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E.coli édité par CRISPR/Cas9 sur AFM ?

E.coli édité par CRISPR/Cas9 sur AFM ?


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Je fais l'expérience CRISPR/Cas9 sur E. coli. J'introduis le plasmide recombinant BPK764 (qui porte Cas9 + sgRNA conçu et ajouté plus tard dans ce plasmide) dans compentent E. coli cellules qui portent déjà un autre plasmide avec le gène GFP. sgRNA sera conçu de telle sorte qu'il corresponde à ce gène GFP parce que mon point principal est de couper le gène GFP. Le résultat principal de cette expérience sera E. coli les cellules qui expriment/n'expriment pas le gène GFP (en fonction de l'efficacité de CRISPR/Cas9), par conséquent, les cellules résultantes s'allumeront ou ne s'allumeront pas en vert. Je verrai cela sous lampe UV, et par microscopie fluorescente.

Maintenant, j'arrive à ma question. Y a-t-il quelque chose sur ces cellules résultantes (un trait, comme la structure de la membrane, le module de Youngs, qui diffère des cellules non traitées CRISPR) qui peut être visualisé sur AFM (microscopie à force atomique) ? Quelque chose qui change sur les cellules après l'insertion du plasmide qui peut confirmer l'efficacité de cette expérience ?

Ou peut-être une autre idée sur cette expérience utilisant l'AFM ?


À moins que vous ne cibliez spécifiquement les gènes impliqués dans la morphologie physique de la cellule, je doute que vous trouviez des différences entre les cellules CRISPRed et les cellules non CRISPRed mesurables via AFM.

Peut-être devriez-vous plutôt cibler les gènes connus pour contribuer à la structure de la paroi cellulaire, dont je m'attendrais à ce qu'ils soient le matériau dominant contribuant au module de Young. Puisque vous avez mentionné la GFP comme un outil de sélection de coupes "réussies", il pourrait être intéressant d'envisager de générer un plasmide multiplex qui vous permet de cibler plusieurs loci avec une seule construction. Ces kits sont disponibles sur Addgene et contiennent des publications et des manuels associés sur la façon dont ils peuvent être utilisés.

Donc, pour résumer, non, je ne pense pas qu'il y ait quoi que ce soit de physiquement différent dans les cellules qui ont été traitées par CRISPR par rapport à un groupe témoin. Si vous vouliez utiliser CRISPR pour effectuer un knock-out de la fluorescence dans les cellules compétentes que vous avez décrites et modifier la mécanique cellulaire, vous devrez probablement générer un plasmide CRISPR multiplex avec plusieurs cassettes d'ARNg pour la GFP et peut-être un gène impliqué dans la formation de la paroi cellulaire. Gardez à l'esprit que votre pourcentage d'efficacité est aggravé avec chaque nouvelle cible dans le même multiplex - au lieu qu'une seule coupe soit considérée comme réussie, vous aurez élevé la barre à 2 coupes considérées comme réussies sans rien faire pour améliorer l'efficacité d'une seule coupe un événement.

J'espère que cela vous aidera, et je serais heureux d'en discuter davantage.


Fiable et pas cher modification des gènes, utilisée soit pour « réparer » des défauts génétiques chez les patients, soit pour introduire des modifications génomiques en vue d'une étude plus approfondie dans un laboratoire de recherche, est une technologie très recherchée. Depuis son développement vers 2012, CRISPR (court pour clustré rrégulièrement jeespacé scourt palindromique repeats) ont été reconnus comme de puissantes techniques d'édition de gènes. Les ressources et vidéos fournies dans la section Bibliographie couvrent une grande partie des informations sur le fonctionnement de CRISPR. CRISPR exploite les bactéries naturelles du système immunitaire utilisées pour combattre les virus. Le mécanisme de défense antivirale repose sur l'incorporation de fragments d'ADN de virus dans l'ADN bactérien. Cette partie de l'ADN est appelée Baie CRISPR. Dans la puce CRISPR, les fragments d'ADN viral acquis sont séparés par de courtes répétitions de séquences nucléotidiques conservées (Figure 1). Les bactéries peuvent ensuite utiliser cet ADN viral acquis pour identifier et se défendre contre de nouvelles menaces virales à l'avenir.


Figure 1. Vue schématique d'une matrice d'espacement de répétition CRISPR.

Plusieurs types de systèmes CRISPR ont été identifiés, mais le plus étudié est le CRISPR-Cas9 système. Dans ce système, les gènes à côté de la matrice d'espacement de répétition CRISPR codent un mécanisme de défense unique consistant en un ARN à guide unique Et un endonucléase (Cas9), une protéine capable de couper l'ADN double brin. L'ARN à guide unique (sgRNA ou gRNA) aide à cibler l'ADN viral dangereux, et l'endonucléase Cas9 dégrade les acides nucléiques étrangers en induisant une cassure double brin. Le sgRNA contient une ou plusieurs séquences CRISPR acquises à partir de la matrice d'espacement de répétition CRISPR. En cas d'infection virale, le sgRNA se combine avec la nucléase Cas9 pour construire un Complexe sgRNA-Cas9 et le guide vers la cible appropriée dans l'ADN du virus (Figure 2).

Parce que le mécanisme CRISPR peut couper n'importe où dans l'ADN, la bactérie doit protéger son propre ADN contre les dommages. Les PAM (motif adjacent au protospacer) région est une courte séquence d'ADN et un composant de ciblage essentiel qui permet à la bactérie de distinguer son propre ADN de l'ADN étranger. Le sgRNA n'adhérera et ne désactivera qu'une séquence d'ADN qui contient une séquence PAM à proximité. Le sgRNA se verrouille sur la séquence PAM et commence à décompresser l'ADN double brin pour tester si le sgRNA correspond à l'ADN cible. Une fois qu'une séquence correspondante est trouvée, le sgRNA se lie au site génomique cible par le biais d'un appariement de bases complémentaires, et la nucléase Cas9 coupe l'ADN du virus double brin, inactivant le virus.


Figure 2. L'ARN à guide unique se combine avec Cas9 et guide la nucléase vers la cible au sein d'un ADN génomique double brin. Le sgRNA se verrouille sur la cible d'ADN directement à côté de la séquence PAM requise. Si le sgRNA correspond à l'ADN cible, la nucléase Cas9 coupe l'ADN double brin 3 paires de bases en amont du motif PAM. (Crédit image : Marius Walter [CC BY-SA 4.0], Wikimedia Commons, 2017)

Les chercheurs ont maintenant trouvé un moyen de manipuler la séquence nucléotidique du sgRNA afin que le système Cas9 puisse cibler n'importe quelle séquence d'ADN pour le clivage. Une fois que la nucléase Cas9 coupe l'ADN cible, la cellule Mécanismes de réparation de l'ADN entrer en jeu. Il existe deux voies principales à l'intérieur d'une cellule qui entraînent la réparation des cassures double brin de l'ADN. La première voie est la voie de jonction d'extrémité non homologue (NHEJ), qui est sujette aux erreurs et peut conduire à des mutations d'insertion ou de délétion dans l'ADN. La deuxième voie est la mécanisme de réparation directe homologue (HDR), qui permet l'insertion d'une matrice d'ADN spécifique (simple ou double brin) sur le site cible. Pour en savoir plus sur ces deux voies, vous pouvez consulter la simulation du mécanisme de réparation de l'ADN des déclencheurs CRISPR-Cas9 sur LabXchange. Actuellement, les deux applications les plus courantes de la technologie CRISPR sont la mutation ciblée de gènes spécifiques entraînant des knock-outs fonctionnels de gènes et le remplacement d'un variant de gène par un autre. Les deux stratégies exploitent le mécanisme naturel CRISPR. KO génétique et remplacement de gène ont rendu beaucoup plus facile de sonder les fonctions des gènes et d'établir des liens de causalité entre les variations génétiques et les phénotypes biologiques.

La technologie CRISPR-Cas9 a été utilisée avec succès dans des cellules bactériennes et mammifères, permettant la création d'animaux transgéniques avec des mutations ciblées. La plupart des recherches du CRISPR se sont concentrées sur le traitement des maladies en introduisant des modifications génétiques dans les cellules du sang, des poumons ou du cerveau. Les chercheurs ont bon espoir que cette technologie permettra un jour aux scientifiques de réparer les variantes génétiques pathogènes chez les patients atteints de certaines maladies génétiques. Cette approche est particulièrement prometteuse dans des maladies telles que la drépanocytose, la mucoviscidose et la maladie de Huntington, chacune étant liée à un seul variant génique. En 2019, les premiers essais cliniques d'édition de gènes ont commencé, ciblant les patients atteints d'anémie falciforme. À l'avenir, CRISPR pourrait également avoir un impact significatif sur l'agriculture et l'environnement, y compris leur impact sur la santé humaine. Par exemple, CRISPR peut être utilisé pour modifier les cultures afin de les rendre plus résistantes à la sécheresse ou aux parasites, ou pour éradiquer les insectes vecteurs de maladies, tels que les moustiques.

Bien que l'édition du génome apporte des avantages potentiels importants, elle soulève également de profondes questions éthiques. Quelles normes de sécurité CRISPR sont appropriées ? Où sont les limites de cette technologie ? L'édition de gènes nous rapproche-t-elle des « bébés sur mesure » ? Qu'en est-il de la discrimination génétique potentielle ? Comment accorder un accès équitable aux technologies d'édition de gènes ? En 2018, le chercheur chinois He Jiankui a affirmé avoir édité les génomes de deux embryons humains, qui se sont ensuite développés en deux bébés humains, soulignant la nécessité d'un discours public continu pour aborder ces questions éthiques fondamentales liées à CRISPR.

Dans ce projet, vous ferez vous-même une expérience d'édition de gènes CRISPR ! Plus précisément, vous utiliserez CRISPR pour modifier l'ADN génétique de Escherichia coli de sorte qu'il devienne résistant à la streptomycine. Streptomycine est un antibiotique qui lie le ribosome et l'empêche de fabriquer des protéines, empêchant les bactéries de se répliquer et de se développer. Dans ce projet, votre objectif est de créer une mutation spécifique dans la protéine de la sous-unité ribosomique rpsL qui empêche la streptomycine de la lier, permettant ainsi à la bactérie de se développer sur un milieu streptomycine. Votre modification d'ADN doit changer une seule base d'ADN afin que l'acide aminé lysine en position 43 (K43) soit transformé en thréonine. A cet effet, le kit comprend deux CRISPR plasmides et un spécifique modèle de réparation d'ADN qui porte le changement d'ADN souhaité. Vous testerez si vous pouvez également obtenir la mutation souhaitée lors de la réaction CRISPR sans la matrice de réparation de l'ADN. Pensez-vous que cela va fonctionner? Essayez ce projet pour le découvrir !


1. Introduction

Les technologies CRISPR-Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associé) ont considérablement fait progresser nos capacités de génie génétique au cours des dernières années. Largement trouvés dans les bactéries et les archées, les systèmes CRISPR-Cas constituent les systèmes immunitaires adaptatifs qui agissent contre l'invasion d'acides nucléiques étrangers [1]. En général, les systèmes CRISPR-Cas sont composés d'un ARN CRISPR (crRNA) et de protéines Cas. L'ARNc est complémentaire de la séquence cible et guide ainsi les protéines Cas pour la reconnaissance et le clivage spécifiques à la séquence. La modification génétique peut ensuite être introduite soit par la jonction d'extrémités non homologues sujettes aux erreurs (NHEJ) soit par la réparation dirigée par homologie (HDR) qui crée des modifications génomiques précises. Alors que les eucaryotes utilisent les deux mécanismes pour répondre aux ruptures de l'ADN [2,3], la plupart des procaryotes utilisent le HDR [[4], [5], [6]]. Ces mécanismes peuvent être exploités pour diverses biotechnologies basées sur CRISPR-Cas.

