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Améliorer mon protocole de préparation de cellules et de choc thermique compatible avec le CaCl2 et le bricolage

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J'ai travaillé sur le développement d'un protocole de compétence en calcium et de choc thermique pour E. coli et j'ai obtenu des résultats mitigés. Je suis à la recherche d'idées sur la façon de potentiellement dépanner et améliorer mes taux de transformation.

J'ai essayé de nombreuses permutations du protocole ci-dessous, mais je ne parviens pas à définir un protocole qui donne des résultats cohérents.

Voici les limitations avec lesquelles je travaille dans mon environnement de bricolage :

  • Pas d'accès au congélateur -80c. La plupart des protocoles exigent la préparation d'un grand lot de cellules au début, puis l'utilisation d'aliquotes congelées dans leurs transformations. Pour m'adapter, je prépare des cellules compétentes en petite quantité, puis je fais un choc thermique immédiatement après.
  • Pas de support spécial (en utilisant uniquement LB pour la récupération)
  • N'avoir qu'une microcentrifugeuse max 7k rpm, non réfrigérée
  • Concentration d'ADN inconnue (en utilisant des minipréparations fraîches conservées congelées à -20c entre les utilisations)
  • Utilisation d'un incubateur de bricolage sans agitateur (la température oscille à 32-34c)
  • Utilisation de dh5α avec des plasmides d'une taille comprise entre 5kb et 9kb

Voici mon protocole général de préparation des compétences cellulaires et de choc thermique:

  1. Strie une plaque avec dh5α, incuber pendant 24-30 heures
  2. Ajouter 300 ul de CaCl2 100 mM glacé au tube epp de 1,5 ml prérefroidi
  3. Ajouter 1-2 boucles d'E. coli de la plaque au tube
  4. Garder sur la glace pendant 30 minutes
  5. Ajoutez 1-2ul de plasmide miniprep et effleurez doucement
  6. Glace pendant 10 minutes
  7. Mettez les tubes dans un bain-marie à 42c pendant 30 secondes avec un mouvement doux
  8. Mettre immédiatement sur la glace pendant 2 minutes
  9. Ajouter 400ul de LB à température ambiante
  10. Incuber pendant 45 minutes
  11. Plaque 130ul à plaque antibiotique, 50ul à contrôler

Dans mes tests, je reçois peu ou pas de transformations. C'est aléatoire. Mes contrôles montrent que je ne tue pas mes cellules après la procédure.

J'ai également essayé de préparer des tubes de 1,5 ml de culture liquide incubés pendant 6 heures plutôt que d'utiliser une colonie sur une plaque pour mes cellules et cela semble aider à améliorer les taux ; Cependant, la méthode de colonie ci-dessus a fonctionné plusieurs fois et est généralement plus facile/plus rapide.

Un autre problème que j'ai rencontré est que lorsque j'utilise une boucle pour transférer les colonies vers le CaCl2, il peut être difficile de briser les touffes sans être trop agressif. J'ai essayé de pipeter et de sortir de la boucle pour obtenir une solution semi-homogène.

Est-ce que j'utilise les bons ratios CaCl2/cellules/ADN ? Y a-t-il quelque chose ici que je pourrais améliorer ou dépanner ?

*Modifier * Le protocole ci-dessus est une adaptation des sources suivantes : https://lchenlab.sitehost.iu.edu/protocol_files/preparing_competent_cells.htm https://cmbe.engr.uga.edu/protocols/CaCl2%20Competent%20Cells .pdf http://mcb.berkeley.edu/labs/krantz/protocols/calcium_comp_cells.pdf


Comment les cellules compétentes fabriquent-elles du CaCl2 ?

Cellules compétentes. E. coli cellules sont plus susceptibles d'incorporer de l'ADN étranger si leur cellule les murs sont modifiés pour que l'ADN puisse passer plus facilement. Tel cellules sont dits "compétent." Cellules sommes rendu compétent par un procédé qui utilise du chlorure de calcium et un choc thermique.

On peut aussi se demander : pouvez-vous autoclaver le cacl2 ? Toutes les réponses (9) aurait seulement précipiter si il a formé le carbonate. Ce peut faire ceci dans l'eau qui a absorbé le dioxyde de carbone de l'air. Cette aurait être chassé pendant autoclavage, mais pas par filtrage. Vous pouvez autoclaver CaCl2, car les produits possibles Ca(OH)2 et CaCO3 réagir avec HCl pour former CaCl2.

On lui a également demandé quel était le rôle du chlorure de calcium dans cette expérience ?

L'anhydre chlorure de calcium tube est placé entre le réacteur et l'atmosphère. Ceci afin d'éviter que de l'humidité ne pénètre dans le récipient de réaction.

Comment le choc thermique rend les cellules compétentes ?

En laboratoire, les bactéries cellules peut être rendu compétent et l'ADN introduit par la suite par une procédure appelée choc thermique méthode. Une augmentation soudaine de la température crée des pores dans la membrane plasmique de la bactérie et permet à l'ADN plasmidique de pénétrer dans la bactérie. cellule.


Préparation des cellules compétentes

Jour 2 1. Utilisez une anse d'ensemencement stérile pour collecter les cellules d'une seule colonie et inoculer 50 ml de LBM 1X stérile Grow à 37 degrés C pendant la nuit (16-20 heures) dans un incubateur à agitateur. Placer également 2 flacons de 250 ml 1X LBM dans l'incubateur pour équilibrer la température du milieu.

