sont recouvertes de gaze à mailles hydrophile pour une diffusion uniforme d'une goutte de sang. Les bandelettes de test jetables, scellées dans du papier d'aluminium, ont une durée de conservation d'environ six mois.

Un biocapteur ampérométrique pour évaluer la fraîcheur du poisson a été développé. L'accumulation d'ionosine et d'hypoxanthine par rapport aux autres nucléotides indique la fraîcheur du poisson - combien de temps mort et stocké. Un biocapteur utilisant une nucléoside phosphorylase et une xanthine oxydase immobilisées sur une électrode a été développé à cette fin.

Biocapteurs potentiométriques:

Dans ces biocapteurs, les modifications des concentrations ioniques sont déterminées à l'aide d'électrodes sélectives d'ions (Fig. 21.15). L'électrode de pH est l'électrode sélective d'ions la plus couramment utilisée, car de nombreuses réactions enzymatiques impliquent la libération ou l'absorption d'ions hydrogène. Les autres électrodes importantes sont sélectives pour l'ammoniac et le CO2 électrodes sélectives.

La différence de potentiel obtenue entre l'électrode potentiométrique et l'électrode de référence peut être mesurée. Elle est proportionnelle à la concentration du substrat. La limitation majeure des biocapteurs potentiométriques est la sensibilité des enzymes aux concentrations ioniques telles que H + et NH + 4.

Les transistors à effet de champ à sélectivité ionique (ISFET) sont des dispositifs à faible coût qui peuvent être utilisés pour la miniaturisation des biocapteurs potentiométriques. Un bon exemple est un biocapteur ISFET utilisé pour surveiller le pH intra-myocardique pendant une chirurgie à cœur ouvert.

Conduire des biocapteurs métriques:

Il existe plusieurs réactions dans les systèmes biologiques qui entraînent des changements dans les espèces ioniques. Ces espèces ioniques altèrent la conductivité électrique qui peut être mesurée. Un bon exemple de biocapteur métrique de conduite est le biocapteur d'urée utilisant de l'uréase immobilisée. L'uréase catalyse la réaction suivante.

La réaction ci-dessus est associée à une modification drastique de la concentration ionique qui peut être utilisée pour surveiller la concentration en urée. En fait, les biocapteurs d'urée sont utilisés avec beaucoup de succès pendant la dialyse et la chirurgie rénale.

Biocapteurs thermométriques:

Plusieurs réactions biologiques sont associées à la production de chaleur et cela constitue la base des biocapteurs thermométriques. Ils sont plus communément appelés biocapteurs thermiques ou biocapteurs calorimétriques. Une représentation schématique d'un biocapteur thermique est illustrée à la Fig. 21.16. Il se compose d'un caisson calorifugé équipé d'un échangeur de chaleur (cylindre en aluminium).

La réaction a lieu dans un petit réacteur à lit garni d'enzymes. Lorsque le substrat pénètre dans le lit, il est converti en un produit et de la chaleur est générée. La différence de température entre le substrat et le produit est mesurée par des thermistances. Même un petit changement de température peut être détecté par des biocapteurs thermiques.

Les biocapteurs thermométriques sont utilisés pour l'estimation du cholestérol sérique. Lorsque le cholestérol est oxydé par l'enzyme cholestérol oxydase, de la chaleur est générée et peut être mesurée. De même, des estimations de glucose (enzyme-glucose oxydase), d'urée (enzyme-uréase), d'acide urique (enzyme-uricase) et de pénicilline G (enzyme-P lactamase) peuvent être effectuées par ces biocapteurs. En général, leur utilité est cependant limitée. Les biocapteurs thermométriques peuvent être utilisés dans le cadre d'un dosage immunoenzymatique (ELISA) et la nouvelle technique est appelée ELISA thermométrique (TELISA).

Biocapteurs optiques:

Les biocapteurs optiques sont les appareils qui utilisent le principe des mesures optiques (absorbance, fluorescence, chimiluminescence etc.). Ils utilisent des fibres optiques et des transducteurs optoélectroniques. Le mot optrode, représentant une condensation des mots optique et électrode est couramment utilisé. Les biocapteurs optiques impliquent principalement des enzymes et des anticorps comme éléments de transduction.

Les biocapteurs optiques permettent une télédétection non électrique sûre des matériaux. Un autre avantage est que ces biocapteurs ne nécessitent généralement pas de capteurs de référence, car le signal comparatif peut être généré en utilisant la même source de lumière que le capteur d'échantillonnage. Certains des biocapteurs optiques importants sont brièvement décrits ci-dessous.

Biocapteur de lactate à fibre optique:

La figure 21.17 représente le biocapteur de lactate à fibre optique. Son fonctionnement est basé sur la mesure des variations de l'O moléculaire2 concentration en déterminant l'effet d'extinction de O2 sur un colorant fluorescent. La réaction suivante est catalysée par l'enzyme lactate mono-oxygénase.

La quantité de fluorescence générée par le film teint dépend de l'O2. C'est parce que O2 a un effet d'extinction (réduction) sur la fluorescence. Lorsque la concentration de lactate dans le mélange réactionnel augmente, O2 est utilisé, et par conséquent il y a une diminution proportionnelle de l'effet de trempe. Le résultat est qu'il y a une augmentation de la sortie fluorescente qui peut être mesurée.

Biocapteurs optiques pour la glycémie:

L'estimation de la glycémie est très importante pour la surveillance du diabète. Une technique simple impliquant des bandes de papier imprégnées de réactifs est utilisée à cet effet. Les bandelettes contiennent de la glucose oxydase, de la peroxydase de raifort et un chromogène (par exemple la toluidine). Les réactions suivantes se produisent.

L'intensité de la couleur du colorant peut être mesurée à l'aide d'un réflectomètre portable. La production de bandes de glucose est une très grande industrie dans le monde entier.

Des bandelettes de test colorimétriques de cellulose recouvertes d'enzymes et de réactifs appropriés sont utilisées pour l'estimation de plusieurs paramètres sanguins et urinaires.

Des biocapteurs luminescents pour détecter les infections urinaires:

Les micro-organismes présents dans l'urine, provoquant des infections des voies urinaires, peuvent être détectés en utilisant des biocapteurs luminescents. A cet effet, l'enzyme immobilisée (voire libre) à savoir la luciférase est utilisée. Les micro-organismes, lors de la lyse, libèrent de l'ATP qui peut être détecté par la réaction suivante. La quantité de lumière émise peut être mesurée par des appareils électroniques.

Autres biocapteurs optiques:

Des dispositifs de détection à fibre optique sont utilisés pour mesurer le pH, le pCO2 et pO2 en soins intensifs et le suivi chirurgical.

Biocapteurs piézoélectriques:

Les biocapteurs piézoélectriques sont basés sur le principe de l'acoustique (vibrations sonores), c'est pourquoi ils sont également appelés biocapteurs acoustiques. Les cristaux piézoélectriques constituent la base de ces biocapteurs. Les cristaux avec des charges positives et négatives vibrent avec des fréquences caractéristiques. L'adsorption de certaines molécules à la surface du cristal modifie les fréquences de résonance qui peuvent être mesurées par des appareils électroniques. Des enzymes avec des substrats gazeux ou des inhibiteurs peuvent également être attachés à ces cristaux.

Un biocapteur piézoélectrique pour insecticide organophosphoré a été développé incorporant l'acétylcholine estérase. De même, un biocapteur de formaldéhyde a été développé en incorporant de la formaldéhyde déshydrogénase. Un biocapteur de cocaïne en phase gazeuse a été créé en fixant des anticorps anti-cocaïne à la surface d'un cristal piézoélectrique.

Limites des biocapteurs piézoélectriques:

Il est très difficile d'utiliser ces biocapteurs pour déterminer des substances en solution. En effet, les cristaux peuvent cesser d'osciller complètement dans les liquides visqueux.

Biocapteurs à cellules entières:

Les biocapteurs à cellules entières sont particulièrement utiles pour les réactions à plusieurs étapes ou nécessitant un cofacteur. Ces biocapteurs peuvent utiliser des cellules microbiennes vivantes ou mortes. Une liste sélectionnée de certains organismes ainsi que les analytes et les types de biocapteurs utilisés est donnée dans le tableau 21.8

Avantages des biocapteurs cellulaires microbiens:

Les cellules microbiennes sont moins chères avec des demi-vies plus longues. De plus, elles sont moins sensibles aux variations de pH et de température par rapport aux enzymes isolées.

Limites des biocapteurs cellulaires microbiens:

Les cellules entières, en général, nécessitent des périodes plus longues pour la catalyse. De plus, la spécificité et la sensibilité des biocapteurs à cellules entières peuvent être inférieures à celles des enzymes.

Immuno-biocapteurs:

Les immuno-biocapteurs ou bio­capteurs immunochimiques fonctionnent sur le principe de la spécificité immunologique, couplée à une mesure (principalement) basée sur des bio­sensors ampérométriques ou potentiométriques. Il existe plusieurs configurations possibles pour les immuno-biocapteurs et certaines d'entre elles sont représentées sur la figure 21.18, et brièvement décrites ci-dessous.