Un certain nombre de technologies CRISPR-Cas prometteuses ont été développées, révolutionnant la recherche et les applications en biologie. Par rapport aux stratégies traditionnelles d'ingénierie de l'ADN [7,8] telles que la recombinaison λ-Red, l'édition du génome CRISPR-Cas est une méthode sans marqueur, polyvalente et efficace, et nécessite moins de criblage pour identifier les clones positifs. De plus, l'ingénierie des protéines Cas en Cas déficients en nucléase (dCas) étend davantage la puissance des systèmes basés sur CRISPR-Cas pour une répression et une activation transcriptionnelles faciles, efficaces et multi-cibles, permettant le contrôle du niveau d'expression de potentiellement tous les gènes d'intérêt sans manipuler la séquence génomique. De plus, de nouvelles technologies basées sur CRISPR-Cas sont constamment développées. Par exemple, par fusion de désaminases à dCas, les systèmes CRISPR-Cas peuvent être adaptés pour permettre l'édition de bases sur l'ADN et l'ARN, sans nécessiter de clivage d'ADN ou de matrices de donneur. De plus, sur la base de l'effet collatéral des protéines Cas, les systèmes CRISPR-Cas ont été exploités pour détecter des acides nucléiques spécifiques au niveau de l'atome [[9], [10], [11]].

Les systèmes CRISPR-Cas sont classés en classe 1 et classe 2, qui sont respectivement basés sur un complexe effecteur multiprotéique et une seule protéine Cas. En fonction de leur complexité et de leurs protéines de signature, les systèmes CRISPR-Cas sont en outre divisés en six types (Type I-VI). Parmi eux, le type II-A CRISPR-Cas9 et le type V-A CRISPR-Cas12a (anciennement appelé Cpf1) ont été les plus largement étudiés et développés comme outils génétiques chez les bactéries. Notamment, sur la base des résultats PubMed utilisant les termes �s9” et �s12a (ou Cpf1)”, � articles ont été publiés au cours des deux dernières années ( Fig. 1 ), indiquant l'émergence d'un sujet de recherche. Il existe de nombreuses revues de haut niveau sur les applications de CRISPR-Cas dans les organismes eucaryotes, tels que les levures, les champignons filamenteux, les cellules végétales et mammifères [[12], [13], [14], [15]]. Ici, nous discuterons du CRISPR-Cas avec un accent particulier sur les technologies associées et les applications de CRISPR-Cas9 et CRISPR-Cas12a dans diverses espèces bactériennes.

Nombre de publications NCBI PubMed contenant Cas9 et Cas12a (Cpf1). Les données 2018 sont collectées fin août.


Biotechnologie CRISPR-Cas9/Cas12a et application aux bactéries

Les technologies CRISPR-Cas ont profondément remodelé le domaine de la biologie. Dans cette revue, nous discutons du CRISPR-Cas avec un accent particulier sur les technologies et applications associées de CRISPR-Cas9 et CRISPR-Cas12a, qui ont été les plus largement étudiées et utilisées. Nous discutons des mécanismes biologiques de CRISPR-Cas en tant que systèmes de défense immunitaire, des systèmes anti-CRISPR-Cas récemment découverts et des variantes émergentes de Cas (telles que xCas9 et Cas13) avec des caractéristiques uniques. Ensuite, nous mettons en évidence diverses biotechnologies CRISPR-Cas, y compris l'édition du génome dépendante de la nucléase, la régulation du gène CRISPR (y compris l'interférence/activation CRISPR), l'édition de bases d'ADN/ARN et la détection d'acide nucléique. Enfin, nous résumons les applications actuelles des biotechnologies pour la biologie synthétique et l'ingénierie métabolique dans diverses espèces bactériennes.


Contenu

Système de recombinaison λ-rouge Modifier

Le système de recombineering λ-red a été publié en 1998 et permet l'insertion, la suppression ou les mutations de E. coli gènes. [2] Dans ce système, l'opéron rouge du bactériophage est transfecté dans E. coli cellules pour faciliter l'incorporation de l'ADN cible linéaire dans le E. coli génome. L'opéron λ-rouge du bactériophage est constitué du exo, pari, et jeu gènes qui, ensemble, sont responsables de la recombinaison. L'exonucléase du phage λ (exo) dégrade l'ADN cible linéaire transfecté à partir de l'extrémité 5'. [3] Beta se lie à l'extrémité 3' simple brin résultante et l'incorpore dans l'ADN cible pour former l'ADN recombinant. [3] Le phage λ gamma est nécessaire pour inhiber E. coli activité nucléase et protéger l'ADN linéaire transformé in vivo. [4]

Suite à l'induction de l'activité de l'opéron rouge , une cassette linéaire double brin codant pour un marqueur sélectionnable, tel que la résistance aux antibiotiques, est transformée dans les cellules à la place du gène cible et incorporée dans l'ADN derrière un promoteur inductible spécifique. [2] Cela permet une sélection de croissance des cellules recombinantes avec un emplacement d'insertion approprié vérifié à l'aide de la réaction en chaîne par polymérase (PCR). Une incorporation spécifique peut être réalisée en incluant des amorces de PCR flanquantes autour de l'ADN linéaire inséré qui sont complémentaires du site d'insertion ciblé. Après sélection des recombinants, une seconde transformation est nécessaire pour éliminer le marqueur sélectif. Un plasmide exprimant la flippase (FLP) peut être transformé dans les cellules recombinées, qui peuvent spécifiquement cliver les sites cibles de reconnaissance FLP (FRT) flanquant le gène de résistance aux antibiotiques. [2] Bien que cela supprime avec succès le marqueur sélectif du génome, il laisse des cicatrices FRT à la place du gène cible.

Le système λ-red a également été optimisé pour la recombinaison sans cicatrice, cependant, il s'agit d'un système en deux étapes consistant en une sélection et une contre-sélection. Dans ce cas, une cassette de gène avec un double marqueur sélectionnable peut être incorporée dans l'ADN à l'emplacement spécifique de la mutagenèse. Après sélection des recombinants, une transformation ultérieure pour transfecter l'ADN linéaire avec la mutation souhaitée est effectuée, qui sera ensuite recombinée de manière homologue dans l'ADN cellulaire à la place du marqueur. Par conséquent, une contre-sélection contre les cellules contenant le marqueur doit être effectuée afin d'identifier les cellules qui ont incorporé avec succès l'ADN linéaire dans la séquence cible. Cela peut être vérifié en utilisant le dépistage par PCR. [5]

Le procédé de recombinaison détaillé ci-dessus est avantageux car il fournit une alternative aux processus de recombinaison à faible efficacité, laborieux et à plusieurs étapes utilisant des endonucléases et des ligases. Par conséquent, la recombinaison λ-rouge est plus spécifique en termes d'altérations génomiques possibles qui ne sont pas régies par les emplacements des sites de reconnaissance des enzymes de restriction. Cependant, il présente également de nombreuses limites. Plusieurs cycles de transformations peuvent augmenter le risque d'erreur et augmenter le temps de recombinaison. Par conséquent, l'efficacité peut être faible (0,1 à 10 % pour les mutations ponctuelles 10 -5 -10 -6 pour les insertions, les suppressions ou les remplacements) et nécessite une longue croissance en colonies exploitables entre les transformations et les sélections recombinantes. Dans l'ensemble, cela contribue à une procédure de mutagenèse longue et inefficace, même pour des mutations uniques. [6] Cette technique peut également laisser des cicatrices pouvant contribuer à la déstabilisation du chromosome et impacter le succès de la manipulation.

Recombinaison CRISPR/Cas9 Modifier

Une méthode plus récente d'édition du génome utilise des séquences CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) et l'endonucléase Cas9 (CRISPR-associated protein 9). Ces composants font partie intégrante de la réponse immunitaire de certaines bactéries. [7] et ont été réutilisés pour l'ingénierie du génome. Dans ce système, des séquences correspondant à un bactériophage étranger ou à un ADN plasmidique sont incorporées en tant que séquences « espaceurs » dans le génome bactérien situé entre des loci CRISPR répétés. Les endonucléases Cas sont capables d'initier des cassures double brin au sein de ces ADN étrangers qui sont complémentaires des ARN CRISPR transcrits (crRNA, ou « protospacers »), les dégradant ainsi. Un motif conservé adjacent au protospacer (PAM, séquence 5'-NGG-3') situé immédiatement en aval du protospacer dans le génome cellulaire est nécessaire pour le clivage de Cas9. Ensemble, ce système permet une immunité adaptative au matériel génétique viral dynamique. [8]

En 2013, des méthodes pour exploiter ce système pour une utilisation dans l'édition de mutations ou d'insertions de E. coli des séquences ont été publiées. [9] Cette méthode comprend la construction d'un plasmide constitué du cas9 et les loci CRISPR contenant l'ADN cible correspondant, appelé ARN guide unique (sgRNA). Une fois l'expression induite, Cas9 est capable d'identifier la séquence d'ADN cible du génome cellulaire en trouvant le complément sgRNA et en initiant des ruptures de brin dans le E. coli génome.Cela permet à une séquence d'ADN linéaire transfectée d'être incorporée dans le génome, en s'appuyant sur la machinerie cellulaire pour utiliser l'ADN linéaire flanqué de régions homologues spécifiques à l'emplacement clivé comme matrice à reconstruire en utilisant une réparation dirigée par homologie. [9]

Cette méthode est avantageuse en ce qu'elle permet d'introduire de multiples mutations dans le génome en une seule expérience. Il a également une efficacité considérablement améliorée par rapport aux technologies précédentes et permet presque n'importe quel type de mutation avec facilité. Ces avantages font de la technique de recombinaison CRISPR/Cas9 la plus prometteuse pour une application en santé humaine. Cependant, des inconvénients majeurs existent, y compris, surtout, un clivage hors cible qui peut entraîner des perturbations involontaires du génome. [dix]

Intégration de la recombinaison λ-red et Cas9 Modifier

Reisch et Prather ont lancé une technique qui combine à la fois les systèmes de recombinaison λ-red et CRISPR/Cas9 pour former une nouvelle méthodologie appelée no-SCAR (Scarless Cas9 Assisted Recombineering) pour E. coli modifications du génome. Dans cette méthode, un plasmide contenant le gène pour l'expression Cas9 (cas9) est d'abord transformé en E. coli cellules. Après sélection des transformants en utilisant la résistance aux antibiotiques, un autre plasmide contenant le gène d'intérêt ciblé sous la forme de sgRNA et l'opéron λ-red est transformé. Après l'expression induite du système de recombineering λ-red, l'ADN linéaire à incorporer dans le E. coli le génome est transformé dans les cellules. L'expression de Cas9 et du sgRNA est alors induite, ce qui a pour résultat que Cas9 localise le E. coli ADN cible basé sur le complément sgRNA. Cas9 est capable d'initier une cassure double brin et le système λ-rouge est capable d'amener l'ADN linéaire à E. coli génome pour la recombinaison homologue. Les cellules sont ensuite guéries du plasmide contenant l'ARNsg spécifique, puis le plasmide suivant contenant la séquence cible d'ARNsg spécifique peut être transformé et le processus est répété. [1]

Ce système est capable de modifier rapidement de nombreux emplacements du génome. Dans les cas où un petit nombre de mutations est introduit dans le génome, l'efficacité temporelle de l'absence de SCAR est comparable à d'autres méthodes. Cependant, avec un grand nombre d'altérations, cette technique est supérieure. [1]

Plasmides Modifier

L'édition sans SCAR utilise des plasmides pour la modification du génome créés à l'aide d'un clonage circulaire par extension de polymérase. [11] En bref, dans une réaction en une étape, ce processus peut assembler et cloner plusieurs inserts dans n'importe quel vecteur et ne nécessite aucune digestion par une enzyme de restriction, ligature ou recombinaison homologue. Par conséquent, cette méthode contribue à la rentabilité et au débit du système sans SCAR.