  1. Ajouter 25 ml de la culture d'une nuit dans chaque flacon LBM de 250 ml. Placer une autre fiole de 150 ml 1X LBM dans l'incubateur pour équilibrer la température du milieu. Cultivez les cultures jusqu'à OD650 = O.2. (pas dense environ 3 heures). Ajouter 75 ml de LBM 1X équilibré dans chaque flacon et poursuivre l'incubation pendant 30 minutes.
  2. Pellet les cellules dans de grandes bouteilles de centrifugation autoclavées réfrigérées à l'aide de la centrifugeuse Beckman J-6 et du rotor JA 10 (doit être froid!) À 5000 rpm pendant 10 minutes. Les remises en suspension ultérieures peuvent être effectuées dans le même flacon. Les cellules doivent rester froides pour le reste de la procédure : Transporter les tubes sur glace et remettre en suspension sur glace dans la chambre froide.
  3. Décanter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1/4 du volume d'origine (87,5 ml) de MgCl2 100 mM glacé. Tenir sur de la glace pendant 5 minutes. Transférer les cellules dans de grandes bouteilles de centrifugation stériles pré-réfrigérées. Faites tourner dans la centrifugeuse Beckman J-6 pendant 10 minutes en utilisant le rotor JA-20 4000 tr/min à 4 degrés C.
  4. Décanter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 1/20 du volume d'origine (17,5 ml) de CaCl2 100 mM glacé. Tenir sur de la glace pendant 20 minutes. Pellet comme ci-dessus 4000 rpm pendant 10 minutes.
  5. Décanter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 1/100 du volume d'origine (3,5 ml) d'une solution à 85 % v/v 100 mM CaCl2 et 15 % v/v de glycérol (100 %). Pour chaque culture traitée, refroidir environ 15 tubes Eppendorf étiquetés dans un bain de glace sèche-EtOH. Pipeter 300 ul de cellules dans chaque tube et placer immédiatement dans le bain de glace sèche-EtOH. Transférer les aliquotes de cellules compétentes congelées à -80 degrés C.
  6. Après que les cellules compétentes aient été stockées pendant 24 heures, vérifiez l'efficacité de la transformation : utilisez 1 ng 10 ng et 100 ng de tout plasmide résistant à l'ampicilline sur des plaques LBM + Amp selon le protocole de transformation pour les plasmides intacts. Vérifiez le niveau de fond en étalant 50 ul de cellules seules sur une plaque LBM + Amp. Attendez-vous à des rendements d'environ 5x10e7 colonies par ug d'ADN superenroulé.

Solutions:

  1. 100 mM de MgCl2 :
    • Dilution 1:10 du stock de laboratoire utiliser des ingrédients stériles ou un filtre
    • stériliser
  2. 100 mM de CaCl2 :
    • Dilution 1:10 du stock de laboratoire utiliser des ingrédients stériles ou un filtre
    • stériliser
  3. 85 % 100 mM de CaCl2, 15 % de glycérol :
    • 42,5 ml 100 mM de CaCl2
    • 7,5 ml 100% glycérol
    • 50,0 ml de volume total bien mélanger et utiliser des ingrédients stériles ou filtrer stériliser

Précautions:

L'ADN plasmidique/cosmidique doit être considéré comme un risque biologique et les déchets doivent être éliminés de manière appropriée.


Résultats

Effet du décalage de température sur les cellules électrocompétentes

Il n'était pas pratique de maintenir des conditions de basse température pour la préparation, le stockage et le transport des cellules électrocompétentes. Nous avions l'intention de tester l'efficacité de transformation des cellules électrocompétentes préparées à température ambiante. Un grand plasmide pGB-amp-Ptet-plu1880 (27,8 kb) a été transformé en E. coli GB2005 souche 17,24 à différentes températures. Les cellules électrocompétentes chaudes ont montré une efficacité de transformation 10 fois plus élevée que les cellules électrocompétentes froides (Fig. 1a). Après avoir placé les cellules électrocompétentes froides à température ambiante pendant 15 minutes, l'efficacité de transformation a été multipliée par 5 (Fig. S1a). En revanche, après que les cellules électrocompétentes à température ambiante aient été placées sur de la glace pendant 15 minutes avant l'électroporation, il y avait une diminution significative de l'efficacité de transformation (Fig. S1b).

(une) Effet de la température, E. coli Cellules GB2005 transformées par

0,1 µg de pGB-amp-Ptet-plu1880 (27,8 kb) ont été étalés sur des plaques Amp. 1, la méthode normale glaciale pour préparer les cellules électrocompétentes 2, comme pour 1 mais les cellules ont été conservées sur la glace pendant 15 min avant l'électroporation 3, comme pour 1 mais les cellules ont été placées à température ambiante (RT) pendant 15 min avant l'électroporation tous les cuvettes ont été utilisées à TA 4, chaque étape a été effectuée à TA 5, pas d'ADN plasmidique. (b) Les cellules préparées par RT ont été transformées avec différents plasmides. 1, origine pBR322 avec résistance à l'ampicilline (27,8 kb) 2, origine p15A avec résistance au chloramphénicol (54,7 kb) 3, origine p15A avec résistance à l'ampicilline (54,7 kb) 4, BAC avec résistance au chloramphénicol (>120 kb) 5, BAC avec résistance à la kanamycine ( 91,7 kb) 6, BAC avec résistance à l'ampicilline (91,7 kb). (c) Différent E. coli souches testées pour la transformation par électroporation. Les cellules ont été transformées par 0,1 ug de pGB-amp-Ptet-plu1880 et étalées sur des plaques Amp. Barres d'erreur, SD n = 3.

La température ambiante dans notre laboratoire a été fixée à 24 °C. Pour déterminer la plage de température optimale pour la préparation de cellules compétentes, nous avons préparé les cellules à différentes plages de température et révélé que la meilleure température pour la préparation de cellules électrocompétentes se situait entre 24 et 28 °C (Fig. S2).

Effet de différents plasmides sur les cellules électrocompétentes

Les plasmides variaient en termes de taille, de marqueur de sélection et d'origine de réplication. Initialement, nous avons testé trois plasmides de tailles différentes. Deux d'entre eux étaient des plasmides d'origine p15A avec une résistance à l'ampicilline (amp) ou au chloramphénicol (cm). Un autre était un plasmide basé sur l'origine pBR322 avec une résistance à l'ampicilline. Tous les plasmides ont obtenu une efficacité de transformation plus élevée avec des cellules électrocompétentes à température ambiante (Fig. 1b, colonne 1-3). Nous avons également testé des vecteurs BAC avec différentes tailles et marqueurs de sélection. Tous les BAC ont gagné en efficacité de transformation lorsqu'ils sont électrocompétents à température ambiante E. coli Des cellules GB2005 ont été utilisées (Fig. 1b, colonne 4-6). Ces résultats ont indiqué que pour la transformation électrocompétente, les cellules électrocompétentes à température ambiante étaient plus efficaces que les cellules électrocompétentes froides quels que soient leur taille, leur marqueur de sélection et leurs origines de réplication. Par conséquent, les cellules électrocompétentes à température ambiante pourraient être de meilleures candidates pour le clonage de gènes, la construction de bibliothèques d'ADN et la mutagenèse que les cellules électrocompétentes à froid.