1. Un anticorps immobilisé auquel l'antigène peut se lier directement (Fig. 21.18A).

2. Un antigène immobilisé qui se lie à un anticorps qui à son tour peut se lier à un deuxième antigène libre (Fig. 21.18B).

3. Un anticorps lié à l'antigène immobilisé qui peut être partiellement libéré par compétition avec l'antigène libre (Fig. 21.18C).

4. Un anticorps immobilisé liant un antigène libre et un antigène marqué par une enzyme en compétition (Fig. 21.18D).

Pour les biocapteurs 1-3, des dispositifs piézoélectriques peuvent être utilisés. Les immuno-biocapteurs utilisant des enzymes (4 ci-dessus, Fig. 21.18D) sont les plus couramment utilisés. Ces biocapteurs utilisent des dispositifs thermométriques ou ampérométriques. L'activité des enzymes liées aux immuno-biocapteurs dépend des concentrations relatives des antigènes marqués et non marqués. La concentration de l'antigène non marqué peut être déterminée en dosant l'activité enzymatique.


Mécanismes de régulation enzymatique : les méthodes moléculaires pour réguler les enzymes et l'activité enzymatique

Ø Tous les organismes vivants dans le monde devraient posséder DEUX propriétés fondamentales
ØIls sont :
(1). Doit être capable de s'auto-répliquer
(2). Doit être capable de catalyser des réactions chimiques de manière efficace et sélective
Ø Les enzymes sont les molécules qui permettent à chaque entité vivante de faire ces deux activités fondamentales
Ø Les enzymes sont mieux connues sous le nom de catalyseurs biologiques

Ø Presque toutes les enzymes sont des protéines hautement spécialisées
Ø Ribozymes: Molécules d'ARN aux propriétés catalytiques
Ø Abzymes: anticorps aux propriétés catalytiques

Qu'est-ce que la régulation enzymatique ?

Ø Définition de la régulation enzymatique : « Processus par lequel les cellules peuvent activer, désactiver ou moduler les activités de diverses voies métaboliques en régulant l'activité des enzymes »

Ø Les enzymes ont un pouvoir catalytique extraordinaire

Ø Ils peuvent augmenter le taux de réaction chimique mille fois

Ø Dans des conditions optimales, les enzymes sont capables de convertir des millions de molécules de substrat en produits en une courte fraction de temps

Ø Il est très essentiel de contrôler l'activité de l'enzyme afin de réguler les activités métaboliques dans la cellule

Ø La régulation enzymatique permettra aux besoins changeants de la cellule de répondre à ses demandes d'énergie et de ressources

Ø Si un produit est disponible en excès, la régulation enzymatique pourrait alors détourner les ressources vers d'autres réactions nécessiteuses

Ø Si un produit est en demande, il pourrait activer des voies pour produire plus de biomolécule nécessaire

Que sont les enzymes régulatrices ?

Ø Dans les activités métaboliques cellulaires, de nombreuses enzymes travaillent ensemble dans une séquence pour effectuer le processus métabolique donné

Ø Exemple, la voie de la glycolyse comprend dix étapes séquentielles chacune catalysée par des enzymes spécifiques

Ø Dans un tel processus enzymatique, si plusieurs étapes sont impliquées, le produit de réaction d'une réaction enzymatique agit comme substrat pour l'enzyme suivante

Ø Définition de l'enzyme réglementaire : "Dans un processus enzymatique en plusieurs étapes, il y aura une enzyme qui sera responsable du taux global de ce processus"

Ø Cette enzyme limitant le taux critique est appelée enzyme régulatrice

Ø L'enzyme régulatrice montre des activités catalytiques améliorées ou diminuées en réponse à d'autres molécules (signaux) dans les cellules

Quelle enzyme est l'enzyme régulatrice dans une voie métabolique à plusieurs étapes ?

Ø La première enzyme de la séquence métabolique multi-enzymatique agit comme enzyme régulatrice

Ø La première réaction est l'endroit idéal pour réguler ou contrôler une voie métabolique

Ø C'est parce que la catalyse même des premières réactions consomme beaucoup d'énergie métabolique qui peut être détournée vers d'autres processus plus importants

Mécanismes de régulation enzymatique :

Ø CINQ différents types de mécanisme de régulation enzymatique se produisent dans les cellules

Ø Les activités de l'enzyme régulatrice sont modulées de diverses manières

Ø Les différents types de méthodes de régulation enzymatique sont :

(1). Enzymes allostériques (régulation allostérique des enzymes)

La rétro-inhibition

(2). Modification covalente réversible des enzymes

(3). Activation protéolytique de l'enzyme

(4). Régulation de la rétroaction

(5). Régulation par les isoenzymes (isozymes)

(1). Enzymes allostériques

Qu'est-ce que la régulation allostérique de l'enzyme?

Ø Les enzymes allostériques sont une classe d'enzymes régulatrices

Ø Définition de la régulation allostérique : Un type de régulation enzymatique par la liaison non covalente réversible de molécules régulatrices à l'enzyme

Ø Les molécules régulatrices sont dites allostériques modulateurs ou allostérique effecteurs

Ø Les enzymes allostériques ont des conformations supplémentaires induites par la liaison de modulateurs

Ø Les changements conformationnels induits par les modulateurs allostériques peuvent produire des formes d'enzymes plus ou moins actives

Ø Les modulateurs allostériques peuvent être inhibiteurs (+) ou stimulateurs (-)

Ø Deux types d'enzymes allostériques selon la nature du modulateur :

1. Enzymes allostériques homotropes

2. Enzymes allostériques hétérotropes

Ø Dans la plupart des cas, le substrat lui-même agit comme le modulateur

Ø Les enzymes allostériques dont le substrat et les modulateurs sont identiques sont appelées enzymes allostériques homotropes

Ø La liaison du modulateur provoque des changements de conformation de l'enzyme

Ø Les changements de conformation affectent l'activité enzymatique ultérieure

Ø Si le modulateur est une molécule autre qu'un substrat, l'enzyme est appelée enzyme allostérique hétérotrope

Ø Les modulateurs allostériques ne doivent pas être considérés comme des inhibiteurs compétitifs ou non compétitifs

Ø Les enzymes allostériques possèdent un ou plusieurs sites régulateurs ou allostériques

Ø Les sites allostériques agissent comme le site de liaison du modulateur

Ø Le modulateur et le site de liaison du modulateur sur l'enzyme sont très spécifiques similaires au substrat spécifique de son site actif

Ø Les enzymes allostériques sont généralement plus grosses et plus complexes que les enzymes non allostériques

Ø Les enzymes allostériques possèdent de nombreuses sous-unités

Ø Aspartate transcarbamoylase (une enzyme allostérique), qui catalyse une réaction précoce dans la biosynthèse des nucléotides pyrimidiques, possède 12 chaînes polypeptidiques organisées en sous-unités catalytiques et régulatrices. Les enzymes avec plusieurs modulateurs ont des sites de liaison différents et spécifiques pour chacun

Ø Dans la plupart des enzymes allostériques, le côté de liaison au substrat et les sites de liaison du modulateur se trouvent sur différentes sous-unités

Ø Le site de liaison du substrat est appelé sous-unité catalytique ou sous-unité C

Ø La sous-unité de liaison du modulateur est appelée la sous-unité de réglementation ou sous-unité R

Ø La liaison d'un modulateur positif ou stimulateur (M) à son site spécifique sur la sous-unité régulatrice est communiquée à la sous-unité catalytique par des changements conformationnels

Ø Ce changement rend l'activation de la sous-unité catalytique

Ø L'activation permet la liaison du substrat (S) avec une affinité plus élevée

Ø Une fois le modulateur dissocié de la sous-unité régulatrice, l'enzyme revient à sa forme inactive ou moins active

Ø Les enzymes allostériques montrent des variations dans les paramètres cinétiques enzymatiques

Ø Les enzymes allostériques ne suivent pas Michaelis-Menten Kinetics

Ø Les enzymes allostériques ne présentent pas la courbe hyperparabolique habituelle lorsque la vitesse initiale Vo est tracée en fonction de la concentration du substrat [S]

Ø Ils montrent une courbe sigmoïde lorsque la vitesse est tracée en fonction de la concentration du substrat

Ø Le graphique Lineweaver-Burk montre également la différence par rapport aux enzymes habituelles

Ø Le tracé Lineweaver-Burk d'une enzyme allostérique sera de forme concave vers le haut

Ø L'inhibition de la rétroaction est un type de régulation allostérique

Qu'est-ce que l'inhibition de la rétroaction ?