La technique sans SCAR utilise un système à deux plasmides, car la co-transformation des deux cas9 contenant le plasmide et le plasmide sgRNA entraîne la mort cellulaire. Plus précisément, la létalité cellulaire est une conséquence du clivage de Cas9 E. coli ADN qui correspond au sgRNA. Afin de contourner ce problème, plusieurs plasmides sont utilisés afin de maintenir le contrôle expressionnel des deux cas9 et sgRNA.

Le PTET le promoteur joue un rôle intégral dans l'expression des deux plasmides. Il pilote l'expression transcriptionnelle à la fois du sgRNA d'intérêt et cas9 dans la cellule hôte lors de l'induction avec l'anhydrotétracycline (aTc). En l'absence de l'inducteur, le PTET promoteur est réprimé par la protéine répresseur tétracycline exprimée de manière constitutive (TetR). Par conséquent, la présence de TetR dans la cellule hôte avant l'introduction des deux sgRNA et cas9 est une mesure pour éviter la létalité cellulaire. [1]

Le premier plasmide utilisé dans les travaux pionniers de Reisch et Prather est composé de : le cas9 gène sous le contrôle du PTET promoteur le tetR gène, qui code pour la protéine répresseur de la tétracycline, sous le contrôle d'un promoteur constitutif et le cm r gène de résistance au chloramphénicol. Il a été observé que l'expression de fuite de Cas9 s'est produite même sans induction de la PTET promoteur. Par conséquent, pour éviter la mort cellulaire, une étiquette d'ARN messager de transfert (ssrA) a été incluse dans le plasmide en aval du cas9 gène. En cas de fuite d'expression de Cas9, l'étiquette ssrA C-terminale serait reconnue par la protéase ClpP et dégraderait Cas9 pour permettre un meilleur contrôle expressionnel de la protéine. Ensemble, ces composants constituent le plasmide pCas9cr4 et permettent le ciblage du chromosome de la cellule hôte. [1]

Le deuxième plasmide utilisé dans la méthode sans SCAR est constitué de : le sgRNA d'intérêt exprimé sous le contrôle du PTET promoteur les trois gènes qui composent le système λ-rouge (exo, bet et gam) sous le contrôle du Parabe promoteur, qui est induit par l'arabinose et le gène conférant la résistance aux aminosides, comme la spectinomycine et la streptomycine. Ces composants constituent le plasmide pKDsg-XXX pour faciliter les altérations médiées par le rouge du E. coli génome, où -XXX désigne la séquence ciblée à modifier. [1]

En résumé, théoriquement, les plasmides à utiliser dans cette méthode peuvent être construits pour permettre une personnalisation absolue du protocole. Une condition est que chacun des deux plasmides construits doit avoir des marqueurs sélectionnables distincts, tels que des gènes conférant une résistance à deux antibiotiques différents, pour permettre une sélection et une contre-sélection ciblées. De plus, le plasmide pCas9cr4 peut être acheté auprès d'Addgene (ID 62655) pour une mise en œuvre directe dans une expérience de recombinaison sans SCAR, et les plasmides pKDsgRNA-p15 (ID 62656) et pKDsgRNA-ack (ID 62654) peuvent également être achetés auprès d'Addgene.

Transformations Modifier

La prochaine étape du protocole sans SCAR consiste à transformer les plasmides pCas9cr4 et pKDsg-XXX et les oligonucléotides linéaires en E. coli cellules elles-mêmes. Pour ce faire, les cellules sont conçues pour être électrocompétentes. Une telle méthode, telle qu'utilisée par Reisch et Pather, utilise un gradient de densité glycérol/mannitol, qui est rapide et simple. [12] Cela permet la transformation par électroporation et introduction des plasmides et de l'ADN dans les cellules.

Afin d'augmenter l'efficacité de la transformation, les cellules transformées sont cultivées dans un bouillon super optimal pour accélérer le processus de récupération après transformation. Dans cette méthode, deux transformations ultérieures doivent être effectuées afin d'incorporer les plasmides pCas9cr4 et pKDsg-XXX nécessaires à la recombinaison. En effet, des études préliminaires ont révélé que lorsque Cas9 et sgRNA étaient exprimés en même temps sans que l'ADN linéaire soit incorporé dans le génome, la mort cellulaire était induite en raison de la perturbation du gène crucial. [1] Par conséquent, l'expression de la machinerie de recombinaison et de l'ARN sg a été maintenue sous contrôle strict et transformée progressivement pour réduire la létalité cellulaire.

Pour s'assurer que le plasmide pCas9cr4 a d'abord été admis avec succès dans les cellules, les cellules ont été cultivées sur une plaque contenant du chloramphénicol, le plasmide pCas9cr4 contenait le gène cm r , conférant une résistance au chloramphénicol, ce qui a garanti que seuls les recombinants réussis se sont développés. Des plaques en triple de 10μL de cultures récupérées ainsi que des dilutions de 10 -1 , 10 -2 et 10 -3 ont ensuite été repérées et incubées pendant la nuit à 30 ° C et CFU, ou unité formant colonie, des évaluations ont ensuite été faites pour identifier les mutants réussis en utilisant le procédé de placage miniaturisé décrit précédemment. [13] Une fois que la mutation d'intérêt a été criblée en utilisant une croissance d'une nuit sur des plaques de milieu minimal M9 additionnées de glycérol, de chloroacétate et de SOC (bouillon super optimal avec répression des catabolites), les colonies ont été patchées sur des plaques sélectives à l'aide d'un cure-dent et incubées à 30 °C pendant deux nuits. [1] Après une croissance suffisante des colonies, les cellules ont été transfectées avec le plasmide pKDsg-XXX contenant le aada gène et, par conséquent, étaient résistants aux aminosides spectinomycine et streptomycine. Pour s'assurer que le plasmide pKDsg-XXX a été admis avec succès dans les cellules, les cellules ont été cultivées sur une plaque contenant à la fois du chloramphénicol et de la spectinomycine pour sélectionner les cellules contenant à la fois les plasmides pCas9cr4 et pKDsg-XXX.

Après une recombinaison réussie de l'ADN linéaire avec le génome cible, les origines et les marqueurs plasmidiques peuvent être réutilisés grâce à la méthode de durcissement du plasmide. Le pKDsgRNA contient un cadre de lecture ouvert sensible à la température qui, lorsqu'il est cultivé à 37°C, dénature le plasmide. Cela permet un durcissement facile du plasmide qui n'inclut aucun réactif supplémentaire. Ceci est utile car lors du durcissement du plasmide pKDsg-XXX, un autre plasmide pKDsg-XXX avec un ARNsg différent peut ensuite être transfecté dans le E. coli cellules pour introduire d'autres mutations dans les séquences cellulaires cibles. Une fois toutes les mutations introduites, les deux plasmides doivent être guéris. Malheureusement, le plasmide pCas9cr4 ne possède pas de mécanisme de durcissement inhérent. Reisch et Prather ont donc lancé un mécanisme de durcissement du plasmide en introduisant un pKDsgRNA dont le sgRNA est complémentaire du plasmide pCas9cr4. Plus précisément, ils ont construit un pKDsg-p15A qui ciblait l'origine de réplication p15A du plasmide pCas9cr4. Une fois les recombinants sélectionnés, l'expression de Cas9 et d'ARNsg a été induite avec l'ajout d'aTc. Après étalement sur des plaques sélectives et croissance à 37 ° C, ils n'ont observé aucune formation de colonie sur les plaques LB contenant du chloramphénicol indiquant la perte du plasmide pCas9cr4 en raison d'une rupture double brin induite par Cas9 dans le plasmide. Des mini-préparations de plasmides supplémentaires ont démontré qu'aucun des deux plasmides n'était retenu dans les cellules, ce qui indique donc un durcissement du plasmide. Cette technique peut facilement être appliquée au durcissement d'autres plasmides également. [1]

Recombinaisons Modifier

Les oligonucléotides utilisés pour les recombinaisons ultérieures doivent suivre plusieurs directives pour aider à maximiser le succès. [14]

Premièrement, la longueur optimale d'oligo pour l'ADN linéaire transfecté doit être comprise entre 60 et 90 paires de bases. Cette ligne directrice est basée sur des observations précédentes selon lesquelles cette longueur a l'efficacité de remplacement allélique la plus élevée. Les oligos plus longs ont tendance à former des structures en épingle à cheveux qui sont non seulement inhibitrices, mais également plus coûteuses à synthétiser. Les oligos plus courts ont des énergies d'hybridation plus faibles, ce qui entraîne une stabilité réduite de l'oligo vis-à-vis de la cible chromosomique. De cette séquence, au moins 15 paires de bases doivent être homologues à la séquence cible aux extrémités 5' et 3' pour fournir un annelage oligo suffisant. [14]

Une autre considération est l'inclusion de liaisons phosphorothioate. Dans une liaison phosphorothioate, l'un des oxygènes non pontants entre les bases nucléotidiques est remplacé par un atome de soufre, modifiant les propriétés chimiques. Cette modification est nécessaire dans la conception des oligo car elle entraîne une diminution de la sensibilité à la dégradation des exonucléases. Au maximum, quatre de ces liaisons doivent être situées près de l'extrémité 5' de l'oligo. [14] Trop de liaisons phosphorothioates peuvent être problématiques, chaque site modifié crée un centre chiral, ce qui peut conduire à un mélange racémique d'isomères avec des caractéristiques et des propriétés variables. [15] [16]

Une optimisation supplémentaire peut être obtenue en concevant des oligos qui ciblent le brin en retard dans la réplication de l'ADN, car le ciblage du brin en retard entraîne une fréquence plus élevée de recombinants. Dans la réplication de l'ADN, les amorces d'ARN doivent être insérées le long du brin retardé afin que l'ADN polymérase soit capable de synthétiser le brin dans la direction 5 'à 3'. Cette synthèse discontinue a pour résultat que le brin retardé est plus exposé, ce qui permet un annelage à médiation bêta plus facile de l'oligo à l'ADN cible que par rapport à l'annelage au brin principal. [14]