Effet de différentes souches sur les cellules électrocompétentes

Les E. coli GB2005 était une souche optimisée pour la transformation et la propagation des plasmides 17,25. Avec cette souche, plusieurs autres couramment utilisés E. coli les souches ont également été testées pour la transformation à température ambiante. Les résultats ont révélé que, bien que différents E. coli les souches variaient dans leurs efficacités de transformation relatives, toutes présentaient une efficacité de transformation plus élevée lorsque leurs cellules électrocompétentes étaient préparées à température ambiante (Fig. 1c). Nous avons également testé l'approche d'amélioration dans quelques autres souches bactériennes Gram-négatives. Burkholderia glumae PG1 était une souche industrielle pour la production de lipidase détergente 26, qui pourrait également être l'hôte hétérologue utilisé pour l'expression des groupes de gènes PKS/NRPS (données non publiées). Un plasmide d'origine oriV pRK2-apra-kan basé sur le plasmide pBC301 27,28, a été utilisé pour la transformation. Lorsque les cellules compétentes PG1 ont été préparées à température ambiante, l'efficacité d'électroporation de RK2 plasmide était environ trois fois plus élevé que les cellules préparées sur glace (Fig. S3a). D'autres souches bactériennes à Gram négatif, telles que Agrobactérie 22 , Burkholderia 13 , Photorhabdus 23 et Xénorhabdus 23 , ont été testés pour RK2 transformation de plasmide en utilisant des protocoles à température ambiante et à température froide. Tous les résultats ont indiqué que les cellules compétentes à température ambiante avaient une efficacité de transformation plus élevée que les cellules compétentes froides (Fig. S3b).

Amélioration du recombineering en utilisant des cellules électrocompétentes à température ambiante

L'efficacité de transformation du plasmide significativement augmentée par les cellules électrocompétentes à température ambiante n'était pas la destination. Il était nécessaire d'évaluer l'amélioration du protocole à température ambiante sur le recombineering médié par lambda Red ou Rac RecET. Un test simple utilisant un produit PCR de vecteur linéaire (p15A ori plus cm ou pBR322 ori plus cm) et un produit PCR avec de la kanamycine (kan) a été construit pour tester l'efficacité LLHR 17. E. coli souche GB05-dir avec recET sur son chromosome a été utilisé pour le test LLHR 25 . Les résultats ont montré que la LLHR dans les cellules compétentes à température ambiante était 6 à 10 fois plus efficace que les cellules préparées sur glace. Les plasmides d'origine p15A et d'origine pBR322 ont tous deux obtenu le même facteur d'augmentation (figures 2a, b). Une expérience de clonage direct pour repêcher le groupe de gènes de la thailandepsine (

39 ko) de Burkholderia thailandensis avait été réalisée, environ 150 colonies ont été obtenues en utilisant des cellules électrocompétentes froides, mais en utilisant des cellules électrocompétentes à température ambiante, plus de 600 colonies ont été obtenues. Cette amélioration conduit à une plus grande chance de cloner directement de gros fragments d'ADN à partir de pools d'ADN génomique.

(une) Numéro de colonie d'un test LLHR standard 17 dans GB05-dir de la méthode normale et froide dans E. coli. (b) Comme pour A, mais d'origine pBR322. (c) Comme pour A, mais avec un test LCHR standard en GB05-rouge. () Les cellules électrocompétentes ont d'abord été préparées sur glace. Après avoir ajouté la cassette kan du produit PCR dans les cellules électrocompétentes glacées, les cellules plus le mélange d'ADN ont été transférés à température ambiante pendant 3 minutes avant l'électroporation (colonne du milieu). CT, température froide RT, température ambiante. Barres d'erreur, SD n = 3.

Le clonage par PCR est un exercice de routine dans tous les laboratoires de biologie moléculaire 20 . Il est donc de notre intérêt de trouver un moyen simple et peu coûteux de cloner des produits PCR. Étant donné que les cellules électrocompétentes préparées à température ambiante améliorent l'efficacité de la LLHR d'environ 10 fois, il est essentiel de connaître les séquences d'homologie minimales nécessaires pour la LLHR. Auparavant, nous avons identifié 20 pb comme la longueur minimale d'homologie de séquence requise pour recombineering 29,30. Pour tester si la longueur minimale pouvait être encore raccourcie, le vecteur pBAD24 a été digéré avec EcoR I/Hind III comme récepteur linéaire, et la cassette de produit PCR (Tn5-neo) flanquée de bras d'homologie courts aux extrémités du vecteur pBAD24 digéré a été utilisée comme linéaire fragment donneur (Fig. S4). Sept produits PCR avec différentes tailles de bras d'homologie (HA) ont été conçus pour tester l'efficacité de la LLHR. Les résultats ont révélé que seulement 8 pb d'homologie terminale étaient suffisantes via le protocole à température ambiante (Fig. S5). Lorsque des cellules glacées ont été utilisées, les bras d'homologie minimum requis pour la recombinaison ont été trouvés de 12 pb. Ces données ont indiqué que la LLHR pourrait être utilisée pour générer un kit pour le clonage de produits PCR ou de petits fragments d'ADN en utilisant des bras d'homologie aussi courts que 8 pb.

Contrairement à l'expérience LLHR, l'efficacité LCHR n'augmentait pas dans le protocole à température ambiante par rapport au protocole froid (Fig. 2c). Cependant, nous avons découvert que l'efficacité de la LCHR serait considérablement augmentée lorsque des cellules électrocompétentes fraîchement préparées étaient placées à température ambiante pendant 3 minutes (Fig. 2d), suggérant que le gonflement transitoire des cellules avait un effet bénéfique.

Stabilité des cellules électrocompétentes à température ambiante

Normalement, après 2,5 à 3,0 heures de culture à 37 °C, E. coli GB2005 atteint OD600 0,4-0,6 qui était dans la phase logarithmique, la période avec la meilleure efficacité de transformation des cellules. Lorsque les cellules bactériennes étaient envahies par la croissance, l'efficacité de transformation diminuait (Fig. S6a) et l'efficacité de transformation des cellules électrocompétentes froides était complètement perdue après 4 heures ou 6 heures (seulement 18 et 5 colonies respectivement) (Fig. S6a). Mais les cellules électrocompétentes à température ambiante conservaient toujours une efficacité relativement élevée même après 4 ou 6 heures de culture. E. coli GB2005 cultivé pendant 4 heures à 37 °C atteint OD600 1.0

1.2 et cultivé pendant 6 heures atteint OD600 > 1,8 qui était à la phase de plateau. Il était à noter que des cellules bactériennes sur-grandies ou même cultivées pendant la nuit pouvaient encore être utilisées pour la transformation lorsqu'un protocole à température ambiante était utilisé pour préparer des cellules compétentes.