Ø L'inhibition de la rétroaction et la régulation de la rétroaction sont des termes différents

Ø L'inhibition de la rétroaction est un type spécifique de mécanisme de régulation de l'activité enzymatique allostérique dans les cellules

Ø Définition de l'inhibition de la rétroaction : dans certaines voies multi-enzymatiques, l'enzyme régulatrice est spécifiquement inhibée par le produit final de la voie chaque fois que la concentration du produit final dépasse les besoins de la cellule

Ø Lorsque la réaction enzymatique régulatrice est ralentie, toutes les enzymes suivantes fonctionnent à des taux réduits car leurs substrats sont également épuisés

Ø Le taux de production du produit final de la filière est ainsi mis en équilibre avec les besoins de la cellule

Ø Ce type de régulation par le produit final inhibant la première enzyme de la voie multi-enzymatique est appelé rétro-inhibition

Exemple d'inhibition de la rétroaction :

Ø L'exemple le plus cité de rétro-inhibition allostérique est la biosynthèse de L-isoleucine à partir de L-thréonine dans les bactéries

Ø Chez les bactéries, la conversion de la L-thréonine en L-isoleucine se déroule en cinq étapes

Ø Chaque étape est catalysée par une enzyme spécifique

Ø La première enzyme de ce système est Thréonie déshydratase

Ø La thréonine déshydratase est inhibée par l'isoleucine, le produit de la dernière réaction (produit final)

Ø Ceci est un exemple d'inhibition allostérique hétérotrope

Ø L'isoleucine est assez spécifique en tant qu'inhibiteur

Ø Tout autre intermédiaire dans cette séquence ne peut pas inhiber la thréonine déshydratase

Ø De plus, aucune autre enzyme de la séquence n'est inhibée par l'isoleucine

Ø L'isoleucine ne se lie pas au site actif de l'enzyme

Ø Il se lie à un autre site spécifique de la molécule d'enzyme, le site régulateur

Ø La liaison est non covalente et facilement réversible

Ø Lorsque la concentration en isoleucine diminue, l'isoleucine se lie au site régulateur de la thréonine déshydratease se détache et rend l'enzyme à nouveau active

Ø Ainsi l'activité de la thréonine déshydratase répond rapidement et de manière réversible aux fluctuations de la concentration cellulaire en isoleucine

(2). Modification covalente inverse :

Comment des modifications covalentes réversibles régulent l'activité enzymatique ?

Ø Ici, l'activité catalytique est modulée par la modification covalente réversible de l'enzyme

Ø Plus de 500 molécules différentes sont connues pour modifier les enzymes par cette méthode

Ø Les groupes modificateurs les plus courants comprennent les groupes phosphoryle, acétyle, adényle, uridylyle, méthyle, amide, carboxyle, prényle, hydroxyle, sulfate et adénosine diphosphate ribosyle

Ø Il y aura une enzyme séparée pour ajouter et supprimer des groupes de modification aux enzymes

Ø Modifications covalentes réversibles courantes de l'enzyme :

@. Phosphorylation: type le plus courant, ajout d'un groupe phosphate aux résidus Tyr, Ser, Thr et His de la protéine

@. Adénylation: ajout d'adénine au résidu Tyr de la protéine

@. ADP-ribosylation: ajout d'ADP ribose à Arg, Gln, Cys et Diphtamide de protéine (le dipthamide est un résidu Histidine modifié)

@. Méthylation: ajout d'un groupe méthyle au résidu Glu de la protéine

Ø Le ribose ADP dérivé du nicotinamide adénine dinucléotide (NAD) est ajouté à l'enzyme bactérienne dinitrogénase réductase, ce qui entraîne la régulation d'un processus important de fixation biologique de l'azote

Ø La toxine diphtérique et la toxine cholérique sont des enzymes qui catalysent la ribosylation (et l'inactivation) de l'ADP d'enzymes ou de protéines cellulaires clés

Ø La toxine diphtérique inhibe le facteur d'élongation 2 (EF2) de la biosynthèse des protéines

Ø La toxine cholérique agit sur une protéine G qui fait partie d'une voie de signalisation, conduisant à plusieurs réponses physiologiques dont une perte massive de fluides corporels et parfois la mort

Ø La phosphorylation est le type le plus courant de modification covalente réglementaire

Ø L'ajout de groupes phosphoryle à des résidus d'acides aminés spécifiques d'une protéine est appelé phosphorylation

Ø La réaction de phosphorylation est catalysée par l'enzyme protéine kinase.

Ø ATP ou GTP agit généralement comme donneur de groupe phosphate

Ø L'énergie dérivée du clivage du donneur de groupe phosphate est également utilisée

Ø Un tiers à la moitié de toutes les protéines dans une cellule eucaryote sont phosphorylées

Ø Certaines protéines n'ont qu'un seul résidu phosphorylé, d'autres ont plusieurs sites de phosphorylation

Ø Les groupes phosphoryle sont généralement ajoutés aux résidus Ser, Thr ou Thy de l'enzyme

Ø La phosphorylation introduit un groupe chargé volumineux dans une région qui n'était que modérément polaire

Ø L'élimination du groupe phosphoryle d'une protéine est appelée déphosphorylation

Ø La réaction de déphosphorylation est catalysée par la protéine phosphatase

(3). Activation protéolytique des enzymes :

Comment le clivage protéolytique de l'enzyme agit comme un mécanisme régulateur ?

Ø Les enzymes régulées par la méthode de clivage protéolytique sont d'abord produites sous forme de formes inactives

Ø La forme inactive de l'enzyme est appelée zymogène ou pro-enzyme

Ø La nature inactive des zymogènes est due au fait que le site actif sera masqué ou recouvert par une partie de la chaîne polypeptidique

Ø Les zymogènes sont ensuite convertis en enzymes actives

Ø La conversion se fait par l'élimination de parties spécifiques de l'enzyme par clivage protéolytique

Ø Le clivage spécifique provoque des changements de conformation qui exposent le site actif de l'enzyme

Ø Ce type d'activation est irréversible (une fois l'enzyme activée, elle ne peut pas être rendue inactive)

Ø Les enzymes protéolytiques (protéases) de l'estomac et du pancréas sont régulées par un mécanisme de clivage protéolytique

Pepsinogène → Pepsine (autoactivation, l'enzyme s'active)

Ø Importance de la production d'enzymes en tant que zymogène :

@. Aide à prévenir les dommages autocatalytiques des composants cellulaires

@. Aider à la mobilisation de l'enzyme dans la cellule

@. Peut être converti en formulaires actifs lorsque cela est nécessaire

@. Peut être stocké longtemps sous forme de zymogène

@. La demi-vie des zymogènes est généralement supérieure à ses enzymes actives

(4). Régulation de la rétroaction

Qu'est-ce que la régulation du feedback ?

Ø La régulation par rétroaction est différente de l'inhibition par rétroaction

Ø Un type de régulation de l'activité enzymatique

Ø Ici, le produit final d'une voie enzymatique inhibe directement la synthèse de l'enzyme concernée en interférant avec le gène de cette enzyme

Ø L'enzyme n'est pas directement inhibée par le produit final

Ø Le produit final réduit la concentration d'enzyme en inhibant la synthèse de nouvelles molécules enzymatiques

Ø Le meilleur exemple est la réduction de l'enzyme HMG CoA réductase par le cholestérol alimentaire

(5). Isoenzyme (isozyme)


Comment les isoenzymes régulent l'activité enzymatique ?

Ø Pas une méthode directe de régulation enzymatique

Ø Les isozymes sont des enzymes ayant une fonction catalytique similaire mais ayant des séquences d'acides aminés différentes

Ø Ils ont des paramètres cinétiques différents

Ø Le Km valeurs, Vmax et Vo des isozymes varie

Ø Km désigne l'affinité de l'enzyme envers son substrat

Ø Les isozymes permettent à la cellule de catalyser la même réaction dans différentes conditions des cellules

Ø La lactate déshydrogénase de mammifère (LDH) est un exemple classique d'isoenzyme

Ø Mammalian LDH est un tétramère de deux types de sous-unités (sous-unité A et sous-unité B)

Ø La LDH existe sous cinq formes différentes basées sur l'association tétramérique des sous-unités A et B

Ø Ils sont A4, A3B1, A2B2, A1B3 et B4

Ø Les paramètres cinétiques de toutes ces isoformes varient

Ø Différents tissus expriment différentes isoenzymes adaptées à leurs besoins métaboliques

Ø En régulant les quantités relatives de sous-unités A et B, les cellules de divers tissus peuvent réguler l'activité enzymatique dans des tissus spécifiques

Ø Exemple : dans le foie le type A4 de LDH prédomine alors que dans le cœur prédomine le type B4. Dans le cerveau, le type A1B3 est le plus courant

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Résultats

Dans la première moitié de la section Résultats, nous abordons la première question de savoir si la mort cellulaire induite par McrBC par clivage de chromosomes méthylés a lieu lors de l'entrée/l'induction d'un gène épigénétique de la méthyltransférase et provoque l'interruption de l'établissement/l'activation de ce gène.

Inhibition médiée par McrBC de l'établissement d'un gène d'ADN méthyltransférase

Nous nous sommes d'abord interrogés sur les conséquences biologiques de McrBC, c'est-à-dire si l'établissement d'un gène de méthyltransférase transféré est avorté par l'action de McrBC. Comme méthyltransférase, nous avons choisi la méthyltransférase PvuII (M.PvuII) du système PvuII RM. Il reconnaît CAGCTG et génère CAG m4 CTG [37, 41], une séquence cible de McrBC [33].

Plusieurs rapports ont indiqué que des phages ou des plasmides portant un gène d'ADN méthyltransférase ne pouvaient pas être propagés dans un mcrBC + souche de E. coli [42]. Que le blocage de la propagation soit dû à la méthylation répétée de l'ADN introduit et au clivage ultérieur [42] ou à la méthylation et au clivage du génome de l'hôte, comme nous l'avons supposé dans ce travail, n'a pas été abordé.