Enfin, la machinerie de réparation des mésappariements (MMR) offre une protection inhérente à la cellule contre les mésappariements des bases nucléotidiques. Par conséquent, toute mutation introduite dans les oligonucléotides peut être ciblée par le MMR. Il existe plusieurs façons d'éviter cela. Premièrement, l'utilisation d'une souche d'E. coli déficiente en ROR permettra d'éradiquer ce problème. Cependant, cela entraîne également un taux plus élevé d'autres mutations aléatoires dans tout le génome. Une autre méthode pour réduire la réparation des mésappariements consiste à enterrer les mutations d'intérêt dans d'autres mutations silencieuses. Étant donné que les mutations silencieuses ne provoquent pas souvent d'effets catastrophiques, elles sont mal détectées par la machinerie MMR. [17] La ​​présence de bases modifiées aidera également à échapper à la machinerie MMR car elles ne sont pas reconnues. [14] Enfin, de longs segments de mutations seront moins affectés par de courts segments de mutations. [14]

Les oligonucléotides transformés sont incorporés dans l'ADN cellulaire par recombinaison homologue médiée par l'-rouge et l'endonucléase Cas9. [1] Le rouge est activé lorsque l'arabinose se lie à l'AraC exprimé, induisant la dimérisation de la protéine AraC et la liaison subséquente à l'ADN pour activer le promoteur [18] avant la transfection de l'oligonucléotide. Cette étape est suivie de l'expression induite de la nucléase Cas9 et du sgRNA par liaison de l'anhydrotétracycline au PTET promoteur. Cas9, avec les conseils du sgRNA transformé, identifie le E. coli complément de la séquence cible et initie une cassure double brin. Un aspect crucial est que le gène cible doit être à proximité immédiate en amont de la séquence PAM. [19] Heureusement, la séquence PAM NGG se produit à 424 651 instances sur les deux brins du E. coli chromosome, de sorte que cette méthode n'est pas limitée dans sa spécificité ciblée. [20]

Pendant ce temps, le gam dimérisé se lie aux nucléases RecBCD et SbcCD de l'hôte, inhibant toutes leurs activités connues, ce qui empêche la dégradation de l'ADN étranger linéaire. [21] λ exo se lie à l'ADN transformé linéaire double brin et le dégrade progressivement dans une direction 5 'à 3'. Exo est une protéine trimère globulaire qui forme un anneau avec un centre creux qui positionne l'ADN linéaire pour le clivage. Un côté de l'anneau est suffisamment grand pour admettre de l'ADN double brin, mais l'autre extrémité ne peut accueillir que de l'ADN simple brin, fournissant ainsi des détails sur le mécanisme d'action exo. Ce processus entraîne des surplombs 3' simple brin sur l'ADN linéaire. [22] Par la suite, bêta, un membre d'une famille de recombinases, se lie aux surplombs 3' et médie l'hybridation avec le complément E. coli ADN. Ce processus se produit par l'invasion du surplomb 3' simple brin dans l'ADN cible complémentaire sur le brin retardé pendant la synthèse de l'ADN, permettant l'hybridation facilitée par bêta. [23]

En résumé, ce protocole permet un ciblage du génome quasi illimité à condition de tenir compte d'une condition : cette méthode se limite au ciblage E. coli séquences qui sont situées directement en amont d'une séquence PAM NGG, des expériences doivent donc être conçues pour tenir compte de cette restriction.

Écran PCR Modifier

Une fois les colonies sélectionnées, les transformants sont génotypés à l'aide d'une PCR spécifique à l'allèle. [24] Dans ce processus, une amorce PCR mutante est utilisée pour sélectionner le mutant par rapport au génotype de type sauvage. Si le génotype mutant est présent, il s'hybride à l'extrémité 3' de l'amorce PCR tandis que le génotype de type sauvage donne un ADN non apparié à l'extrémité 3'. Le décalage entre l'extrémité 3' de l'amorce et le type sauvage empêche l'extension de l'amorce et ainsi, seul le génotype mutant produit un produit PCR. La polymérase Hotstart Taq dépourvue d'activité exonucléase 3' à 5' a été utilisée pour la PCR de colonie des mutants putatifs. [1]

La méthode sans SCAR est capable d'induire des mutations ponctuelles, des délétions médiées par des oligonucléotides et des insertions de séquences courtes avec une grande efficacité. Dans le cas de mutations ponctuelles, les oligonucléotides ciblés sur le brin retardé sont conçus pour modifier la séquence PAM ou les séquences protospacer dans les 12 paires de bases du PAM car il s'agit de la région la plus importante pour la spécificité Cas9. [1] Avec ce processus, des mutations non-sens et faux-sens sont possibles. Cependant, les transformations ultérieures diffèrent entre les mutations non-sens et faux-sens : les doubles transformations, où le plasmide pCas9cr4 et l'oligonucléotide sont transformés simultanément, sont plus efficaces pour les mutations non-sens tandis que les transformations simples, où chaque plasmide et oligonucléotide sont transformés indépendamment, sont mieux adaptées aux mutations faux-sens. [1] comme démontré par PCR sur colonie. La méthode est également capable de supprimer avec succès de grandes régions d'ADN chromosomique à l'aide d'oligonucléotides conçus avec une homologie en amont et en aval de la zone de délétion. Dans le cas des délétions, un seul protocole de transformation est plus efficace et montre un taux de délétion de 100 % après PCR sur colonie. [1] Des travaux supplémentaires devraient être poursuivis pour déterminer les causes des différentes efficacités de transformation pour divers types de mutation.

Des insertions de séquences courtes sont également possibles en utilisant la méthode sans SCAR. Afin de contourner les contraintes de longueur des oligonucléotides, des séquences d'ADNdb linéaires sont utilisées pour insérer des fragments dans le chromosome. Parce que le système utilise un plasmide qui exprime les gènes exo et gam du système λ-red, il est capable d'utiliser des techniques de recombinaison d'oligonucléotides pour l'insertion de séquences. Plus précisément, les brins d'ADNdb facilitent l'insertion par le mécanisme d'intermédiaires simple brin au niveau de la fourche de réplication. Les méthodes précédentes réussissaient à insérer 30 pb dans le chromosome [25] tandis que la méthode sans SCAR était capable d'insérer une séquence dix fois plus grande (300 pb). Plus important encore, les écrans PCR ont identifié un taux d'insertion de 100 % dans trois expériences distinctes. [1] Bien que l'efficacité de la recombinaison diminue avec le temps, [26] la méthode sans SCAR devrait faciliter avec succès les insertions de séquences de plus de 1 kB. [1]

Limitations Modifier

Le système actuel n'est pas capable de sélectionner simultanément plus d'une cible [1] en raison des difficultés rencontrées dans les méthodes de clonage indépendantes de la synthèse de l'ADN et de la ligature. Essentiellement, cela signifie que les séquences hautement répétitives nécessaires pour plusieurs ARNsg dans un seul plasmide sont limitées par des défauts dans la machinerie biologique nécessaire pour les exprimer et les cibler sur plus d'une cible. Des améliorations futures sont nécessaires pour permettre des manipulations génomiques simultanées en utilisant plusieurs ARNsg distincts dans un seul plasmide.

Les défis sous-jacents à la recombinaison plasmidique et à la perte de séquences de protoespaceurs ont également un impact sur la méthode sans SCAR et nécessitent des améliorations supplémentaires. [1] Une mauvaise recombinaison plasmidique sous-tend la fréquence des difficultés d'échappement qui peuvent avoir un impact sur l'efficacité de la manipulation génétique.

Recherche Modifier

La méthode sans SCAR est plus efficace que les techniques de clonage standard, y compris la recombinaison ADNsb [27] ainsi que d'autres techniques d'édition du génome sans cicatrice. La méthode permet un nombre illimité d'altérations génomiques en une seule étape sans l'utilisation de marqueurs sélectionnables. Le grand avantage de la méthode, notamment en termes d'applications de recherche, est la rapidité du protocole.Dans l'article fondateur de Reisch et Prather, la méthode sans SCAR a nécessité 5 jours de travail, y compris l'étape de clonage nécessaire au ciblage des sgRNA. Une fois que les cellules contiennent le plasmide pCas9cr4, les expériences suivantes peuvent être réalisées en aussi peu que 3 jours, ce qui permet une édition rapide du génome. Actuellement, la méthode sans SCAR est plus rapide que toute autre méthode publiée [1] et constitue une option intéressante pour les chercheurs intéressés à étudier les effets de nombreuses modifications.

Comparée spécifiquement à d'autres techniques d'édition du génome sans cicatrice, y compris la méthode publiée par Datsenko et Wanner, [2] la méthode sans cicatrice prend moins de temps lorsque plusieurs mutations sont souhaitées. Deux composants de la méthode assurent la médiation de cette capacité de mutation rapide. Premièrement, le plasmide pCas9cr4 est retenu dans les cellules après la première itération empêchant ainsi la transfection répétitive du plasmide dans les cellules. Dans les cas où trois modifications du génome sont souhaitées, par exemple, cela signifie que la méthode sans SCAR est capable de médier ces mutations quatre jours plus rapidement que la méthode la plus rapide suivante. [1] Deuxièmement, le gène de type sauvage n'est jamais retiré du chromosome. Cela signifie que le criblage par PCR est capable d'identifier plus rapidement de nombreux mutants, car les gènes essentiels de type sauvage peuvent être ciblés facilement.

Santé humaine Modifier

La découverte du système d'édition du génome CRISPR/Cas9 a révolutionné la recherche génétique. En termes de santé humaine, il a des applications à la fois pour des maladies spécifiques ainsi que pour des systèmes de cellules souches qui modélisent ces mêmes maladies. Dans la recherche sur les cellules souches, le système CRISPR a été appliqué avec succès à un large éventail de maladies. Les mutations du répresseur transcriptionnel CTCF à partir de cellules souches intestinales cultivées de patients atteints de mucoviscidose ont été corrigées à l'aide de CRISPR/Cas. [28] Les applications ultérieures se sont appuyées sur de simples corrections de séquences et ont réussi à réparer une anomalie d'inversion chromosomique dans l'hémophilie A. [29] Les deux applications démontrent l'utilité d'associer CRISPR/Cas à des modèles de cellules souches dans l'étude et le traitement des maladies génétiques. Avec l'avènement des cellules souches pluripotentes induites par le patient (iPSCs), l'applicabilité de CRISPR/Cas est encore renforcée. À ce jour, les méthodes CRISPR ont réussi à réparer les mutations génétiques associées à la maladie dans 1) les troubles métaboliques tels que la -thalassémie, [30] 2) les déficiences immunologiques telles que le déficit immunitaire combiné sévère (SCID) [31] et 3) les maladies neuromusculaires telles que Duchenne dystrophie musculaire. [32] Les corrections de ces mutations génétiques, plus important encore, sont de futurs véhicules potentiels pour les thérapies cellulaires et géniques où les propres cellules souches réparées du patient peuvent être réimplantées. La méthode no-SCAR, en tant qu'amélioration du système CRISPR/Cas, jouera un rôle important dans la modélisation des maladies humaines à l'aide de cellules iPS et, à l'avenir, dans le traitement de ces mêmes maladies.


Génie génétique médié par CRISPR/Cas9 en biologie industrielle

Les micro-organismes industriels peuvent produire divers produits chimiques à valeur ajoutée à partir de matières premières à faible coût, notamment de la biomasse renouvelable et des déchets organiques (Yao et al., 2018). Pour améliorer les performances des micro-organismes industriels, des modifications génétiques ont généralement été mises en œuvre pour construire les usines de cellules microbiennes souhaitées. Bien que diverses méthodes soient disponibles pour les modifications génétiques, cela prend du temps et demande beaucoup de travail. Heureusement, en tant que cadeau surprenant, le système CRISPR/Cas9 a considérablement amélioré l'efficacité du génie génétique. Ici, nous avons examiné les applications du système CRISPR/Cas9 dans les bactéries, les levures et les champignons filamenteux avec un accent particulier sur E. coli et S. cerevisiae, qui étaient l'usine de cellules la plus couramment utilisée.