Pour prédigérer le processus de transformation, nous avions testé si l'étape de récupération pouvait être omise. Pour la transformation plasmidique simple, l'étape de récupération pourrait être omise lorsque les cellules électrocompétentes ont été préparées en utilisant le protocole à température ambiante (Fig. S6b). Bien que l'efficacité de transformation dans le groupe à température ambiante sans récupération était d'environ 30% inférieure à celle du groupe à température ambiante de récupération, elle était toujours au moins 5 fois supérieure à celle du groupe à température froide, récupération ou non. Les résultats suggèrent que la transformation du plasmide ou de la ligature pourrait être effectuée en quelques minutes après l'électroporation en utilisant des cellules compétentes à température ambiante. Les résultats précédents ont conclu que les cellules électrocompétentes à température ambiante avaient une efficacité de transformation bien meilleure que les cellules électrocompétentes froides. De plus, nous voulions savoir combien de temps les cellules compétentes pouvaient rester à température ambiante sans perte significative d'efficacité de transformation. Les résultats ont montré que les cellules compétentes à température ambiante perdaient environ 30 % d'efficacité après 1 heure de stockage à température ambiante, environ 60 % perdues après 4 heures et environ 80 % perdues après un jour (Fig. S7). Ces résultats ont indiqué que les cellules compétentes à température ambiante perdaient leur efficacité de transformation au maximum lorsqu'elles étaient stockées à température ambiante plus d'une journée. Pour éviter cette perte d'efficacité, des cellules compétentes à température ambiante ont été préparées en utilisant 10 % de glycérol 11 et séchées sous vide et stockées à 4 °C jusqu'à trois jours. Le résultat a montré que les cellules compétentes à température ambiante séchées préparées dans 10 % de glycérol perdaient leur efficacité de 55 % par rapport aux cellules compétentes à température ambiante sans séchage (tableau S2). Mais il est intéressant de noter que les cellules compétentes séchées préparées dans 10 % de glycérol pourraient maintenir l'efficacité LLHR jusqu'à 3 jours sans aucune perte d'efficacité supplémentaire (tableau S3). Cette capacité nous donne l'opportunité à l'avenir de fournir les cellules compétentes dans un pack de refroidissement de routine, ce qui est plus facile et rentable.

Analyse par microscopie électronique de cellules compétentes

Pour trouver les raisons d'une plus grande efficacité dans le protocole à température ambiante, la microscopie électronique a été utilisée pour une analyse comparative des formes morphologiques des cellules compétentes froides et des cellules compétentes à température ambiante de E. coli. Leur analyse comparative a montré que les cellules compétentes froides semblaient rétrécir plus que les cellules à température ambiante et que la surface des cellules compétentes à température ambiante était plus lisse (Fig 3a-d). Les cellules rétrécies pourraient être plus difficiles à transformer, et la membrane et la paroi cellulaires bactériennes pourraient être plus perméables à l'entrée d'ADN étranger à une température plus élevée. De plus, il peut être difficile pour les cellules rétrécies de former des pores qui permettent le transfert d'ADN à travers la membrane cellulaire dans des conditions d'électroporation, et après l'électroporation, la plupart des cellules compétentes froides se sont avérées lysées. (Fig. 3e,f). À partir de là, nous supposons que la membrane cellulaire/paroi cellulaire bactérienne pourrait avoir une meilleure perméabilité aux matières étrangères pour entrer dans la cellule.

(une) : micrographie des cellules lavées avec des protocoles à froid et à température ambiante avec différents grossissements. (eF) : micrographie du mélange de cellules électroporées avec ADN d'insertion épisomique.


Transformation de l'ADN plasmidique en E. coli à l'aide de la méthode du choc thermique

La transformation de l'ADN plasmidique en E. coli par la méthode du choc thermique est une technique de base de la biologie moléculaire. Elle consiste à insérer un plasmide étranger ou un produit de ligature dans des bactéries. Ce protocole vidéo décrit la méthode traditionnelle de transformation utilisant des bactéries chimiquement compétentes disponibles dans le commerce de Genlantis. Après une courte incubation dans la glace, un mélange de bactéries chimiquement compétentes et d'ADN est placé à 42°C pendant 45 secondes (choc thermique) puis replacé dans la glace. Le milieu SOC est ajouté et les cellules transformées sont incubées à 37 ° C pendant 30 min sous agitation. Pour être assuré d'isoler les colonies quelle que soit l'efficacité de la transformation, deux quantités de bactéries transformées sont étalées. Ce protocole traditionnel peut être utilisé avec succès pour transformer la plupart des bactéries compétentes disponibles dans le commerce. Les turbocellules de Genlantis peuvent également être utilisées dans un nouveau protocole de transformation de 3 minutes, décrit dans le manuel d'instructions.


Comment l'antibiotique kanamycine tue-t-il les cellules ?

Kanamycine (et ses parents dans la famille des aminosides antibiotiques) se lient directement à l'ARN ribosomique et à la fois inhibent l'initiation de la traduction et induisent des erreurs dans l'incorporation des acides aminés.

Qu'est-ce qui augmente l'efficacité de la transformation ?

Les bactéries Gram-positives ont des parois cellulaires plus épaisses qui se colorent en positif —, ce qui signifie qu'elles retiennent le colorant — pour la coloration de Gram. Les bactéries à Gram positif produisent un facteur de compétence qui rend leurs voisins plus compétents, qui augmente les efficacité de transformation de toute la colonie.

Comment appelle-t-on communément le chlorure de calcium ?

Le CaCl2 le nom composé est chlorure de calcium. Comme le sel de table, c'est un cristal blanc à température ambiante, mais il a des propriétés qui le distinguent clairement. Commun Utilisations de Chlorure de calcium. Crédit : Nomad/E+/GettyImages. Chlorure de calcium peut être obtenu par raffinage de carbonate de sodium, de saumure naturelle ou de calcaire.

La transformation bactérienne se produit-elle dans la nature ?