Nous avons introduit un plasmide portant le gène PvuII méthyltransférase (M. PvuII, CAG m4 CTG) mais dépourvu de sites de reconnaissance PvuII (pEF43 dans le tableau 1) dans un essai de transformation quantitative (figure 2a). L'efficacité de transformation a diminué de quatre ordres de grandeur dans un mcrBC-dépendante (Figure 2b). La diminution ne s'est pas produite dans le cas des gènes de trois autres cytosine méthyltransférases, M.EcoRII (C m5 CWGG), M.SsoII (C m5 CNGG) et M.BamHI (GGAT m4 CC), conformément à la spécificité de séquence de McrBC [33]. Nous avons trouvé qu'un plasmide portant un gène PvuII méthyltransférase et deux sites de reconnaissance PvuII était également inhibé dans son établissement du même ordre de grandeur (date non indiquée). Nos résultats indiquent que les sites méthylés sur l'ADN transféré n'étaient pas requis pour l'inhibition dépendante de McrBC de son établissement et de sa propagation. Ces résultats démontrent que McrBC peut interrompre l'établissement de l'élément transféré avec le gène de la méthyltransférase et, en outre, suggèrent que cela se fait par le clivage médié par McrBC de l'ADN chromosomique méthylé, par opposition à celui sur l'ADN transféré.

Blocage médié par McrBC de l'établissement d'un système de méthylation du génome épigénétique. (une) Transformation quantitative. Des quantités variables de pUC19 (2 pg, 20 pg, 200 pg, 2 ng, 20 ng et 200 ng) ont été utilisées pour transformer E. coli DH5α par électroporation. Les expériences ont été menées en triple. (b) Transformation de plasmides portant le gène de la méthyltransférase PvuII. Des plasmides (100 ng) portant l'un des nombreux gènes de modification de la méthyltransférase ont été utilisés pour transformer E. coli ER1562 (mcrB1) et ER1563 (mcrBC + ). L'efficacité de transformation relative a été calculée comme le rapport de l'efficacité de transformation du plasmide test à celle du vecteur vide. M.PvuII (ColE1) indique pEF43, tandis que M.PvuII (pPvu1) indique pEF65 (tableau 1). Le vecteur vide pour ce dernier est pEF67, tandis que celui pour le premier est pEF33. Le vecteur pour les plasmides restants est pBR322. Les mesures de deux expériences distinctes menées en double sont présentées. Tous (20/20) des rares transformants de mcrBC + par pEF43 examiné se sont avérés avoir perdu l'activité McrBC.

Le complexe du gène PvuII RM a été trouvé sur pPvu1, un plasmide à faible nombre de copies de Proteus vulgaris [37] qui peut également se répliquer dans E. coli [43]. Proteus vulgaris et E. coli appartiennent tous deux à la famille des entérobactéries et partagent également une niche écologique, l'intestin de l'homme et des animaux apparentés. Par conséquent, ces expériences sont destinées à reproduire des événements susceptibles de se produire dans l'environnement naturel, bien qu'elles aient impliqué l'utilisation de plasmides multicopies (dérivés de ColE1). La transformation d'un plasmide dérivé de pPvu1 portant M.PvuII et un gène de résistance aux médicaments comme marqueur sélectif et dépourvu de sites PvuII (pEF65 dans le tableau 1) a été bloquée par McrBC aussi fortement que le plasmide multicopie ci-dessus (figure 2b). Ceci suggère que la forte inhibition est biologiquement pertinente.

Clivage chromosomique médié par McrBC après transfert médié par un phage du gène de l'ADN méthyltransférase

L'inhibition ci-dessus de l'établissement du gène de la méthyltransférase est probablement causée par un clivage mortel des chromosomes qui deviennent méthylés. Ensuite, nous avons demandé si McrBC clive effectivement les chromosomes de l'hôte afin d'interrompre la propagation d'un gène de méthylation du génome épigénétique transféré. Afin d'examiner cette question, nous avons introduit le gène M.PvuII dans E. coli par un vecteur de phage .

Nous avons d'abord préparé la souche de phage λ LIK891 avec 15 sites PvuII (Matériels et méthodes) chez un hôte porteur de PvuII méthyltransférase (Matériels et méthodes). Son statut de modification a été confirmé par sa résistance à la restriction PvuII à la fois in vitro et in vivo comme suit. Lorsque l'ADN du génome du phage préparé à partir de la préparation λ purifiée a été mis à réagir avec PvuII, aucun changement n'a été observé dans son schéma d'électrophorèse sur gel dans une condition où l'ADN du génome du phage non modifié était complètement clivé. La préparation de phage modifiée par PvuII n'a pas montré de diminution détectable de l'efficacité de la formation de plaques chez un hôte portant le système PvuII RM. Dans un E. coli mcrBC +, la préparation de phage λ modifié par PvuII n'a montré qu'une diminution de 10 fois de l'efficacité de formation de plaque (figure 3a). Conformément aux rapports précédents [36, 37], cette observation indique que McrBC ne peut pas restreindre efficacement un génome de phage méthylé.

Inhibition médiée par McrBC de la croissance des phages et du clivage chromosomique. (une) Titre phage sur ER1563 (mcrBC + ) divisé par son titre sur ER1562 (mcrB1) est tracé pour deux expériences indépendantes. (I) Une souche avec 15 sites PvuII (LIK891 voir Matériels et méthodes) (II) la même souche mais modifiée par PvuII méthyltransférase (III) la même souche avec insertion du gène PvuII méthyltransférase (LEF1). (b) Dégradation chromosomique dans ER1562 (mcrB1) et ER1563 (mcrBC + ). 5 × 10 8 cellules ont été infectées par LEF1 à une multiplicité d'infection de 5. Aux intervalles de temps indiqués (en minutes) après infection du phage portant le gène de la méthyltransférase PvuII (LEF1), l'ADN chromosomique a été préparé et soumis à de l'agarose en champ pulsé. électrophorèse sur gel. M, échelle d'ADN.

Cependant, la souche de phage λ LEF1, qui porte le gène de la méthyltransférase PvuII, a été restreinte 10 000 fois (figure 3a). Ce résultat est en accord avec les rapports antérieurs indiquant que les phages portant un gène de l'ADN méthyltransférase ne pouvaient pas être propagés dans un mcrBC + souche de E. coli [43]. Comme nous l'avons noté dans la section précédente, si le blocage de la propagation est dû à la méthylation répétée de l'ADN introduit et au clivage subséquent induit par McrBC [43] ou en raison de la méthylation du génome de l'hôte et de son clivage mortel induit par McrBC n'a pas été abordé.

Lorsque nous avons examiné les chromosomes des cellules infectées par électrophorèse sur gel en champ pulsé, nous avons observé une accumulation d'ADN linéaire énorme correspondant à des chromosomes cassés (indiqués sur la figure 3b dans les couloirs à 30 et 45 minutes après l'infection) et d'ADN plus petits de taille variable ( frottis sur la figure 3b dans le couloir 45 minutes après l'infection), ce qui reflète probablement la dégradation des chromosomes. Leur apparence était mcrBC + -dépendant (mcrB1 voies sur la figure 3b). Cette observation suggère fortement que la méthylation des chromosomes médiée par M.PvuII a déclenché le clivage des chromosomes par McrBC, qui a été suivi d'une dégradation des chromosomes. Ceci, à son tour, indique que l'inhibition de leur multiplication (figure 3a) est causée par la mort de l'hôte.

Entre parenthèses, nous avons remarqué une bande dérivant à la fois du mcrB - et mcrBC + souches au milieu du même gel et une autre espèce à la position la plus basse de la mcrBC + cellules (données non présentées). De leur mobilité, nous avons déduit que ces bandes représentent la forme circulaire excisée et la forme linéaire clivée de e14, un phage lambdoïde défectueux [44, 45]. Étant donné que e14 a un site PvuII, sa forme linéaire devrait apparaître après le clivage médié par McrBC [46]. Étant donné que les phages lambdoïdes ont une organisation génique [47-49] et une régulation [50] similaires, il ne serait pas très surprenant que l'expression génique du entrant conduise d'une manière ou d'une autre à l'expression de la fonction d'excision de e14.

Mort cellulaire médiée par McrBC et dégradation des chromosomes après induction de l'ADN méthyltransférase

Les deux séries d'expériences ci-dessus suggèrent fortement que McrBC médie l'inhibition de la propagation du gène de l'ADN méthyltransférase PvuII par clivage létal des chromosomes méthylés. Nous avons ensuite demandé si l'induction de la méthyltransférase PvuII conduit à la méthylation des chromosomes suivie de son clivage médié par McrBC et de la mort cellulaire. De plus, nous avons demandé si nous pouvions trouver une corrélation étroite entre ces trois processus : méthylation, clivage et mort.