L'application de CRISPR/Cas9 dans les bactéries

Escherichia coli est souvent utilisé pour produire une variété de produits chimiques, de médicaments et de biocarburants de valeur en biotechnologie industrielle. Une méthode traditionnelle de knock-out de gène dans E. coli était d'adopter le système de recombinaison homologue Red pour médier la recombinaison homologue de l'ADN. Cependant, il est inefficace et surtout pas adapté à la recombinaison de plusieurs sites (Murphy et Campellone, 2003). Pour améliorer l'efficacité du génie génétique, Jiang et al. construire un système triple plasmide comme mentionné ci-dessus. Ce nouvel outil de génie génétique a considérablement amélioré l'efficacité de la modification génétique et ainsi accéléré le développement de la biologie industrielle. Dans des études précédentes, Cas9 et l'ARNg étaient exprimés dans deux plasmides, respectivement, car l'expression simultanée pèserait sur le métabolisme de l'organisme et entraînerait la mort cellulaire. Par conséquent, Cas9 ou ARNg doivent être réprimés avant un événement d'édition du génome. Cas9 et l'ARNg peuvent être assemblés dans un plasmide contenant un promoteur pBAD, qui est réprimé par le glucose et induit par l'arabinose et un réplicon sensible à la température repA101ts, de sorte que transformé E. coli pouvaient croître sur des plaques modifiées au glucose et être éditées sous induction avec 2 g/L d'arabinose. Cette procédure rapide et facile d'édition du génome pouvait fonctionner en continu, car plusieurs loci ne nécessitaient qu'une construction de plasmide et une étape de transformation. Pour améliorer davantage l'efficacité d'édition simultanée de plusieurs loci, une technique d'édition du génome multiplex assistée par CRISPR/Cas9 a été développée. La technique d'édition du génome multiplex assistée par CRISPR/Cas9 contenait trois plasmides : pRedCas9 contenant à la fois la recombinaison λ-Red et le système Cas9 sous le contrôle du promoteur pBAD, des pMgRNA contenant des gRNA et des pDonorDNA portant des cassettes d'ADN de donneurs multiples (Feng et al., 2018). Dans une autre étude polyvalente, Li et al. d'abord coexprimé un plasmide contenant un ARNg ciblant le bla gene et Cas9 avec le système de recombinaison λ-Red en E. coli (Li et al., 2015). Ensuite, l'édition génétique a commencé avec la cotransformation de l'ADN du donneur et du plasmide ARNg dans les cellules précédentes. Comparé au système précédemment établi, ce système optimisé a une efficacité d'édition de gènes plus élevée et moins de temps de fonctionnement, presque 100 % pour les remplacements de codons et les gènes knock-out dans les 2 jours. Il est à noter que l'utilisation d'un ADN double brin comme matrice donneuse a de meilleures performances qu'un ADN simple brin dans les délétions de gènes. Par la suite, ce système optimisé a été utilisé pour renforcer la voie MEP en substituant les promoteurs et les sites de liaison du ribosome, en insérant une voie de biosynthèse hétérologue du β-carotène et en optimisant le métabolisme central du carbone (Li et al., 2015). Enfin, le meilleur producteur a produit 2,0 g/L de β-carotène en fermentation fed-batch. Ce vaste travail peut difficilement être mené à bien sans l'utilisation d'outils basés sur CRISPR, révélant leur grand potentiel pour une manipulation efficace et diversifiée de l'ADN génomique. La méthode de recombinaison Cas9 a été davantage exploitée avec le développement de l'outil d'ingénierie du génome traçable activé par CRISPR (CREATE) (Garst et al., 2017). Application de cet outil dans E. coli a permis la transformation simultanée de plusieurs bibliothèques de modèles recombinés à base de plasmides (Garst et al., 2017). La stratégie CREATE a été utilisée pour construire des bibliothèques génomiques de la voie de l'isopropanol en introduisant de multiples variations du site de liaison du ribosome dans E. coli, conduisant à la construction et au test de ߡ 000 souches en quelques jours. Le plus performant a atteint un titre de 7,1 g/L d'isopropanol en 24 h (Liang et al., 2017).

Outre les applications polyvalentes dans E. coli, les outils basés sur CRISPR ont également eu des performances satisfaisantes dans d'autres bactéries (tableau 1). Par exemple, les technologies de génie génétique pour la solvabilité Clostridium étaient encore immatures en raison d'une faible efficacité de transformation, d'une recombinaison homologue endogène inadéquate et d'une physiologie et d'un métabolisme mal compris (Papoutsakis, 2008 Pyne et al., 2014 Bruder et al., 2016). Récemment, CRISPR/Cas9 pour Clostridium saccharoperbutylacétonicum N1-4, une souche productrice d'hyper-butanol, a été développée. L'efficacité de l'ingénierie du génome a été améliorée de 20 à 75 % en sélectionnant le promoteur P optimiséJ23119 de E. coli pour l'expression de l'ARNg. Après avoir supprimé deux gènes essentiels de la phosphotransacétylase (ATP) et la butyrate kinase (BUK) pour la production d'acétate et de butyrate, la production de butanol a atteint 19,0 g/L, ce qui est l'un des niveaux les plus élevés jamais rapportés pour les fermentations discontinues (Wang et al., 2017). Cet outil d'édition basé sur Cas9 pourrait être facilement adapté pour être utilisé dans des micro-organismes étroitement liés, ouvrant la voie à l'élucidation du mécanisme de production de solvant et à la construction de souches robustes dotées de caractéristiques souhaitables de production de butanol. En outre, les outils d'édition basés sur Cas9 ont également été utilisés avec succès pour la production de produits chimiques en vrac, tels que le succinate dans Synechococcus allongé (Li et al., 2016), l'isopropanol-butanol-éthanol dans Clostridium acetobutylicum (Wasels et al., 2017) et l'acide γ-amino-butyrique (GABA) dans Corynebacterium glutamicum (Cho et al., 2017). La large application du système CRISPR/Cas9 dans une variété de genres de bactéries démontre qu'il joue un rôle essentiel dans le développement prospère de la bioindustrie.

Tableau 1. Applications du système CRISPR/Cas9 chez les bactéries.

L'application du système CRISPR/Cas9 dans les levures

Les levures jouent un rôle essentiel dans la biologie industrielle, car une large gamme de produits peut être produite par les levures, notamment les produits biopharmaceutiques, les biocatalyseurs, les additifs alimentaires, la chimie fine et les biocarburants renouvelables (Raschmanova et al., 2018). En raison de leur physiologie robuste, les levures peuvent être cultivées dans des conditions de croissance difficiles, telles qu'un pH bas et des températures élevées. De plus, les levures peuvent être introduites dans des systèmes de modification post-traductionnelle eucaryotes complexes, absents chez les hôtes bactériens et souvent vitaux pour la production de produits biopharmaceutiques (Thomas et al., 2013). Jusqu'à présent, une série d'outils de génie génétique basés sur CRISPR/Cas9 avaient été exploités chez la levure pour améliorer l'efficacité de la modification génétique (Mitsui et al., 2019).

Depuis des décennies, S. cerevisiae est un organisme modèle bien connu dans les domaines de la recherche et des applications (Jakočiunas et al., 2016). Pour vérifier l'efficacité du système CRISPR/Cas9 dans S. cerevisiae, le marqueur sélectionnable négatif génomique endogène CAN1 (codant pour l'arginine perméase) peut être choisi comme gène cible (Dicarlo et al., 2013). Pour améliorer encore l'efficacité du knock-out du gène, des oligonucléotides double brin de 90 pb (dsOligo) comprenant des bras homologues au site cible et un codon d'arrêt interne comme matrice HR ont été conçus. La fréquence recombinée des mutations sélectionnées dans le milieu contenant de la canavanine (un analogue toxique de l'arginine qui peut tuer les cellules contenant des fonctions CAN1 gène) était de près de 100 %, fournissant les bases d'outils d'ingénierie génomique simples et puissants dans les levures. Ce système peut être utilisé pour assommer LEU2, TRP1, URA3, et HIS3 en levure industrielle polyploïde S. cerevisiae ATCC 4124 avec une efficacité allant jusqu'à 60%, et une souche quadruple déficiente (Δura3, Δtrp1, Δleu2, Δson3) a été construit avec succès (Zhang et al., 2014). Afin d'améliorer encore l'efficacité de l'édition génétique du système CRISPR/Cas9, la technologie de clonage USER a donc été utilisée pour assembler plusieurs ARNsg dans un plasmide pour une perturbation efficace des gènes et une ingénierie des promoteurs d'un à cinq loci cibles en une seule étape (Jakočiunas et al., 2015a). Cette approche d'édition du génome sans fabricant en une seule étape a permis d'atteindre des rendements élevés de 50 % à 100 % d'éditions simples à quintuples. Cependant, la faible efficacité de la cotransformation des plasmides gRNA et des donneurs HR correspondants a entravé les applications d'ingénierie du génome à grande échelle (Lian et al., 2018). Pour résoudre ce problème, un système CRISPR intégré à l'homologie (HI-CRISPR) en fusionnant une matrice HR de 100 pb à l'extrémité 5 & 02032 des séquences d'ARNcr a été construit, conduisant à une efficacité de 87 % du knock-out multiplex de CAN1, ADE2, et LYP1 (Bao et al., 2015). Ce système HI-CRISPR a encore amélioré l'efficacité de l'édition du génome multiplex et de l'ingénierie à l'échelle du génome.

En plus du knock-out du gène, le système CRISPR/Cas9 peut également médier l'insertion du gène en utilisant le bras homologue de l'ADN du donneur au gène cible. Pour mieux contrôler les niveaux cellulaires de sgRNA replié correctement, le ribozyme du HDV a été fusionné à l'extrémité 5′ du sgRNA pour protéger l'extrémité 5′ du sgRNA des 5′ exonucléases. Cette stratégie d'expression du HDV-gRNA a considérablement augmenté l'efficacité de l'édition multiplexe du génome dans les souches de levure diploïdes, dans lesquelles le transporteur hétérologue de cellodextrine (cdt-1) et endogène β-glucosidase (gh1-1) ont été insérés. En conséquence, l'efficacité d'utilisation du cellobiose a été multipliée par 10 grâce à la mutagenèse dirigée de cdt-1 et gh1-1 gènes via le système CRISPR/Cas9 multiplexé (Ryan et al., 2014). Pendant ce temps, Ronda et al. cotransformé un vecteur épisomique exprimant trois ARNg avec trois ADN donneurs contenant les gènes de synthèse du β-carotène de BTS1, crtYB, et crtI dans S. cerevisiae, lui permettant de synthétiser le β-carotène (Ronda et al., 2015). De même, trois gènes exogènes (XYL1, XYL2, et XYL3) codant pour la xylose réductase, la xylitol déshydrogénase et la xylulokinase de Scheffersomyces stipites ont été intégrés dans les loci de PHO13 et ALD6 dans S. cerevisiae en utilisant le système CRISPR/Cas9 (Tsai et al., 2015). Les souches refactorisées ont atteint la capacité d'utiliser le xylose et pourraient être facilement utilisées pour des fermentations à grande échelle, car aucun marqueur résistant aux antibiotiques n'a été adopté. De plus, un outil d'ingénierie du génome plus polyvalent, l'intégration multiloci facilitée par Cas9 de in vivo des parties d'ADN assemblées (CasEMBLR) ont été construites en combinant l'assemblage d'ADN, la RH des DSB à l'aide d'ADN de donneurs et des cassettes d'expression d'ARNg multiplex (Jakočiunas et al., 2015b). Comme preuve de concept, ce CasEMBLR a été utilisé pour assembler et intégrer les cassettes d'expression génique (bras d'homologie en amont, promoteur, gène de structure, terminateur et bras d'homologie en aval) de CrtYB, CrtI, et CrtE dans les lieux de ADE2, HIS3, et URA3, avec une efficacité d'ingénierie sans marqueur de 31 %.