Transformation entraîne l'altération génétique de la cellule receveuse. L'ADN exogène est absorbé dans la cellule réceptrice depuis son environnement à travers la ou les membranes cellulaires. La transformation se produit naturellement chez certaines espèces de bactéries, mais il peut également être affecté par des moyens artificiels dans d'autres cellules.

De quoi est fait le plasmide ?

Plasmides sont des molécules d'ADN double brin circulaires contenant généralement quelques milliers de paires de bases qui se répliquent dans la cellule indépendamment de l'ADN chromosomique. Plasmide L'ADN est facilement purifié à partir des cellules, manipulé à l'aide de techniques de laboratoire courantes et incorporé dans les cellules.

Qu'est-ce qui rend une cellule compétente ?

Cellules compétentes. E. coli cellules sont plus susceptibles d'incorporer de l'ADN étranger si leur cellule les murs sont modifiés pour que l'ADN puisse passer plus facilement. Tel cellules sont dits “compétent.” Cellules sommes rendu compétent par un procédé qui utilise du chlorure de calcium et un choc thermique.

Quel a été le rôle du chlorure de calcium dans cette expérience ?

L'anhydre chlorure de calcium tube est placé entre le réacteur et l'atmosphère. Ceci afin d'éviter que de l'humidité ne pénètre dans le récipient de réaction.

Pourquoi les flacons sont-ils incubés pendant 10 minutes ?

Rendre les cellules compétentes en rendant les membranes cellulaires plus perméables à l'ADN. Pourquoi les flacons ont-ils été incubés pendant 10 minutes dans le bouillon LB plutôt que de transférer leur contenu directement dans les assiettes ? Laisser le temps aux cellules de produire le gène de résistance à l'ampicilline. Pour voir comment la bactérie se développe sans ampicilline.

Pourquoi utilisons-nous cacl2 pour la transformation bactérienne ?

Transformation du chlorure de calcium. Il augmente la capacité d'une cellule procaryote à incorporer de l'ADN plasmidique, ce qui lui permet d'être génétiquement transformé. L'addition de chlorure de calcium à une suspension cellulaire favorise la liaison de l'ADN plasmidique aux lipopolysaccharides (LPS).

Qu'est-ce que le choc thermique fait aux bactéries?

Dans le laboratoire, bactérien les cellules peuvent être rendues compétentes et l'ADN introduit par la suite par une procédure appelée choc thermique méthode. Une augmentation soudaine de la température crée des pores dans la membrane plasmique du bactéries et permet à l'ADN plasmidique d'entrer dans le bactérien cellule.

Pourquoi le glycérol est-il utilisé dans la préparation de cellules compétentes ?

Glycérol comme cryoprotecteur abaisse le point de congélation des bactéries cellules, améliorant la surfusion. Il le fait en formant de fortes liaisons hydrogène avec les molécules d'eau, en concurrence avec la liaison hydrogène eau-eau. Cela perturbe la formation du réseau cristallin de la glace à moins que la température ne soit considérablement abaissée.

Comment les 10 premières cellules deviennent-elles compétentes ?

  1. Streak TOP10 cellules sur une plaque SOB et cultiver pour des colonies simples à 23 ° C.
  2. Prélever des colonies individuelles dans 2 ml de milieu SOB et agiter pendant une nuit à 23°C.
  3. Ajouter du glycérol à 15%
  4. Aliquoter des échantillons de 1 ml dans des cryotubes Nunc.
  5. Placer les tubes dans un sac à fermeture à glissière, plonger le sac dans un bain de glace carbonique/éthanol pendant 5 minutes.

Comment l'efficacité de transformation est-elle calculée ?

Efficacité des transformations est le Efficacité par lequel les cellules peuvent absorber l'ADN extracellulaire et exprimer les gènes qu'il code. Ça peut être calculé en divisant le nombre de transformants réussis par la quantité d'ADN utilisée au cours d'une transformation procédure.


Histoire derrière la découverte de la transformation bactérienne

La compétence naturelle ou transformabilité des bactéries a été signalée pour la première fois par Frederick Griffith en 1928 [1]. Griffith a noté que les souris sont mortes lorsqu'elles ont reçu une injection de pneumocoque « lisse » (Streptococcus pneumoniae) (d'où le terme virulent) mais n'est pas mort de la souche « rugueuse » (non virulente). La virulence de la souche lisse pourrait être abolie par la chaleur. Cependant, lorsque la souche lisse tuée par la chaleur a été mélangée avec la souche rugueuse non virulente, la souche rugueuse a acquis le phénotype lisse et est devenue virulente (Figure 1). Les expériences de Griffith ont suggéré qu'un matériau non vivant et stable à la chaleur dérivé de la déformation lisse était responsable de la transformation. Ce n'est qu'en 1944 que ce matériel transformatif a été identifié comme de l'ADN par Oswald Avery, Colin MacLeod et Maclyn McCarty [2].

Figure 1. Les expériences de Griffith. L'aspect lisse du pneumocoque est dû à la présence d'un revêtement de polysaccharide qui empêche la reconnaissance des cellules bactériennes par le système immunitaire de l'hôte.


Améliorer mon protocole de préparation de cellules compétentes et de choc thermique adapté au bricolage CaCl2 - Biologie

E. coli les cellules, rendues compétentes par le traitement au chlorure de calcium (ou un autre traitement chimique), peuvent être transformé par absorption d'ADN étranger. La transformation est le résultat du mélange de l'ADN et des cellules compétentes, suivi d'un court choc thermique. Le changement rapide de température crée un déséquilibre thermique de chaque côté de la membrane d'E. coli, ce qui est censé créer un courant d'air qui balaie les plasmides dans le cellule.
En général, des ADN plus gros donnent des efficacités de transformation plus faibles (c'est pourquoi les étudiants ne trouvent que rarement un clone pGT� dans la bibliothèque Lambda..).
Typiquement, la sélection des cellules qui ont effectivement absorbé l'ADN se fait en les cultivant sur des plaques de gélose contenant un antibiotique sélectif.