Tout d'abord, nous avons cloné le pvuIIM gène en aval du promoteur BAD inductible par l'arabinose [51]. Nous avons préparé des souches hôtes pour cette expérience sur la base des travaux de Khlebnikov et al. [52]. Ces auteurs ont réussi à obtenir une expression homogène du promoteur BAD et ont obtenu une augmentation linéaire du niveau d'expression en réponse à la concentration d'arabinose en supprimant araBAD et araFGH opérons et en remplaçant le araE promoteur avec un promoteur constitutif [52]. Nous avons introduit ces mutations pour construire des isogéniques mcrBC +/- souches (BIK18260 et BIK18261 dans le tableau 2). À trois concentrations d'arabinose (0 %, 0,0002 % et 0,002 %), nous avons pu démontrer une corrélation entre la méthylation du génome, la rupture du génome et la mort cellulaire (figure 4) comme détaillé ci-dessous.

L'expression de la méthyltransférase PvuII provoque la méthylation des chromosomes et mcrBC-rupture chromosomique dépendante et mort cellulaire. (une) Confirmation de la méthylation des chromosomes. BIK18260 (mcrB1) cellules portant pEF24 (pvuIIM sous le promoteur pBAD, voir le tableau 1), ont été cultivés dans un bouillon LB sous sélection d'antibiotiques jusqu'à la phase mi-exponentielle, dilués à OD600 = 0,1, puis cultivés en présence de 0,002 % ou 0,002 % d'arabinose (ara) pour induire l'expression de M.PvuII. Aux intervalles de temps indiqués (en minutes), l'ADN chromosomique a été préparé, digéré avec l'endonucléase PvuII (TaKaRa Bio) et soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose en champ pulsé. M, échelle d'ADN. (b) ADN chromosomique dans BIK18261 (mcrBC + ) portant pEF24 après induction de PvuII méthyltransférase. (c) La fluorescence du bromure d'éthidium dans le puits a été mesurée pour les expériences en (b). (ré) Perte de viabilité cellulaire. Le nombre de cellules viables a été contrôlé en double dans deux expériences indépendantes. Chaque valeur a été divisée par la valeur au temps zéro. (e) Forme de la cellule. Les cellules ont été récupérées 60 minutes après addition d'une concentration plus élevée (0,002 %) d'arabinose. Ils ont été colorés au DAPI pour visualiser les nucléoïdes et ont été observés par microscopie à contraste de phase (à gauche) et à fluorescence (à droite). La barre d'échelle indique 10 m.

Les progrès de la méthylation du génome ont été mesurés, dans le mcrBC-souche négative, par résistance au clivage PvuII in vitro (Figure 4a). Le modèle de bande clivée montre que le taux de progression de la méthylation de l'ADN chromosomique après induction est en corrélation avec la concentration d'arabinose (figure 4a). La concentration plus faible (0,0002%) a entraîné un retard de méthylation d'environ 30 minutes par rapport à la concentration plus élevée (0,002%).

Nous avons également suivi la méthylation d'un seul site PvuII sur un plasmide multicopie (pEF60 dans le tableau 1) inclus dans la cellule. Les plasmides ont été extraits de cellules (BIK18260) hébergeant pEF60 et pEF24 (gène inductible M.PvuII) et digérés in vitro avec PvuII et HindIII, qui coupe pEF60 en un seul site. La quantification des bandes a montré que le site PvuII était complètement méthylé 30 minutes et 60 minutes après induction avec 0,002 % et 0,0002 % d'arabinose, respectivement (données non présentées). Le temps pour atteindre 50 % de méthylation était d'environ 13 minutes pour la concentration la plus élevée et d'environ 38 minutes pour la concentration la plus faible. Ils différaient de 25 minutes. Ainsi, la méthylation observée avec le plasmide s'accorde bien avec celle observée avec le chromosome.

Nous avons également observé un faible niveau de méthylation PvuII de pEF60 dans les conditions de répression : 4,1% et 4,3% dans une expérience et 5,3% et 6,0% dans une autre 5% correspond à 89 sites sur 1778 sites PvuII dans le chromosome de MG1655. Cela indique que la méthyltransférase PvuII est exprimée à un faible niveau en raison d'une légère fuite du promoteur BAD. Ceci est cohérent avec les rapports antérieurs sur ce promoteur [51, 53] et la difficulté de maintenir les gènes d'enzymes de restriction sous ce promoteur à l'état réprimé dans E. coli [54] (M Watanabe, F Khan, Y Furuta et I Kobayashi, observation non publiée).

L'induction de la méthyltransférase PvuII a en effet provoqué une rupture chromosomique immédiate détectée par électrophorèse en champ pulsé dans le mcrBC + déformation (Figure 4b) mais pas dans le mcrBC - souche (données non présentées). Avec la concentration d'arabinose plus élevée, d'énormes molécules d'ADN linéaires (au point médian entre le puits et le marqueur de 485 kb) sont devenues proéminentes 15 minutes après l'induction, puis elles semblaient se transformer progressivement en fragments plus petits. Avec la concentration d'arabinose plus faible, les énormes molécules d'ADN linéaires sont apparues 30 minutes après l'induction et se sont décomposées de la même manière. La cassure chromosomique observée était donc bien corrélée avec la progression de la méthylation dans le mcrBC - souche. La quantification des ADN dans le puits, qui représentent probablement des chromosomes relativement intacts, a révélé qu'ils diminuaient avec le temps après l'induction (figure 4c). Ces diminutions aux différentes concentrations d'arabinose étaient bien corrélées avec la progression de la méthylation dans le mcrBC - souche.

La rupture chromosomique s'accompagnait d'une diminution du nombre de cellules viables (unités formant colonie Figure 4d). La progression de la mort était à nouveau liée à la concentration en arabinose. L'induction plus forte a conduit à la mort cellulaire en 15 minutes, tandis que l'induction plus faible a permis le maintien de la viabilité pendant 30 minutes. De nombreuses cellules sont apparues sous forme de filaments avec plusieurs noyaux ou sans noyau (figure 4e). L'inhibition de la croissance cellulaire mesurée en DO a également été observée dans le mcrBC + cellules 1-2 h après induction (Figure 5a, en bas à gauche), mais pas à l'état réprimé (Figure 5a, en haut à gauche).

Effet de recA et recBC mutations sur la croissance cellulaire et les changements chromosomiques. (une) La croissance cellulaire. BIK18260 (mcrB1), BIK18261 (mcrBC + ), BIK18290 (mcrB1 recA), BIK18291 (mcrBC + recA), BIK18292 (mcrB1 recBC) et BIK18293 (mcrBC + recBC), portant pEF24 (pSC101 : :pvuIIM, voir le tableau 1), ont été cultivés dans un bouillon LB avec 0,2 % de glucose et des antibiotiques sélectifs jusqu'à la phase exponentielle, dilués à une DO600 = 0,1 et ensuite cultivés avec ou sans 0,0002 % d'arabinose. La DO600 a été contrôlée aux intervalles de temps indiqués après l'ajout d'arabinose. Chaque valeur a été divisée par la valeur au temps zéro. (b) Chromosomes dans les cellules non induites. BIK18261 (mcrBC + ), BIK18291 (mcrBC + recA) et BIK18293 (mcrBC + recBC), et leurs dérivés portant pEF24 (pSC101 : :pvuIIM) ont été cultivés dans un bouillon LB avec 0,2 % de glucose et des antibiotiques sélectifs jusqu'à la phase exponentielle. L'ADN chromosomique a été préparé et soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose en champ pulsé. M, échelle d'ADN. (c) Chromosomes après induction. ADN chromosomique dans BIK18261 (mcrBC + ), BIK18291 (mcrBC + recA) et BIK18293 (mcrBC + recBC), portant pEF24 (pSC101 : :pvuIIM) après induction de PvuII méthyltransférase avec 0,002 % ou 0,0002 % d'arabinose. Aux intervalles de temps indiqués après l'induction, l'ADN chromosomique a été préparé et soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose en champ pulsé. M1, échelle d'ADN M2, ADN coupé avec HindIII.

Ces résultats démontrent une corrélation entre la méthylation du génome, la rupture des chromosomes et la mort cellulaire lors de l'induction de la méthyltransférase PvuII. Ils suggèrent fortement que les sites chromosomiques méthylés par la PvuII méthyltransférase sont clivés par McrBC et que ce clivage conduit à la mort cellulaire.

Effet des mutations dans les gènes liés à l'ADN

Si les sites chromosomiques méthylés par la méthyltransférase PvuII sont clivés par McrBC et que ce clivage conduit à la mort cellulaire, des mutations des enzymes impliquées dans les processus liés à l'ADN pourraient affecter ces processus. Nous avons examiné la croissance cellulaire et les changements chromosomiques chez plusieurs mutants altérés dans le métabolisme de l'ADN de diverses manières.

L'enzyme RecBCD est impliquée dans la dégradation exonucléolytique de l'ADN à partir d'une cassure double brin et génère une extrémité d'ADN simple brin recombinogène [55]. Lorsqu'elle est liée à cet ADN simple brin généré par RecBCD ou d'autres enzymes, la protéine RecA initie l'appariement homologue pour la réparation par recombinaison. RecA lié à l'ADN simple brin induit également les gènes SOS par clivage de leur répresseur LexA [56]. Si RecA et RecBCD sont impliqués dans le traitement et la réparation de la rupture chromosomique induite par McrBC, leur élimination pourrait affecter la survie cellulaire et le traitement chromosomique.