CRISPR/Cas9 a également été mis en œuvre dans de nombreuses autres levures industrielles (tableau 2). Par exemple, pour construire des promoteurs plus appropriés pour l'ARNsg dans Schizosaccharomyces pombe, Jacobs et al. construit une cassette d'expression en ajoutant l'ARN leader de rrk1 entre le promoteur et la séquence sgRNA, et fusionné les ribozymes HH avec l'extrémité 3′ du sgRNA mature pour obtenir un traitement correct du sgRNA 3′. Ce système a atteint une efficacité élevée de 98% lorsqu'un modèle de donneur a été cotransformé. Pour simplifier davantage le fonctionnement du système CRISPR/Cas9 dans S. pombe, Zhang et al. a développé une procédure sans clonage comprenant un plasmide encodant Cas9 avec des lacunes et un insert sgRNA amplifié par PCR. Ura4 et rrk1 le promoteur-leader était juste entre l'écart du plasmide codant pour Cas9. L'insert de sgRNA amplifié par PCR était composé d'une séquence cible de sgRNA et d'un échafaudage, et flanqué des bras homologues de ura4 et promoteur-leader. En conséquence, un plasmide circulaire comprenant Cas9 et sgRNA pourrait générer deux fragments réparant les lacunes. Cette procédure sans clonage pourrait modifier la séquence cible sgRNA uniquement en utilisant un premier sgRNA de 83 pb au lieu de cloner l'intégralité du plasmide sgRNA.

Tableau 2. Applications du système CRISPR/Cas9 dans la levure.

Les applications du système CRISPR/Cas9 dans les champignons filamenteux

En raison de la valeur économique considérable de leurs métabolites, les champignons filamenteux ont été appliqués pour produire des antibiotiques, des acides organiques, des pigments, des acides gras polyinsaturés, etc. (Dufossé et al., 2014 Ji et al., 2014 Xu X. et al., 2015). Cependant, les défis de la livraison à travers la paroi cellulaire fongique et le manque de promoteurs et de plasmides disponibles ont entravé le développement d'outils de génie génétique dans les champignons filamenteux. De plus, la faible efficacité d'édition et la grande quantité de temps de travail qui en résulte ont entravé l'application ultérieure de champignons filamenteux dans l'industrie. L'émergence CRISPR/Cas9 a apporté une percée pour la manipulation génétique dans les champignons filamenteux.

Les stratégies conventionnelles de génie génétique pour améliorer l'efficacité des RH consistaient à supprimer KU70 ou KU80 hétérodimère (Weld et al., 2006). Toutefois, si KU70 ou KU80 est interrompu, les champignons filamenteux deviendront plus sensibles aux environnements de croissance avec des exigences spécifiques pour certains produits chimiques, tels que la phléomycine, la bléomycine et le méthanesulfonate de méthyle/éthyle (Liu et al., 2015). Pour surmonter cet obstacle, le système CRISPR/Cas9 dans le champignon filamenteux de Trichoderma reesei en utilisant un codon optimisé spécifique et in vitro La transcription de l'ARN a été établie (Hao et Su, 2019). La fréquence la plus élevée de FC unique en T. reesei l'utilisation d'une paire de bras d'homologie �-bp était de presque 100 %. Par la suite, un système de jointure par microhomologie basé sur CRISPR/Cas9 dans Aspergillus fumigatus a également été établi en flanquant le sgRNA avec HH et HDV. Ce système a obtenu une édition précise du gène cible avec une efficacité élevée de 95 % 02013 100% via des bras d'homologie très courts (&# x0007E35-bp), indiquant qu'il peut fonctionner comme un outil d'édition du génome puissant et polyvalent dans A. fumigatus (Zhang et al., 2016). En plus de l'application réussie dans différentes espèces de Aspergillus, ce système évolué a également été utilisé dans plusieurs espèces de champignons filamenteux différentes, élargissant l'application du système CRISPR/Cas9 (Hao et Xia, 2015 Weber et al., 2016 Weyda et al., 2017).

Dans l'ensemble, la technologie d'édition de gènes médiée par CRISPR/Cas9 a non seulement édité efficacement un gène cible individuel, mais a également montré des performances satisfaisantes dans l'édition multigénique, ce qui a grandement favorisé le développement de manipulations génétiques chez les champignons filamenteux.


Procédures expérimentales

Souches bactériennes et milieux

Tous E. coli les souches ont été cultivées en routine dans du bouillon Lysogénie (LB) ou sur des plaques de gélose LB incluant des suppléments antibiotiques selon le cas (100 g ml -1 ampicilline 100 g ml -1 hygromycine 20 g ml -1 chloramphénicol 150 g ml -1 streptomycine). Le clonage et la propagation des plasmides ont été effectués en utilisant E. coli DH5α (NEB). Toutes les souches bactériennes utilisées ou créées dans cette étude sont répertoriées dans le tableau S5.

Construction de plasmides

pSIMcpf1 a été construit par modification de pSIM18 (Chan et al., 2007 ) pour ajouter une copie optimisée pour les codons de Acidaminocoque sp. BV3L6 cpf1 (Rousset et al., 2016 Swainston et al., 2018 ) exprimé à partir du promoteur constitutif BBa_J23151, et une puce Cpf1 CRISPR inductible par l'arabinose incorporant deux séquences d'espacement ciblant l'origine de réplication pMB1. pTF a été construit en modifiant pTargetF (Qi et al., 2013) pour remplacer la cassette sgRNA Cas9 par une puce Cas12a CRISPR utilisant un fragment d'ADN synthétique. pTF-lacZ a été construit en modifiant pTF pour ajouter un ADN synthétique contenant une double puce CRISPR, ciblant deux PAM dans le E. coli lacZ et des bras homologues de 500 pb flanquant ces séquences. Un rfp gène en aval du promoteur PJS23100 avec des terminateurs flanquants a été cloné entre deux bras homologues. Le fragment a été conçu pour avoir des séquences de préfixe (actctagagaattca) et de suffixe (atctacaagagtaga) de 15 pb, qui permettent le clonage direct dans le vecteur pTF linéarisé par PCR inverse avec les amorces pTFopen-F/R via le clonage InFusion (Takara Bio Inc.). Les plasmides CRISPRi ont été construits en clonant des fragments d'ADN synthétiques constitués de ddcpf1 A993A et matrice CRISPR en aval (ciblage rfp) entraîné par un Ptrc promoteur, dans les plasmides pBbS8c-RFP, pBbA8c-RFP, pBbS2c-RFP, pBbA2c-RFP, pBbS6c-RFP et pBbA6c-RFP 33 . Les plasmides rapporteurs RFP ont été construits par amplification PCR de 198 pb des ORF du gène cible en utilisant des amorces avec des surplombs de 15 pb (tableau S1) pour le clonage InFusion dans le plasmide pBbE11a-RFP PCR linéarisé avec les amorces pBbrfpopen-F/R.

Conception de séquences d'espacement et de tableaux

Pour les knockouts de gènes, les PAM Cas12a (TTTV) ont été identifiés approximativement au centre du gène cible, pour les knock-ins, ils ont été choisis le plus près du point d'intégration souhaité, sur l'un ou l'autre brin. Pour CRISPRi, les PAM ont été sélectionnés comme les premiers à l'intérieur de l'extrémité 5' de l'ORF sur le brin positif. Une fois le PAM identifié, l'espaceur a été conçu comme le 23 pb immédiatement en aval sur le même brin (positif).

Introduction des puces CRISPR et de l'ADNd au pTF

Les réseaux ont été conçus et synthétisés commercialement dans le cadre d'une cassette qui comprenait également tout ADNd requis (Fig. S1). Le pTF a été linéarisé par PCR avec des amorces pTF-open-F/R (tableau S1) en utilisant la polymérase CloneAmp et la cassette clonée en utilisant InFusion Cloning (Takara Bio Inc.).

Introduction d'ADN de cargaison à pTF-lacZ

L'ADN de cargaison a été amplifié par PCR à l'aide de la polymérase CloneAmp et d'amorces comprenant des séquences de préfixe (CAGGAATTCCATATG) et de suffixe (TATAGACCATTCGAG), puis cloné dans pTF-lacZ, PCR linéarisé en utilisant les amorces pTF-lacZ-cargo-F/R (tableau S1).

Introduction des baies CRISPR à pBbS8c-ddcpf1

Des matrices d'espaceurs simples ou doubles sont introduites dans pBbS8c-ddcpf1-Δ, en utilisant une PCR inverse avec des amorces conçues pour inclure des surplombs codant pour des espaceurs et un chevauchement de complémentarité de 15 pb pour le clonage InFusion. Des paires d'amorces personnalisables pour chaque plasmide (pddcpf1-crRNAins-xxx-F/R) ont été conçues pour cette PCR (tableau S1).

Édition CRISPR

pSIMcpf1 a été introduit dans la souche cible et a été utilisé pour fabriquer des cellules électrocompétentes. Une seule colonie a été inoculée dans 5 ml de LB additionné de 150 ug ml-1 d'hygromycine et cultivée pendant une nuit à 30°C sous agitation. La culture a ensuite été sous-cultivée, 1:100 dans 100 ml de milieu frais et cultivée à 30°C sous agitation jusqu'à OD600

0,2 a été atteint, après quoi il a été décanté dans 2 tubes à centrifuger de 50 ml et incubé dans un bain-marie à 42°C pendant 15 min immédiatement suivi d'une incubation dans un bain de glace/eau pendant 20 min. Les tubes ont ensuite été centrifugés à 3500 g pendant 10 min à 4°C puis le surnageant éliminé. Les culots ont chacun été remis en suspension dans 40 ml de glycérol à 10 % réfrigéré et centrifugés à nouveau, puis remis en suspension dans 1 ml de glycérol à 10 % et transférés dans des tubes à centrifuger de 1,5 ml. Chaque tube a été centrifugé à 9000 g pendant 1 min et remis en suspension à nouveau. Ceci a été répété trois fois de plus, suivi d'une remise en suspension finale dans 250 pi de glycérol à 10 % réfrigéré. Les cellules ont été soumises à une électroporation avec 50 ng de plasmides pTF et étalées sur de la gélose LB contenant 150 ug ml -1 d'hygromycine et 100 ug ml -1 de streptomycine, puis cultivées pendant 24 h à 30°C. Les séries de dilutions Miles et Misra ont été utilisées pour dénombrer les UFC pour chaque transformation. Les colonies ont été criblées pour la mutation correcte en utilisant une PCR de colonie avec des amorces conçues pour flanquer de chaque côté des sites de recombinaison. Pour éliminer les deux plasmides, une seule colonie a été inoculée dans 5 ml de LB contenant 150 µg ml -1 d'hygromycine et 0,2% de L-arabinose et incubée à 30°C sous agitation jusqu'à une DO600 de

1 avant de sous-culturer 1:1000 dans LB avec 0,2% de L-arabinose et incuber à 37°C, sous agitation pendant 16 h. Une série de dilutions de 10 fois a été préparée et 100 ul des dilutions 10 -5 et 10 -6 ont été étalés sur de la gélose LB sans antibiotique puis incubés pendant 16 h à 37°C. Typiquement, 20 colonies ont été répliquées sur trois plaques de gélose contenant de l'hygromycine, de la streptomycine ou aucun antibiotique, pour confirmer la perte des deux plasmides.