Dans le laboratoire de clonage simple, E. coli la transformation est généralement effectuée avec les solutions suivantes disponibles :

  • compétent E. coli cellules, fraîchement préparées ou à partir de -80° de stock
  • un mélange réactionnel de ligature
  • un produit de digestion d'ADN (tel qu'utilisé dans la réaction de ligature)
  • une solution diluée d'un plasmide témoin

Le plasmide à construire est formé par in vitro ligaturer les fragments d'ADN (fragments vecteurs plasmidiques et fragments donneurs)

La métamorphose du E. coli cellules est réalisée en mélangeant (à basse température) de l'ADN plasmidique (ou des plasmides formés lors d'une ligature) avec un petit volume d'une suspension dense de cellules E. coli traitées chimiquement. Un choc thermique de 90 secondes à 42 °C amènera une partie des molécules d'ADN dans les cellules bactériennes. Après une heure de récupération à 37°C, les bactéries sont étalées sur une plaque de gélose qui contient typiquement l'antibiotique auquel le plasmide confère une résistance. Transformants (bactéries ayant absorbé avec succès une molécule plasmidique intacte) seront sélectionnées de cette manière, car les non-transformants ne sont pas capables de se développer sur l'antibiotique. Seules des molécules d'ADN circulaires, capables de se répliquer, peuvent conférer une résistance aux antibiotiques à la bactérie.
L'ADN linéaire ne se répliquera pas (et ne survivra pas aux activités d'exonucléase) à l'intérieur de la cellule bactérienne !

Dans le laboratoire de clonage simple, pour une expérience de clonage, quatre transformations sont effectuées en utilisant les mélanges d'ADN suivants :

  1. mélange réactionnel de ligature
  2. digestion d'ADN de vecteur et digestion d'ADN de donneur (un mélange des deux, tel qu'utilisé dans la réaction de ligature)
  3. 1 ng d'ADN plasmidique non coupé (par exemple le plasmide vecteur)
  4. eau ( = pas d'ADN)

2, 3 et 4 sont des contrôles pour le protocole de ligature et de transformation.
Dans une transformation standard par choc thermique, un ng de plasmide sur 3 devrait donner 100 à 1000 colonies.


EXPÉRIMENTAL

E. coli cultures de départ :

Colonies de E. coli (DH5α – Invitrogen, Cat n° 12297-016, Xl-1 Blue – Stratagene, Cat n° 200247, SCS110 – Stratagene, Cat n° 200249, JM109 – Promega, Cat n° L2001, TOP10 – Invitrogen Cat n° C4040 -10, BL21-(DE3)-PLysS – Invitrogen, Cat n° C6060-03) ont été isolés à partir de sources commerciales par étalement sur gélose LB [Luria–Bertani (bouillon)] (Biopolis Shared Facilities, A*STAR). Des colonies uniques ont été inoculées dans 2 ml de milieu approprié pendant la nuit. Environ 100 ul des cultures ont été inoculés dans 50 ml de milieux respectifs préchauffés pour permettre la croissance jusqu'à la phase logarithmique précoce [DO600 (densité optique) lecture de 0,3 à 0,5) [8,9] (tableau supplémentaire S1 à http://www.bioscirep.org/bsr/033/bsr033e086add.htm), suivi d'un placement immédiat sur de la glace pendant 15 min et d'une centrifugation. Les pastilles ont été remises en suspension dans des tampons spécifiques à la méthode (voir CaCl2 [4,13], DMSO [12] et méthode de Hanahan [10] ou données supplémentaires). Toutes les bactéries ont été cultivées à 37°C sous agitation vigoureuse à 200-220 tr/min (Certomat BS-1, Satorius Stedim Biotech). Toutes les étapes de centrifugation ont été effectuées à 3200 g en utilisant Eppendorf, modèle 5804R à 4°C.

Comparaison des quatre méthodes sur six E. coli souches

Pour les comparaisons, les paramètres suivants ont été standardisés : (1) Utilisation d'aliquotes bactériennes de 100 l pour la transformation et le calcul du TrE (2) Utilisation du plasmide PUC18 uniquement (3) Utilisation de milieux LB pour la croissance et la croissance post-choc (4) Utilisation d'un choc thermique de 45 s pour la transformation et (5) un volume de remise en suspension final de 4 ml à partir de 50 ml initiaux de cultures bactériennes.

MgCl2–CaCl2 méthode : adaptée de la méthode de Sambrook et Russell [13]

Les bactéries en boulettes de 50 ml de cultures ont été remises en suspension avec un léger pipetage dans 15 ml de 0,1 M de MgCl2 (formulé dans de l'eau désionisée et autoclavé) (BDH, VWR International) et incubé sur glace pendant 10 min. Les bactéries ont été sédimentées à 4 000 tr/min à 4°C pendant 10 min, remises en suspension dans 15 ml de CaCl 0,1 M2, et incubé sur glace pendant 30 min. Après essorage, le surnageant a été jeté et les culots doucement remis en suspension dans 4 ml (volume standardisé) de 0,1 M de CaCl2 avec une solution de glycérol à 20 % (v/v) et conservée en aliquotes de 100 µl à -80°C.

CaCl2 méthode : adaptée et modifiée de la méthode de Mandel et Higa [4]

Des souches bactériennes en boulettes provenant de cultures de 50 ml ont été remises en suspension avec un pipetage doux dans 25 ml (la moitié du volume de la culture initiale) de 0,1 M CaCl glacé2 (BDH) (formulé dans de l'eau désionisée et autoclavé) et incubé sur glace pendant 1 h. Les suspensions de bactéries ont été sédimentées à 4 000 tr/min à 4 °C pendant 10 min, suivies d'une légère remise en suspension dans 4 ml de 0,1 M de CaCl.2+15% (v/v) de glycérol et conservé en aliquotes de 100 µl à -80°C.

Méthode DMSO : adaptée et modifiée de la méthode de Chung et Miller [12]

Des souches de bactéries en boulettes de 50 ml de cultures ont été remises en suspension dans 4 ml de TSB glacé (tampon de stockage de transformation : bouillon LB à pH 6,1, 10 % (p/v) PEG4450, 5 % (v/v) DMSO, 10 mM MgCl2 et 10 mM de MgSO4, filtre stérilisé avec un filtre de 0,45 µm) et incubé sur glace pendant 30 min. Les bactéries ont ensuite été stockées en aliquotes de 100 µl à -80°C.

Méthode de Hanahan : adaptée et modifiée de Hanahan [10]

Les protocoles originaux détaillés et la préparation du FSB (tampon de stockage gelé) se trouvent dans les données supplémentaires à l'adresse http://www.bioscirep.org/bsr/033/bsr033e086add.htm.