L'élimination par mutation de la machinerie d'exonucléase/recombinase RecBCD/RecA de l'hôte a affecté la croissance non seulement à l'état induit, mais également à l'état réprimé (figure 5a). Une explication probable de l'état non induit est la méthylation des chromosomes par une légère expression de la PvuII méthyltansférase (voir ci-dessus). Nous avons analysé les chromosomes par électrophorèse sur gel en champ pulsé dans des paires de souches avec et sans le PMAUVAIS-pvuIIM plasmide dans le mcrBC + fond. Nos résultats illustrés à la figure 5b indiquent clairement une dégradation dépendante du plasmide (frottis) dans le recBC augmentation mutante et plasmidique d'énormes ADN linéaires (la bande épaisse au milieu entre le puits et le marqueur de 485 kb) dans le recA mutant. Ces résultats suggèrent fortement que la méthylation partielle des chromosomes a conduit à une rupture chromosomique médiée par McrBC et que la machinerie RecBCD/RecA répare cette rupture. Les défauts dans la réparation de la rupture chromosomique induite par McrBC sont probablement la cause du retard de croissance de la recA et recBC mutants (figure 5a).

Lorsque la méthyltransférase est induite, la réparation de la rupture médiée par RecBC/RecA retarde vraisemblablement l'arrêt de la croissance (figure 5a). Les recA ou recBC les mutations ont légèrement affecté la perte de viabilité cellulaire 30 minutes après l'induction de la méthyltransférase (tableau 3). Cependant, le niveau de viabilité final sur l'exposition du génome à la méthylation était similaire à celui de la rec + souche (données non présentées).

Les chromosomes de ces mutants ont montré des changements cohérents avec les schémas de croissance ci-dessus et leurs propriétés connues (figure 5c). Les recBC mutant a montré une grande quantité d'énormes chromosomes brisés à l'état non induit, ceux-ci sont restés abondants jusqu'à 60 minutes après l'induction. Dans la zone inférieure, qui correspond à des chromosomes brisés plus petits, de nombreuses bandes discrètes sont visibles dans le recBC mutant. Ceci est cohérent avec le processus dans lequel les chromosomes brisés par l'endonucléase McrBC ont été encore dégradés par l'exonucléase RecBCD. Les recA mutant, contrairement au rec +, a montré davantage d'énormes chromosomes cassés, même à l'état non induit. Dans le rec +, cette espèce n'est devenue proéminente que 15 minutes après l'induction et a disparu. Dans le recA mutant, il est resté abondant pendant 30 minutes mais a commencé à diminuer de 45 minutes après l'induction. La quantité de petits chromosomes brisés dans le recA la contrainte était inférieure à celle de la rec + souche, vraisemblablement due à la dégradation par l'enzyme RecBCD. Aucune bande discrète n'est visible dans le recA mutant, ce qui est cohérent avec une dégradation rapide et étendue de l'ADN par l'enzyme RecBCD. Des bandes discrètes sont visibles dans le rec + souche mais ils ne sont pas aussi nombreux que dans le recBC mutant.

Ces schémas d'électrophorèse sont cohérents avec les étapes de la rupture chromosomique induite par McrBC, de la dégradation exonucléolytique induite par RecBCD à partir de la rupture et de l'appariement homologue induit par RecA pour la réparation. La réparation médiée par RecBCD/RecA a également été trouvée pour la mise à mort post-ségrégationnelle par un système RM de type II [28]. À partir des résultats présentés dans la figure 5 et le tableau 3, nous avons déduit que la réparation par recombinaison médiée par RecBCD/RecA peut contrecarrer l'action létale de McrBC dans une certaine mesure à un faible niveau de méthylation. Cependant, leur réparation chromosomique semble incapable de contribuer à la survie des cellules lorsque la méthylation du génome et le clivage induit par McrBC deviennent importants. Ceci est similaire au clivage chromosomique par une enzyme EcoRI mutante [57, 58].

La fonction RecA/RecBCD est également impliquée dans la réponse SOS comme mentionné. La filamentation cellulaire n'a pas été observée dans un recA souche de délétion (données non présentées). Cela indique que la filamentation cellulaire que nous avons observée représente une réponse SOS. Afin d'évaluer les effets de la réponse SOS sur l'inhibition de la croissance médiée par McrBC et la mort cellulaire, nous avons examiné les mutants liés au SOS (figure 6 et tableau 3). Parmi ceux-ci, le lexA(Ind - ) mutant est défectueux dans l'induction SOS, le lexA(Def) mutant est constitutif pour l'induction SOS, et le muS le mutant présente moins de cassures d'ADN de fond sous certains fonds génétiques [59].

Effet des mutations liées au SOS sur la croissance cellulaire. BIK18262 (mcrB1 muS), BIK18264 (mcrBC + muS), BIK18271 (mcrB1 lexA(Ind - )), BIK18276 (mcrBC + lexA(Ind - )), BIK18278 (mcrB1 lexA(Déf.)), BIK18280 (mcrBC + lexA(Def)), portant pEF24 (pSC101 : :pvuIIM voir tableau 1), ont été cultivés dans un bouillon LB avec 0,2 % de glucose et des antibiotiques sélectifs jusqu'à la phase exponentielle, dilués à OD600 = 0,1 et ensuite cultivés avec ou sans 0,0002 % d'arabinose. La DO600 a été contrôlée aux intervalles de temps indiqués après l'ajout d'arabinose. Chaque valeur a été divisée par la valeur au temps zéro.

Ces mutants présentaient une inhibition de la croissance dépendante de McrBC lorsque M.PvuII était induit, mais pas à l'état réprimé (figure 6). Inhibition médiée par McrBC observée dans le lexA(Ind - ) mutant était plus fort que celui du rec + souche mais pas aussi fort que dans le recA souche (figure 5a). Une interprétation simple de ce résultat est que le défaut de réparation dans le recA- Le mutant négatif ne peut pas être entièrement attribué à l'absence de réponse SOS. En d'autres termes, RecA est susceptible de jouer un rôle direct, vraisemblablement, dans la réparation par recombinaison. Les lexA(Ind - ) a également montré une perte sévère de la viabilité cellulaire 30 minutes après l'induction (tableau 3). Les résultats avec lexA(Def) sont difficiles à interpréter car les lexA(Déf.) mcrB1 souche a montré une croissance lente. Il est connu que lexALa mutation (Def) retarde la croissance même dans le sulA-fond négatif [60]. Cet effet pourrait être exagéré avec la rupture chromosomique induite par McrBC lors de la méthylation du génome. Les muS mutant était indiscernable du rec + (muS + ) dans ces mesures. À partir de ces résultats, nous avons déduit que la réponse SOS et la recombinaison/réparation d'ADN médiée par RecA/RecBCD affectent toutes deux la mort/survie cellulaire lors de l'action de McrBC sur le génome méthylé. Les systèmes de réparation, cependant, ne peuvent pas bloquer la mort cellulaire lors d'une méthylation et d'un clivage étendus des chromosomes. Ces observations sont cohérentes avec notre hypothèse selon laquelle la méthylation des chromosomes conduit à son clivage létal médié par McrBC.

Généralité et spécificité de l'action de McrBC contre les ADN méthyltransférases

Afin d'étudier la généralité et la spécificité de la mort cellulaire induite par McrBC en ce qui concerne la spécificité de l'ADN méthyltransférase, nous avons exprimé McrBC dans une cellule portant l'une de plusieurs méthyltransférases avec des spécificités différentes. D'abord, mcrBC de E. coli a été placé sous le PMAUVAIS promoteur (pEF46 dans le tableau 1). Comme prévu, l'induction de McrBC dans une cellule abritant un autre plasmide codant pour M.PvuII (CAG m4 CTG) a conduit à la mort cellulaire dans le test de formation de colonies (figure 7). L'induction de McrBC a également conduit à la mort cellulaire avec M.SinI (GGW m5 CC) et M.MspI (m5 CCGG) (Figure 7) mais pas avec M.SsoII (C m5 CNGG) (données non présentées). Ces résultats sont cohérents avec la spécificité de séquence R m C de McrBC observée in vitro [33]. Notre interprétation est que McrBC a le potentiel d'agir comme un système de défense contre de nombreuses ADN méthyltransférases d'une spécificité appropriée.

Mort cellulaire médiée par McrBC avec des ADN méthyltransférases. Cellules (BIK18308) hébergeant pEF46 (PMAUVAIS-mcrBC voir Matériels et Méthodes) et pEF43 (M.PvuII), pSI4 (M.SinI), pNW106RM2-3 (M.MspI), ou pBAD30 (vecteur) ont été striés sur plaque de gélose LB contenant 30 g/ml de chloramphénicol et 25 g/ ml d'ampicilline et 0,2 % de glucose ou 0,2 % d'arabinose. Les plaques ont été incubées pendant une nuit à 37°C.