Mesures de l'expression RFP pour la régulation du gène CRISPRi

Les plasmides ont été transformés en E. coli Des colonies de DH5a/MG1655 et quadruplés ont été cultivées pendant une nuit dans 0,5 ml de milieu (contenant des antibiotiques, le cas échéant) dans un bloc de 96 puits profonds de 2,2 ml à 30°C avec agitation à 850 tr/min. Les cultures ont été repiquées 1:100 dans une plaque de microtitration à paroi noire (Greiner 655096) contenant du milieu frais (200 µl) avec ou sans supplémentation en IPTG (100 µM), L-arabinose (10 mM) et anhydrotétracycline (200 nM). Les plaques ont été scellées avec un Moisture Barrier Seal (4titude 4ti-0516), puis incubées à 30°C sous agitation à 850 tr/min pendant 16 h. Les lectures ont été effectuées à l'aide d'un lecteur de plaques CLARIOstar (BMG Biotech) pour l'absorbance (600 nm) et la fluorescence RFP (584 nm d'excitation, 607 nm d'émission).

Extraction d'ARN

pBbS8c-ddcpf1 les variantes ont été transformées fraîches en E. coli Des colonies de DH5a et en triple ont été cultivées pendant une nuit dans du LB (chloramphénicol) et utilisées pour ensemencer 5 ml de milieu frais à une dilution de 1/50 dans des tubes coniques de 50 ml. Les cultures ont été cultivées à 37°C, avec agitation à 180 tr/min, jusqu'au début de la phase logarithmique OD600 = 0,2-0,4 après quoi ils ont été induits avec 10 mM de L-arabinose et 0,1 mM d'IPTG et la croissance s'est poursuivie. Lorsque l'OD600 atteint 1-1,4 (1 h) les cultures ont été centrifugées à 21 000 g pendant 1 min, le surnageant jeté et le culot gelé dans de l'azote liquide. L'ARN a été extrait à l'aide du kit de purification d'ARN TRIzol Plus (Thermo Fisher, Waltham, MA, États-Unis) et traité à la DNase à l'aide du kit PureLink DNase (Thermo Fisher). Les culots cellulaires ont été remis en suspension dans 1 ml de TRIzol puis la méthode a été effectuée comme décrit par le fabricant avant élution dans 50 µl. Chaque échantillon a été analysé par électrophorèse capillaire à l'aide d'un Bioanalyser pour déterminer leurs nombres d'intégrité d'ARN (RIN) et les rapports 260/280 ont été déterminés à l'aide d'un Nanodrop (Thermo) (Tableau S6).

Analyse de la transcription inverse-amplification en chaîne par polymérase quantitative (RT-qPCR)

L'ADNc du premier brin a été synthétisé à partir de 100-200 ng d'ARN total amorcé avec des hexamères aléatoires en utilisant le système de synthèse SuperScript IV First-Strand (ThermoFisher) selon les instructions du fabricant. Les amorces oligonucléotidiques pour la qPCR ont été conçues à l'aide de l'outil IDT PrimerQuest et sont répertoriées dans le tableau S7, y compris les longueurs d'amplicon. La qPCR a été réalisée à l'aide de SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories Ltd., Watford, Royaume-Uni) dans des réactions de 20 l dans un système de PCR en temps réel CFX Connect (Bio-Rad Laboratories Ltd) selon le protocole du fabricant. Les paramètres quantitatifs du cycle de PCR étaient les suivants : dénaturation initiale à 98°C pendant 3 min, suivie de 40 cycles de 10 s de dénaturation à 98°C et 30 s d'annelage et d'extension à 57°C. La spécificité d'amplification a été confirmée par l'analyse de la courbe de fusion après qPCR (Fig. S6) et électrophorèse sur gel d'agarose. Toutes les réactions ont été réalisées en triple technique. Cycles de quantification (Cq) ont été calculés à l'aide du logiciel CFX Manager Version 3.0 (Bio-Rad Laboratories Ltd). L'expression des gènes cibles a été normalisée par rapport aux gènes de référence hcaT et idnT (Zhou et al., 2011 ).


Avantages du système d'édition de gènes microbiens CRISPR de GenScript

La technologie CRISPR/Cas est rapidement devenue l'un des systèmes d'édition du génome les plus simples et les plus efficaces, et lorsqu'elle est associée à la recombineering λ Red, elle présente plusieurs avantages par rapport aux stratégies d'édition les plus courantes :

  • Sans couture
  • Édition multigène : peut assommer jusqu'à 3 gènes simultanément
  • Précision jusqu'à la paire de base
  • Sélection facile : aucun marqueur sélectionnable n'est requis

Résultats

Conception de l’approche CRISPR-Cas9 ciblant l’ADN « appât »

Pour aborder l'essentialité possible des deux paralogues XS dans S. ambofaciens, une copie supplémentaire de ces gènes a été intégrée au attSite B du phage PhiC31 utilisant le vecteur pSET152 (Fichier supplémentaire 1 : Tableau S1).

Par la suite, les souches contenaient 2 copies identiques de lsr2A (SAM23877-RS19855) ou lsr2B (SAM23877-RS17060) gènes au sein de leurs génomes. Pour modifier spécifiquement le locus natif, nous avons développé une approche basée sur l'introduction d'ADN « appât » à proximité du gène cible. Ceci a été réalisé en introduisant un plasmide non réplicatif abritant les régions en amont et en aval qui entourent la copie d'intérêt dans le génome natif (Fig. 1). Cet ADN « appât » a été inséré spécifiquement au niveau du chromosome à la suite d'un seul événement de recombinaison pouvant se produire entre les régions en amont ou en aval. Cet événement de recombinaison unique peut être facilement sélectionné en introduisant un marqueur de sélection dans l'ADN « appât », la résistance à l'hygromycine dans cette étude. L'efficacité de cette première étape repose en grande partie sur la fréquence de recombinaison homologue. Celle-ci peut varier notamment en fonction de l'espèce, de la longueur des régions homologues et de la localisation du site de recombinaison au sein du génome [27,28,29].

Principales étapes de l'approche CRISPR-Cas9 ciblant l'ADN « appât » pour effectuer une édition spécifique à la copie de gènes. L'approche est basée sur l'insertion spécifique par recombinaison homologue d'un marqueur de sélection et d'un ADN étranger abritant les régions amont (« U ») et aval (« D ») entourant la copie d'intérêt. L'étoile représente les différentes conceptions possibles de l'ADN modèle utilisé pour réparer la lésion par recombinaison homologue. Pour des raisons de clarté, le schéma ne représente qu'un premier événement de recombinaison se produisant entre des séquences U mais la recombinaison homologue pourrait également avoir lieu entre des séquences D. Par la suite, un outil génétique codant pour Cas9 et un ARNsg spécifiquement dirigé contre l'ADN « appât » étranger est introduit de manière transitoire dans la souche recombinante. La cassure double brin induite par ce complexe peut être réparée par un deuxième événement de recombinaison entre les séquences U ou D, entraînant respectivement une réversion ou une édition spécifique à la copie. En l'absence d'un second marqueur de sélection à la position étoile, la distinction entre les deux situations peut être réalisée par PCR (les flèches représentent les positions des amorces). Les images montrent des résultats représentatifs de la PCR réalisée sans matrice (« Ø »), sur le génome natif (« WT ») ou sur le génome de mutants délétés sans cicatrice (« Δ ») obtenus au cours de cette étude. Les tailles attendues du produit PCR étaient de 1106 pb et de 815 pb pour les natifs et les supprimés. lsr2A loci, et 729 pb et 481 pb pour natif et supprimé lsr2B loci, respectivement (voir la section Méthode pour plus de détails). Les tailles attendues du produit PCR pour les loci natifs et supprimés sont indiquées (« L » : échelle d'ADN GeneRuler™ 1 kb, Thermo Scientific)

Nous avons conçu un ARNsg ciblant ce marqueur de sélection à l'aide de l'analyse du site Web CRISPRy (https://crispy. Secondarymetabolites.org/#/input) [30] et Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder /) [31] pour sélectionner une région cible de 20 nucléotides qui ne devrait pas avoir de cibles hors S. ambofaciens génome. Nous avons profité de la teneur élevée en GC de S. ambofaciens génome (environ 72 %) pour concevoir une séquence à faible teneur en GC (40 %) minimisant davantage le risque d'avoir des hors-cibles. L'introduction d'un outil génétique codant pour un complexe CRISPR-Cas9 ciblant cet ADN « appât » laisse intacte la deuxième copie du gène alors qu'elle induit une cassure double brin au voisinage de la copie d'intérêt (Fig. 1).

Cette cassure est ensuite réparée par la machinerie cellulaire. Chez les bactéries, la voie NHEJ est moins répandue que chez les eucaryotes [4]. Si les gènes de type NHEJ peuvent être impliqués dans la plasticité du génome et la résistance aux dommages à l'ADN de S. ambofaciens [32, 33], la réparation efficace des dommages induits par Cas9 par la voie NHEJ nécessite la surexpression d'une ADN ligase D hétérologue dans cette bactérie [11]. Par conséquent dans S. ambofaciens hébergeant des séquences répétées (en amont et en aval) à proximité du gène cible, la rupture d'ADN double brin induite par CRISPR-Cas9 stimule l'apparition d'un deuxième événement de recombinaison entre les séquences répétées en amont ou en aval (Fig. 1). Dans les deux cas les séquences plasmidiques sont perdues, permettant le criblage de clones sensibles à l'hygromycine pour identifier les clones dans lesquels le système CRISPR-Cas9 a induit ce second événement de recombinaison. Dans cette étude, nous avons criblé au moins 30 clones par souche et observé qu'ils étaient tous sensibles à l'hygromycine après l'induction de l'expression de Cas9. Cela confirme que la HDR est la voie prédominante impliquée dans la réparation de l'ADN dans Streptomyces hébergeant des séquences répétées près de la cassure double brin.

La suppression sans cicatrice de lsr2 paralogues dans Streptomyces ambofaciens

Selon la séquence présente entre les régions en amont et en aval de l'ADN « appât », cette approche CRISPR-Cas9 permet potentiellement la suppression, le remplacement ou l'insertion de gènes. Dans notre cas, les séquences en amont et en aval étaient immédiatement adjacentes de sorte que l'édition de gènes conduit à une délétion sans cicatrice de la copie d'intérêt (Fig. 1). En évitant l'insertion de séquences codant pour le promoteur et la résistance aux antibiotiques, on pense que la délétion sans cicatrice minimise l'impact de la délétion sur le reste du génome. Cela limite les biais sur le phénotype mutant. Étant donné que l'action CRISPR-Cas9 n'est requise que de manière transitoire, nous avons utilisé un plasmide thermosensible codant pour le sgRNA et un Cas9 inductible. Cette expression transitoire minimise la toxicité et les effets potentiels hors cible du système CRISPR-Cas9.