Les souches bactériennes en boulettes de 50 ml de culture ont été remises en suspension doucement dans 16,5 ml de FSB (10 mM CH3CO2K à pH 7,5, 45 mM MnCl2, 10 mM de CaCl2, 0,1 M KCl, 3 mM [Co(NH3)6]Cl3, 10 % de glycérol) et incubé sur glace pendant 15 min. Les bactéries ont ensuite été sédimentées à 4 000 tr/min à 4°C pendant 10 min et remises en suspension dans 4 ml de FSB. 140 l de DMSO ont été ajoutés deux fois à 5 min d'intervalle au centre de la suspension sous agitation douce. Les suspensions bactériennes ont été conservées en aliquotes de 200 µl à -80°C.

Protocole de transformation pour les méthodes standardisées

45 s de transformation par choc thermique - (modifié à partir du protocole recommandé par Stratagene) - utilisé pour toutes les méthodes sauf la méthode DMSO

100 μl of competent bacteria were mixed with 1 μl of control pUC18 plasmid [0.1 ng/μl in nuclease-free water (Agilent, 200231-42)] in cold 14 ml round bottomed tubes (BD, Product no. 352059) and incubated on ice for 30 min. A 42°C heat-shock of 45 s was performed, followed by immediate placement on ice for 2 min. 100 μl of LB media were added to the bacterial suspensions before incubations at 37°C for 1 h. The entire aliquot was plated out on 1.5% (w/v) LB agar plates with 100 μg/ml ampicillin (Goldbio, A-301-5) at 37°C overnight.

Transformation of competent bacterial (DMSO method):

100 μl of thawed DMSO competent cells were transferred to ice-cold 14 ml round bottomed tubes (BD, Product no. 352059) and incubated with 0.1 ng/ul of control pUC18 plasmid (Agilent, 200231-42) on ice for 30 min. The cell suspensions were then allowed to grow in 0.9 ml of TSB with 20 mM of glucose at 37°C in vigorous shaking (speed 200–220) for 1 h. The cells were then plated on LB agar plates with 100 μg/ml ampicillin and incubated overnight at 37°C.

Comparison of the culture media:

Optimization of culture media used for starter cultures

The various strains of E. coli were induced to be competent using the established best methods as described above, and varying the use of SOB (super optimal broth) [10] or LB [14] as the starting culture media. Heat shock was standardized to 45 s.

Comparison of the heat-shock incubation times for transformation

The incubation times of the heat shock for all the six strains were made using the exact transformation protocol as described by Hanahan [10] (Supplementary data at http://www.bioscirep.org/bsr/033/bsr033e086add.htm), with the exception of varying the incubation to either 45 or 90 s in the 42°C heat bath.

Data collection and computation of TrE

All bacterial colonies on the plated agar were counted manually. The TrE were calculated according to the formula provided by Stratagene, and adjusted to aliquot volumes 100 μl.

Fourfold concentration of optimally induced bacteria

The bacterial strains were concentrated prior to freezing and storage by virtue of a four-fold reduction in the volume of the final storage buffer used to resuspend the strains as per their optimized protocols.

Statistical computation and analysis

For comparison of the four methods on the six strains, both ANOVA and independent t tests were used. ANOVA test was performed to determine the reproducibility of the TrE within each method (Supplementary Table S2A at http://www.bioscirep.org/bsr/033/bsr033e086add.htm), as well as the differences between the four methods (Supplementary Table S2B at http://www.bioscirep.org/bsr/033/bsr033e086add.htm). Indépendant t test was used for the comparison of pair-wise method comparisons (Supplementary Table S2C at http://www.bioscirep.org/bsr/033/bsr033e086add.htm), media (Figure 2), heat-shock incubation times (Figure 3), and four-fold concentration and neat (Figure 4). All statistical analysis was performed using SPSS ver. 17 (IBM) at a 95% confidence interval.


Matériaux et méthodes

Matériaux

Escherichia coli strains DH5α, Jm107 et BL21 (DE3) were obtained from Life Technologies, Fermentas and Novagen, respectively. pGEM–T, pET-28a et pCAMBIA 3300 plasmids were purchased from Promega (#A3600), Novagen (#69864-3) and Cambia Labs, respectively. Luria–Bertani (LB) broth and LB agar were both from Sigma-Aldrich Co. (#L3022 and #L2897). Autoclaved CMC solution was made of 80 mM CaCl2(2H2O) (Sigma-Aldrich, #C2536) and 20 mM MgCl2 (Sigma-Aldrich, #M8266). Glycerol (should be autoclaved), ampicillin (Ap) and kanamycin (Km) were all obtained from Sigma-Aldrich (corresponding to #G5516, #A9393 and #K1377 catalogue numbers).

Transformation protocol

Single colonies of E. coli strains included in this study were separately inoculated in 10 mL of LB broth medium and were left overnight at 37 °C with moderate shaking (250 r.p.m.). A falcon tube containing culture medium (without bacteria) was considered as control. The aforementioned cultures in a volume of 200 μL were transferred into 10 mL of LB broth containing 2.5% glycerol inside 50-mL falcon tubes and incubated at 37 °C for 3 h with moderate shaking (250 r.p.m.). OD of the cultures was regularly monitored. The culture tubes were incubated on ice when the OD600 nm became 0.9 ( Tang et al., 1994). The bacterial cultures were transferred into 2-mL microtubes and centrifuged at 1600 g for 5 min at 4 °C. The supernatant was discarded, and the tubes were stood in an inverted position on a sterile Whatman paper to remove the last drops of media. Pellets were gently resuspended in 250 μL ice-cold CMC solution and stored on ice for 30 min. The cells were recovered by centrifugation at 1000 g for 3 min at 4 °C. The supernatant was discarded, then 250 μL of CMC/glycerol mixture (70 : 30 ratio) was added, and pellets were gently resuspended. 1 × 10 9 copy numbers of pCAMBIA3300, pET-28a et pGEM-T plasmids in uncut form were added in a volume not exceeding 5% of that of the competent cells ( Hanahan, 1983). Nanogram weights for pCAMBIA3300, pET-28a et pGEM-T vectors to include 1 × 10 9 copies were 9.1, 5.8 and 3.25, respectively. Contents of tubes were gently mixed and incubated on ice for 30 min. Ice-cold LB broth (20 μL) was added to tubes while they were being kept on ice (In this protocol, SOC medium could be used instead of LB). Tubes were immediately vibrated at 37 °C using a Heidolph Reax Top test tube vibrating shaker for 10 min. 500 μL of prewarmed 37 °C LB broth was added to each tube. Tubes were incubated at 37 °C shaking incubator for 30 min with moderate shaking at 250 r.p.m. Cells were collected by centrifugation at 1600 g for 3 min at room temperature. The liquid phase was discarded under aseptic conditions, and 50 μL of 37 °C LB broth was added into each tube then, the bacterial pellets were resuspended completely (Km resistance was considered as selectable marker for pET-28a and pCAMBIA. Am resistance was used for screening of bacteria transformed with pGEM-T vector). Final concentrations of Am and Km in the reaction tubes were adjusted to 50 and 30 μg mL −1 , respectively. Contents of these tubes were transferred on screening plates containing appropriate antibiotics. Each mixture was spread on a single plate with a sterilized bent glass rod. The plates were incubated at 37 °C for 12–16 h in an inverted position, and subsequently, plates were collected to count the colonies. All experiments were carried out in triplicate.