Les analyses évolutives moléculaires de McrB et McrC révèlent leur perte fréquente et leur transfert horizontal entre des génomes distants

Les résultats expérimentaux ci-dessus fournissent une réponse à la question que nous avons d'abord formulée. Il est très probable que McrBC clive les chromosomes de l'hôte et provoque la mort cellulaire lors de la méthylation du génome et que cette mort cellulaire inhibe la propagation du gène de la méthyltransférase (figure 1b). Il a également été démontré que McrBC restreignait sévèrement les bactériophages porteurs de C hydroxyméthylé à la place de C dans leurs génomes [34, 35, 61, 62]. Laquelle de ces actions de McrBC a fourni un avantage sélectif pour leur propagation et leur maintien au cours de l'évolution ?

Afin de répondre à cette question, nous nous sommes concentrés sur la similitude de McrBC avec les systèmes RM de type II dans l'action de tuer l'hôte par clivage chromosomique. Comme illustré sur la figure 1a, lorsqu'un complexe de gènes RM de type II est remplacé par un élément génétique concurrent, son enzyme de restriction produit clive les chromosomes de l'hôte dans lesquels la méthylation diminue et tue l'hôte (figure 1a) [22]. Cela conduit à la survie des cellules conservant le complexe du gène RM mais pas son concurrent. Le système McrBC peut également contribuer à l'exclusion des systèmes de méthylation épigénétique (Figure 1b). Un contraste entre eux est que l'action de McrBC suit un gain de méthylation, par opposition à une perte de méthylation.

Le potentiel de destruction de l'hôte par les systèmes RM de type II indique leur indépendance relative par rapport à l'hôte. Ils agissent comme une unité de sélection et, à cet égard, ils pourraient être similaires aux génomes viraux, aux transposons et à d'autres éléments mobiles égoïstes. En effet, il existe maintenant de nombreuses preuves de la mobilité des systèmes RM de type II [21]. Ceux-ci incluent des preuves évolutives moléculaires de leur transfert horizontal étendu entre des procaryotes éloignés, le transport par des éléments mobiles tels que les plasmides et la liaison avec des gènes liés à la mobilité. Probablement en raison de cette mobilité, en plus de la capacité de couper les ADN entrants et de lutter contre les éléments concurrents en tuant l'hôte, les systèmes RM de type II sont répandus dans tout Prokaryota. Ils sont souvent perdus d'un génome par diverses mutations [21]. Ils sont assez diversifiés dans la reconnaissance de séquence en raison de la sélection dépendante de la fréquence dans la défense contre les ADN entrants [63] et/ou en raison de la compétition mutuelle pour la séquence de reconnaissance dans la destruction de l'hôte [18]. Nous avons demandé si les homologues McrBC présentent des propriétés similaires. S'ils le font, nous pourrions le considérer comme une preuve soutenant l'hypothèse que les McrBC ont évolué pour leur capacité à tuer la cellule hôte en compétition avec les systèmes de méthylation du génome et à se comporter comme des éléments mobiles égoïstes.

Afin d'aborder ces points et d'évaluer les deux hypothèses ci-dessus pour McrBC, nous avons examiné son histoire évolutive. En utilisant la séquence de McrB et McrC de E. coli comme requêtes pour les recherches PSI-BLAST [64], nous avons identifié 199 systèmes homologues de type McrBC, comprenant typiquement des opérons avec un mcrB-like gène suivi d'un mcrC-like gène (voir aussi ci-dessous). Ces homologues du système McrBC sont largement répandus dans les bactéries et les archées (tableau S1 du fichier de données supplémentaires 1), comme par exemple les systèmes RM de type I ou de type II [17]. Si mcrBC les homologues montrent une distribution très étroite et ceci est en corrélation avec la distribution des phages avec l'hydroxyméthyl C, l'hypothèse de la défense des phages pourrait être favorisée. Nous abordons ces questions dans la discussion.

Les arbres phylogénétiques calculés à partir de plusieurs alignements de séquences McrB et McrC (Matériaux et méthodes) révèlent des topologies très similaires, suggérant une forte co-évolution de ces deux protéines (Figure S1 dans le fichier de données supplémentaires 2).Neuf branches supportées par bootstrap révèlent des relations entre les séquences de différents taxons, indiquant une très forte probabilité d'événements de transfert de gènes horizontaux distants, ce qui est également une caractéristique de l'évolution des systèmes RM de type II [15, 65]. Dans les cas susmentionnés, McrB et McrC semblent avoir connu un transfert horizontal conjoint.

Les mcrBC complexe de gènes dans E. coli K12 a été suggéré comme acquis récemment [61], ce qui est confirmé par notre analyse phylogénétique : McrB et McrC de E. coli K12 ne se trouvent pas dans une branche spécifique aux Protéobactéries (partie supérieure de l'arbre de la figure S1 dans le fichier de données supplémentaires 2), mais dans une branche qui comprend également Bactérie acidobactérie Blin 345 (l'homologue le plus proche de E. coli McrBC), Firmicutes et Actinobactéries. En général, les sous-unités McrBC de taxons tels que Proteobacteria, Actinobacteria ou Firmicutes forment de nombreuses branches entremêlées dans l'arbre, suggérant de multiples transferts de gènes horizontaux suivis d'une dissémination verticale parmi des espèces et des souches divergentes. Un exemple d'une branche d'enzymes fonctionnellement similaires provenant de taxons complètement différents est fourni par la famille de systèmes RM inhabituels de type II liés à McrBC (y compris LlaI [66], BsuMI [67], LlaJI [68] et leurs homologues expérimentalement non caractérisés) qui clivent l'ADN non méthylé et sont accompagnés d'une paire d'ADN méthyltransférases de type IIS pour se protéger contre le clivage de leur auto-ADN (sous-famille de type II R-like marquée sur la figure S1 dans le fichier de données supplémentaires 2).

Une autre caractéristique révélée par les arbres phylogénétiques est la présence de deux sous-familles fortement divergentes de systèmes de type McrBC, l'une comprenant des McrBC connus (par exemple, celui de E. coli K12) et des systèmes de type McrB (par exemple, les enzymes de type II susmentionnées), et l'autre comprenant uniquement des homologues de type McrBC non caractérisés de fonction inconnue, le composant de type McrC étant défini comme la famille de protéines non caractérisée DUF524. Il est intéressant de noter que les membres de ces deux sous-familles présentent une distribution phylogénétique presque parfaitement complémentaire, c'est-à-dire que, malgré leur présence dans des taxons similaires, ils ne coexistent pas dans un génome (tableau S2 dans le fichier de données supplémentaires 3 et tableau S1 dans le fichier de données supplémentaires 1), ce qui reflète probablement un certain degré de leur incompatibilité mutuelle.

Les quelques événements de transfert horizontal distant indiqués sur les arbres phylogénétiques ne correspondent qu'aux cas où un homologue McrB (et/ou McrC) d'un taxon se trouve enchâssé dans une branche comprenant un taxon différent (par exemple, Déinocoque dans Gammaproteobacteria) et où cette branche a un support d'amorçage >50%. Il s'agit d'une estimation très prudente des événements de transfert horizontal de gènes. Les arbres révèlent de nombreux autres cas de branches avec des taxons mixtes, mais leur support bootstrap est de <50%, indiquant un manque de support statistique pour la topologie locale de l'arbre. Lorsque nous avons comparé les arbres McrB et McrC avec les arbres d'ARNr 16S calculés pour le même ensemble d'espèces (Figure S2 dans le fichier de données supplémentaires 4), nous avons trouvé de nombreux désaccords dans les branches profondes et un accord uniquement dans les branches courtes qui relient des espèces étroitement apparentées. Cette analyse suggère que les systèmes McrBC ont été transmis horizontalement à de nombreuses reprises, mais bien sûr, ils ont également été hérités verticalement par des groupes d'organismes étroitement liés rayonnant à partir de leur ancêtre commun (par exemple, par des souches de la même espèce, telles que Streptococcus pneumoniae, Campylobacter jejuni, ou Yersinia pestis). Cependant, il est très difficile de quantifier le taux de transfert horizontal distant en analysant un arbre avec un support bootstrap très variable pour différents nœuds, nous avons donc eu recours à une stratégie indépendante.

Gojobori et ses collègues [69] ont publié une analyse de 116 génomes procaryotes complètement séquencés, dans laquelle ils ont calculé un indice de transfert horizontal distant potentiel pour tous les gènes, en comparant la fréquence des « mots » de longueur pentanucléotidique dans chaque gène avec la fréquence moyenne des mots. du génome entier. Nous avons obtenu un ensemble de données mis à jour pour 165 génomes du Dr Nakamura et du Dr Gojobori (communication personnelle). Parmi ces génomes, 29 contiennent à la fois des homologues McrB et McrC (D. radiodurans contient un homologue McrB supplémentaire). Nous avons analysé l'indice de transfert horizontal de tous les gènes codant pour les homologues McrB et McrC et avons constaté que 9 gènes homologues McrB (9/30 = 30%) et 10 gènes homologues McrC (10/29 = 35%) présentent des fréquences de mots qui indiquent probabilité significative de transfert horizontal de gènes à distance. Ainsi, dans l'échantillon de systèmes McrBC, pour lesquels des données sont disponibles, environ un tiers semble avoir été dérivé d'un récent événement de transfert horizontal de gènes d'un groupe éloigné. Pour le même ensemble de génomes, nous avons également réalisé l'analyse de l'indice de transfert horizontal de gènes de deux familles de protéines « housekeeping » de référence : RecA et RpoB. Nous n'avons trouvé aucun membre des gènes RecA ou RpoB dans cet échantillon à prédire comme récemment transféré.