Pour distinguer le renversement du génome parental et la délétion spécifique à la copie résultant du deuxième événement de recombinaison, nous avons analysé par PCR l'organisation génétique du locus cible dans les souches contenant ou manquant d'une copie supplémentaire de lsr2A et lsr2B intégré au PhiC31 attsite B. Nous avons observé que, alors que les fréquences de délétion du locus natif n'étaient pas statistiquement différentes entre les souches hébergeant ou dépourvues d'une copie supplémentaire de lsr2B (Fig. 2), la suppression du natif lsr2A locus n'a été obtenu que dans la souche contenant une copie intégrée de lsr2A au PhiC31 attB placer. Puisque nous avons utilisé le même sgRNA pour effectuer lsr2A et lsr2B édition, nous pouvons exclure une différence dans la reconnaissance de la cible. Ces résultats suggèrent fortement que lsr2A est potentiellement un gène essentiel.

Proportion de clones natifs avec copie de gènes supprimés obtenus après l'approche CRISPR-Cas9 ciblant l'ADN « appât ». Une approche CRISPR-Cas9 ciblant l'ADN « appât » a été réalisée pour supprimer lsr2A ou lsr2B paralogues dans S. ambofaciens WT ou souches apparentées contenant une extracopie de lsr2 paralogue (WT attPhic31ΩpSET152-lsr2X, X étant soit UNE ou B). La souche WT contenant un vecteur vide (WT attPhiC31ΩpSET152) a été utilisé comme contrôle. Le nombre de clones sensibles à l'hygromycine (c'est-à-dire ayant perdu le gène de résistance à l'hygromycine après ciblage CRISPR-Cas9) hébergeant un clone natif ou supprimé lsr2A ou lsr2B gène a été déterminé par analyse PCR. Les p1 valeur représente le p valeur obtenue à partir d'un test exact de Fisher pour les données de comptage comparant les fréquences de suppression à la condition WT (pour un lsr2 approche paralogue CRISPR-Cas9). Les p2 valeur représente le p valeur du même test effectué pour comparer les fréquences de suppression à une fréquence théorique de 0,5 (en utilisant le même total effectif comme référence). Abréviation : ns = non statistiquement significatif

Enfin, cette approche permet de surveiller la proportion relative d'événements d'inversion par rapport à la délétion dans différents contextes génétiques. Dans notre cas, nous avons observé que la suppression de lsr2B était aussi fréquente que l'inversion du génotype WT, indépendamment de la présence d'une copie supplémentaire (Fig. 2). A l'inverse, la suppression de lsr2A était statistiquement moins fréquente (p valeur de 0,01778, test exact de Fisher pour les données de comptage) que la réversion dans la souche contenant une copie intégrée de lsr2A au PhiC31 attB site (Fig. 2). Cela suggère que même en présence d'une copie supplémentaire de lsr2A sous le contrôle de la constitution kasOp* promoteur [34], la suppression du lsr2A Le locus natif peut avoir un impact sur la physiologie ou la forme physique des bactéries.


Un puzzle CRISPR-Cas9 révélé par l'apprentissage automatique

Lors de mon post-doctorat dans le laboratoire de Luciano Marraffini à l'Université Rockefeller j'ai eu la chance de travailler sur les premiers développements des technologies CRISPR-Cas9 et en particulier leur application pour modifier le génome des bactéries ou contrôler l'expression des gènes. La variante catalytiquement morte de Cas9 connue sous le nom de dCas9 peut être programmée pour lier presque n'importe quel gène d'intérêt, mais elle repose simplement sur l'ADN au lieu d'introduire une rupture comme le ferait Cas9. La liaison de dCas9 à l'ADN est suffisamment forte pour bloquer l'ARN polymérase lorsqu'elle est dans la bonne orientation (le guide doit se lier au brin codant du gène cible), et la facilité avec laquelle il peut être reprogrammé en fait un outil fantastique pour étudier le effet de silençage des gènes.

dCas9 bloque efficacement la transcription lorsque l'ARN guide se lie au brin codant

Lorsque j'ai commencé mon groupe à l'Institut Pasteur il y a 4 ans, l'un de mes premiers objectifs était de mettre en place un criblage à l'échelle du génome pour exploiter les propriétés de dCas9 afin d'étudier la fonction des gènes dans E. coli de manière systématique. Un post-doctorant fantastique nommé Lun Cui a rejoint le laboratoire pour mener ce projet et a obtenu les premiers résultats en un an. Une bibliothèque mutualisée de

10^5 ARN guides exprimés à partir d'un plasmide ont été introduits dans un E. coli souche portant dCas9 sous le contrôle d'un promoteur inductible. L'effet de chaque guide sur la croissance de E. coli a été mesurée en surveillant l'abondance relative des guides dans la population tout en induisant l'expression de dCas9.

Nous avons été ravis d'observer que les ARN guides qui ciblent le brin codant des gènes essentiels ont été rapidement épuisés de la bibliothèque comme prévu. L'analyse de ces données peut révéler de nombreuses informations intéressantes sur les gènes essentiels et quasi essentiels, que nous avons commencé à étudier et que nous publierons dans une autre étude à venir.En travaillant là-dessus, nous avons fait le constat intriguant que certains guides nuisaient fortement à la croissance de E. coli tout en se liant dans la mauvaise orientation (c'est-à-dire au brin modèle). Nous et d'autres avions précédemment montré que la liaison dCas9 dans cette orientation ne conduit qu'à une répression modérée (

10-60% de réduction de l'expression). Certains gènes essentiels ne tolèrent probablement même pas une réduction modérée de leur niveau d'expression. Cependant, nous étions vraiment perplexes de voir que quelques gènes non essentiels, dont lpoB, un gène impliqué dans la synthèse de la paroi cellulaire, ont été ciblés par des guides sur le brin matrice qui a produit un défaut de fitness. Il était peu probable que la répression modérée d'un gène non essentiel soit toxique, mais j'ai quand même appelé un expert en synthèse de la paroi cellulaire pour lui demander si ce que nous avons observé avec lpoB n'avait aucun sens, ce n'était pas le cas.

Dilutions en série d'E. coli portant des ARN guides ciblant le gène lpoB sur le brin codant (C-lpoB) ou sur le brin matrice (T-lpoB). Le guide T-lpoB tue E. coli non pas parce qu'il bloque l'expression de lpoB mais à cause de l'effet « mauvaise graine ».

Il est devenu clair que lpoB n'était pas impliqué dans ce phénotype lorsque nous l'avons supprimé du génome de E. coli et encore observé le même effet de toxicité. Le mystère s'est approfondi lorsque nous avons réalisé qu'il ne s'agissait pas d'un phénomène isolé. Jusqu'à 7% des guides ciblant le brin matrice de gènes étaient toxiques. Notre attention a été attirée par lpoB uniquement parce que, par hasard, deux des trois guides qui ciblent son brin modèle montrent ce phénomène. Notre première hypothèse pour expliquer la toxicité de ces guides était qu'ils avaient probablement des positions hors cible bloquant l'expression de gènes essentiels. Cela s'est avéré correct pour certains d'entre eux, mais pas pour les guides ciblant lpoB. En fait, la grande majorité de ces guides étonnamment toxiques n'ont pas de cible hors cible évidente dans le chromosome de E. coli cela peut expliquer leur toxicité.

Nous nous sommes donc tournés vers une approche d'apprentissage automatique pour déterminer si ces guides toxiques partageaient certaines caractéristiques de séquence. Un modèle de réseau neuronal utilisant uniquement la séquence de guidage comme entrée a pu prédire la toxicité de manière assez précise (pearson-r : 0,54). Cette approche nous a permis d'identifier le rôle joué par les 5 derniers nucléotides de l'ARN guide. Il existe 1024 séquences possibles de 5 nucléotides, et de manière assez surprenante, plus de 100 d'entre elles rendent les ARN guides toxiques pour E. coli, avec des phénotypes allant de la formation de petites colonies à l'inhibition complète de la croissance. L'extrémité 3' de la séquence de guidage est également connue sous le nom de séquence de graine, et nous avons donc appelé cette toxicité l'effet "mauvais grain".

Cinq nucléotides d'identité à un gène cible sont trop peu pour avoir un effet substantiel sur l'expression génique, et ces guides toxiques peuvent avoir plusieurs centaines de positions cibles possibles dans le chromosome de E. coli, ce qui rend ce phénomène particulièrement déroutant et difficile à étudier. Au cours des deux années suivantes, nous avons essayé de résoudre cette énigme avec plusieurs approches, certaines d'entre elles rapportées dans le manuscrit, mais qui n'ont jusqu'à présent conduit qu'à peu d'informations. L'une en particulier était de simplement sélectionner des mutants capables de survivre à la toxicité de certains guides et de les séquencer pour rechercher des mutations qui pourraient pointer vers le mécanisme. Afin d'éviter de sélectionner des mutants qui inactivaient simplement dCas9, nous avons recherché des clones qui ne présentaient pas le phénotype de toxicité tout en maintenant une forte répression sur la cible. Nous pouvions trouver de tels clones relativement facilement et étions très enthousiastes à l'idée de séquencer leur génome, notre imagination débordant déjà d'hypothèses sur ce que nous trouverions.

Lorsque les résultats sont revenus, nous avons été terriblement déçus de voir que les seules mutations que nous avons trouvées étaient dans dCas9 lui-même, et la plupart étaient en fait des mutants de décalage de trame. Ces mutants étaient très probablement capables d'exprimer de faibles niveaux de dCas9 par glissement ribosomique, expliquant comment ils ont été sélectionnés dans notre criblage. D'autres efforts héroïques de Lun Cui pour isoler des mutants intéressants, avec des conceptions d'écrans plus intelligentes et un criblage minutieux des colonies, n'ont révélé que des manières plus complexes de E. coli peut réduire le niveau d'expression d'une protéine. Au final, ces expériences ne nous ont pas rapprochés de la découverte du mécanisme de toxicité. Ce qu'ils nous ont dit cependant, c'est qu'abaisser la concentration de dCas9 pourrait atténuer la toxicité tout en maintenant une forte répression sur la cible. Nous avons donc refait le crible, cette fois avec une expression plus faible de dCas9, et obtenu de beaux résultats. L'effet des ARN guides est devenu beaucoup plus constant et l'effet de "mauvaises semences" a été grandement atténué. Dans l'ensemble, cette étude a fourni de nombreuses informations sur les propriétés de dCas9 dans E. coli, et nous a aidés à formuler des règles de conception que vous trouverez dans la discussion du document. Reste que le mystère de l'effet "mauvaise graine" demeure, mais on ne jettera pas l'éponge si facilement, alors restez connectés.

David Bikard

Passionné de Microbiologie, CRISPR et Biologie Synthétique. Chef de laboratoire à l'Institut Pasteur (@institutpasteur). Fondateur et CSO @EligoBio



Commentaires:

  1. Akishicage

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