Technical hints

The current protocol should be carried out under aseptic condition. Furthermore, during the transformation process, starvation of bacteria has a negative impact on their viability. It should also be noted that if the competent cells are not being used immediately, they should be stored in −70 °C until needed. An important consideration in preparation of competent cells is choosing a suitable OD to harvest the bacteria. The OD600 nm must be < 0.9–1. The highest transformation efficiencies have been obtained at two separate points in the growth curve of E. coli: I in early-to-mid-log phase (OD600 nm = 0.4) ( Hanahan, 1983) and II in late-log phase (OD600 nm = 0.95) ( Tang et al., 1994). The optimum concentration of glycerol used in media was 2.5%. In this concentration, transformation efficiency and OD were both acceptable (data not shown).

Analyses statistiques

In order to compare vibration and glycerol-mediated method with the common heat-shock procedure ( Cohen et al., 1972), vibration and heat-shock methods were both applied in media with and without glycerol and the four different processes were compared. Data were analysed using spss 14 according to completely randomized design. Analysis of variance was performed within each plasmid. Means were compared by the Duncan test at alpha value of (P < 0.05).


Transformation efficiency should be determined under conditions of cell excess. [1] The number of viable cells in a preparation for a transformation reaction may range from 2×10 8 to 10 11 most common methods of E. coli preparation yield around 10 10 viable cells per reaction. The standard plasmids used for determination of transformation efficiency in Escherichia coli are pBR322 or other similarly-sized or smaller vectors, such as the pUC series of vectors. Different vectors however may be used to determine their transformation efficiency. 10–100 pg of DNA may be used for transformation, more DNA may be necessary for low-efficiency transformation (generally saturation level is reached at over 10 ng). [2]

After transformation, 1% and 10% of the cells are plated separately, the cells may be diluted in media as necessary for ease of plating. Further dilution may be used for high efficiency transformation.

Transformation efficiency can be measured in transformants or colony forming unit (cfu) per μg DNA used. A transformation efficiency of 1×10 8 cfu/μg for a small plasmid like pUC19 is roughly equivalent to 1 in 2000 molecules of the plasmid used being transformed. Dans E. coli, the theoretical limit of transformation efficiency for most commonly used plasmids would be over 1×10 11 cfu/μg. In practice the best achievable result may be around 2–4×10 10 cfu/μg for a small plasmid like pUC19, and considerably lower for large plasmids.

Individual cells are capable of taking up many DNA molecules, but the presence of multiple plasmids does not significantly affect the occurrence of successful transformation events. [3] A number of factors may affect the transformation efficiency: [1]

Plasmid size – A study done in E. coli found that transformation efficiency declines linearly with increasing plasmid size, i.e. larger plasmids transform less well than smaller plasmids. [3]

Forms of DNA – Supercoiled plasmid have a slightly better transformation efficiency than relaxed plasmids – relaxed plasmids are transformed at around 75% efficiency of supercoiled ones. [3] Linear and single-stranded DNA however have much lower transformation efficiency. Single-stranded DNAs are transformed at 10 4 lower efficiency than double-stranded ones.

Genotype of cells – Cloning strains may contain mutations that improve the transformation efficiency of the cells. Par exemple, E. coli K12 strains with the deoR mutation, originally found to confer an ability of cell to grow in minimum media using inosine as the sole carbon source, have 4-5 times the transformation efficiency of similar strains without. For linear DNA, which is poorly transformed in E. coli, les recBC ou recD mutation can significantly improve the efficiency of its transformation.

Growth of cellsE. coli cells are more susceptible to be made competent when it is growing rapidly, cells are therefore normally harvested in the early log phase of cell growth when preparing competent cells. The optimal optical density for harvesting cells normally lies around 0.4, although it may vary with different cell strains. A higher value of 0.94-0.95 has also been found to produce good yield of competent cells, but this can be impractical when cell growth is rapid. [4]

Methods of transformation – The method of preparation of competent cells, the length of time of heat shock, temperature of heat shock, incubation time after heat shock, growth medium used, and various additives, all can affect the transformation efficiency of the cells. The presence of contaminants as well as ligase in a ligation mixture can reduce the transformation efficiency in electroporation, [5] and inactivation of ligase or chloroform extraction of DNA may be necessary for electroporation, alternatively only use a tenth of the ligation mixture to reduce the amount of contaminants. Normal preparation of competent cells can yield transformation efficiency ranging from 10 6 to 10 8 cfu/μg DNA. Protocols for chemical method however exist for making supercompetent cells that may yield a transformation efficiency of over 1 x 10 9 . [6] Electroporation method in general has better transformation efficiency than chemical methods with over 1 x 10 10 cfu/μg DNA possible, and it allows large plasmids of 200 kb in size to be transformed.

Damage to DNA – Exposure of DNA to UV radiation in standard preparative agarose gel electrophoresis procedure for as little as 45 seconds can damage the DNA, and this can significantly reduce the transformation efficiency. [7] Adding cytidine or guanosine to the electrophoresis buffer at 1 mM concentration however may protect the DNA from damage. A higher-wavelength UV radiation (365 nm) which cause less damage to DNA should be used if it is necessary work for work on the DNA on a UV transilluminator for an extended period of time. This longer wavelength UV produces weaker fluorescence with the ethidium bromide intercalated into the DNA, therefore if it is necessary to capture images of the DNA bands, a shorter wavelength (302 or 312 nm) UV radiations may be used. Such exposure however should be limited to a very short time if the DNA is to be recovered later for ligation and transformation.