Nous avons constaté que le complexe du gène McrBC a tendance à être perdu assez fréquemment, car aucun taxon d'ordre supérieur n'est trouvé dans lequel tous les génomes complètement séquencés possèdent ce système. Parmi 567 génomes complètement séquencés dans lesquels nous avons recherché des homologues McrB/C, nous avons trouvé McrB dans seulement 112 cas (19,8 %) et McrC dans 108 cas (19,0 %) McrB et McrC ont été trouvés ensemble dans 107 cas (18,9 %). Ainsi, nous concluons que les systèmes McrBC sont fréquemment transmis par transfert horizontal de gènes (en plus du transfert vertical régulier), mais sont également très fréquemment perdus. Cela va à l'encontre de l'hypothèse selon laquelle ils sont conservés uniquement en raison de leur utilité pour la défense contre les phages ou d'autres parasites et favorise l'hypothèse qu'ils se comportent comme des éléments mobiles égoïstes (qui tuent l'hôte).

L'analyse du voisinage génomique des systèmes McrBC suggère leur mobilité et leur lien avec les systèmes de méthylation du génome

Les complexes de gènes RM de type II se trouvent souvent sur des éléments mobiles tels que des plasmides, des phages, des intégrons et des îlots génomiques [21]. En accord, ils sont souvent liés à des gènes liés à la mobilité tels que des homologues de transposase et des homologues d'intégrase. Nous avons examiné les quartiers de mcrBC homologues s'attendant à trouver des gènes similaires.

L'analyse du voisinage génomique (tableau S2 dans le fichier de données supplémentaires 3, voir le tableau S1 dans le fichier de données supplémentaires 1 pour l'ensemble de données complet) a révélé que McrB et McrC sont étroitement liés l'un à l'autre, suggérant leur structure comme un seul opéron. Ils sont fréquemment associés à des homologues d'intégrases et de transposases (tableau S2 du fichier de données complémentaires 3 et tableau S1 du fichier de données complémentaires 1). Plusieurs homologues de McrBC apparaissent clairement sous forme d'insert dans un complexe de gènes RM (figure 8). De plus, huit systèmes de type McrBC ont été trouvés sur un plasmide (tableau S1 dans le fichier de données supplémentaires 1). Ces trois sources de données indiquent une mobilité potentielle des mcrBC unité. Les mcrBC les homologues étaient souvent liés à des systèmes RM ou simplement à des ADN méthyltransférases (tableau S2 dans le fichier de données supplémentaires 3), comme indiqué pour la première fois pour E. coli [70]. L'implication de cette découverte est discutée ci-dessous.

mcrBC-comme des homologues apparemment insérés dans un complexe de gènes RM. Les noms de cadres de lecture ouverts indiquent des noms d'enzymes (REBASE) ou des balises de locus (GenBank).

Certains génomes, comme le Déinocoque radiodurans génome R1, contiennent deux mcrBC homologues, parfois l'un sur un plasmide et l'autre dans le chromosome. L'alignement de ces paires d'homologues McrB trouvés dans le même génome a révélé que leurs séquences d'acides aminés varient souvent dans la région amino-terminale, qui est impliquée dans la liaison à l'ADN [46], suggérant des changements évolutifs dans la spécificité de la séquence d'ADN (Figure 9). Ceci est parallèle à la diversité de la reconnaissance de séquence des enzymes de restriction et de modification de type II.

Comparaison dot-plot de l'intragénomique mcrB paralogues. Séquences d'acides aminés d'une paire de mcrB paralogues au sein d'un génome ont été tracés les uns contre les autres.

Pour étudier la relation entre la diversité de la région amino-terminale de McrB et la reconnaissance de séquence, plusieurs homologues de McrBC, STOMcrBC (NP_377078.1) et STOMcrBC2 (NP_377080.1) de Sulforobus tokodaii str. 7, TKOMcrBC (YP_183208.1) et TKOMcrBC2 (YP_183422.1) de Thermococcus kodakaraensis KOD1 et DraMcrBC (NP_051672.1) de D. radiodurans R1, ont été amplifiés à partir de l'ADN du génome et clonés dans pBAD30 [51]. Ces mcrBC homologues n'ont pas causé la mort cellulaire dans E. coli à 37°C en présence d'arabinose dans une cellule hébergeant l'un des quatre gènes de l'ADN méthyltransférase, M.PvuII (CAG m4 CTG), M.SinI (GGW m5 CC), M.MspI ( m5 CCGG), ou M. SsoII (C m5 CWGG) (données non présentées). EcoKMcrBC de E. coli causé la mort cellulaire détectant la méthylation du génome par M.SinI (GGW m5 CC) et M.MspI (m5 CCGG) dans les mêmes conditions (Figure 7). Par conséquent, nous n'avons pas pu lier ces homologues à la biologie des organismes.


Développement de nouvelles réactions radicalaires avec un groupe vinylsilyle et leur application à la synthèse de nucléosides de sucre à chaîne ramifiée

3.2.1 Stabilité thermique

La stabilité thermique des duplex formés par ces ODN et l'ADN-10 ou l'ARN-11 complémentaire a été étudiée par dénaturation thermique dans un tampon de phosphate de sodium 0,01 M (pH 7,0) contenant 0,01 M ou 0,1 M de NaCl. Températures de fusion (Tms) sont répertoriés dans le tableau 3 avec l'ADN-10 comme brin complémentaire. Tous les ODN contenant 44, 45 ou 47 ont stabilisé les duplex ODN/ADN. Les duplex sont devenus plus stables à mesure que le nombre de 44,45 ou 47 augmentait. Les Tm les valeurs pour les ODN contenant cinq résidus de 44, 45 ou 47 étaient respectivement de +4,5, +5,7 ou +4,1 °C. Les ODN contenant un ou deux résidus de 48 déstabilisaient les duplex, alors que les ODN contenant trois, quatre ou cinq résidus de 48 stabilisaient les duplex. Les Tm la valeur pour les ODN contenant cinq résidus de 48 était de +2,4 °C. Les Tm la valeur des ODN contenant 45 était supérieure à celle des ODN contenant les mêmes nombres de 44 ou 47 sauf pour les ODN-3P et 7P. De plus, le Tm valeur pour l'ODN-15 avec une séquence mixte, qui a cinq résidus de 45, était de +6,8 °C. Par conséquent, les analogues contenant 45 semblaient stabiliser efficacement les duplex ODN/ADN.

Tableau 3 . Données d'hybridation.

ODNODN/ADN a ODN/ARNb
0,01 M NaCl Tm(°C)Tm c (°C)0,1 M de NaCl Tm(°C)Tm c (°C)
154.5-73.9-
2 ans54.4+0.073.9+0.0
3 ans54.4+0.073.7-0.2
4 ans54.5+0.173.3-0.6
5 ans54.4+1.072.9-1.0
6 ans56.8+2.473.0-0.9
7A57.5+3.172.3-1.6
8 ans58.9+4.571.7-2.2
2E55.0+0.673.7-0.2
3E54.5+0.173.8-0.1
4E55.5+1.173.5-0.4
5E55.7+1.372.1-1.8
6E56.9+2.572.3-1.6
7E58.1+3.771.5-2.4
8E60.1+5.771.2-2.7
2P54.4+0.073.3-0.6
3P54.6+0.273.4-0.5
4P55.1+0.773.1-0.8
5P55.6+1.272.5-1.4
6P56.4+2.072.5-1.4
7P58.3+3.972.0-1.9
8P58.5+4.171.2-2.7
2Z52.1-2.373.2-0.7
3Z52.7-1.773.5-0.4
4Z50.8-3.672.8-1.1
5Z53.9-0.572.3-1.6
6Z54.9+0.572.6-1.3
7Z55.6+1.271.8-2.1
8Z56.8+2.471.4-2.5
948.3-6.1--
1242.3-49.8
1549.1+6.849.4-0.4

En revanche, l'ODN-9 contenant cinq résidus de 46, qui possède un groupement acétamidoéthyle, a déstabilisé le duplex ODN/ADN par rapport au duplex témoin (Tm = -6,1 °C). Ainsi, la stabilité thermique améliorée des duplex contenant 45 était probablement due à l'effet de l'ion ammonium terminal.

Lorsque l'ARN-11 a été utilisé comme brin complémentaire, tous les ODN contenant 44, 45, 47 ou 48 ont légèrement déstabilisé les duplex ODN/ARN. Les duplex sont devenus moins stables à mesure que le nombre de nucléosides modifiés augmentait. Cependant, même lorsque cinq résidus de 44, 45, 47 ou 48 ont été incorporés dans les 18-mères, le Tm les valeurs de ces ODN étaient respectivement de -2,2, -2,7, -2,7 et -2,5 °C. LeTm la valeur pour l'ODN-15 n'était que de -0,4 °C. Par conséquent, les duplex ADN/ARN formés par les ODN contenant 44, 45, 47 ou 48 sont suffisamment stables pour être utilisés dans des études antisens.


Voir la vidéo: Biologie - Enzyme und Hemmung (Juillet 2022).


Commentaires:

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