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Équation pour une prédiction précise du rendement de la PCR

Équation pour une prédiction précise du rendement de la PCR



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C'est un cliché des laboratoires de biologie de première année de souligner que "chaque cycle de PCR double l'ADN, donc le rendement sera de 2$^{cycles}$ fois le montant de la matrice". Cependant, si cela était vrai, 1 ng de modèle générerait environ 35 milliards de ng après 35 cycles, soit 35 grammes d'ADN. C'est clairement absurde et ce n'est pas le cas.

Bien sûr, l'affirmation de la puissance de 2 est une simplification grossière (au contraire, c'est une borne supérieure - mais même ainsi, très peu informatif), et en pratique, les rendements seront bien en deçà de celui-ci car :

  • Chaque duplex d'ADN ne se dénature pas à chaque cycle
  • Les amorces ne se lient pas à chaque molécule d'ADN à chaque cycle
  • Tous les brins d'ADN ne sont pas liés par une polymérase à chaque cycle
  • Toutes les polymérases qui se lient ne parviennent pas à terminer l'intégralité du produit à temps à chaque cycle
  • La réaction s'inhibe en appauvrissant les dNTP
  • La chaleur dénature la réaction en dégradant l'enzyme

En fait, un examen superficiel de la sortie qPCR suit souvent la cinétique de saturation :

Les méthodes mathématiques de modélisation de la qPCR sont évidemment bien développées.

Ma question concerne la PCR ordinaire : est-il possible d'avoir une attente raisonnable de rendement en nanogrammes pour une PCR ordinaire effectuée dans un cycleur de table, avec des réactifs PCR typiques ?

Par exemple, lors de l'amplification à partir d'un plasmide, je voudrais calculer combien de cycles à faire, combien de modèle à utiliser et combien de produit à charger sur le gel d'agarose pour m'assurer que je serai capable de distinguer clairement l'amplification exponentielle (à la fois annelage des amorces), amplification linéaire (une seule amorce s'hybride) et aucune amplification (aucune des amorces ne peut s'hybrider ou la réaction n'a pas fonctionné).


Une efficacité attendue pour une PCR typique est de 80 %, ce qui signifie que chaque cycle multiplie par 1,58 le nombre de copies de la séquence d'ADN ciblée.

Premièrement, il est plus logique de se référer à la quantité d'ADN dans une réaction en chaîne par polymérase en termes de numéro de copie ou en termes de taupes; les nombre de molécules d'ADN l'intérêt est sur quoi s'opère la réaction, et la masse de produit généré est fonction de la longueur du produit (et, dans une moindre mesure, de la composition du produit).

La discussion suivante provient de cette URL : https://www.csun.edu/~hcbio027/biotechnology/lec3/pcr/p.htm

Selon Perkin-Elemer, le numéro de copie amplification de 100 000 fois de la séquence d'ADN ciblée peut être attendue d'une PCR avec 0,1 ng d'ADN de phage Lambda (un isolat d'ADN bien caractérisé et standard) dans une réaction de 100 µL avec > 25 cycles de dénaturation, d'hybridation et d'extension.

Dans l'exemple d'amplification de 100 000 fois ci-dessus, si l'amplicon ciblé devait avoir une longueur de 500 pb, le poids moléculaire estimé de l'ADN duplex de 500 pb est de 325 000 g/mol (sur la base d'une paire de bases moyenne ayant une masse moléculaire de 650 g /mol).

Le génome du phage Lamdba a une longueur de 42 502 paires de bases. 42 502 pb × 650 grammes/mol/pb = 2,762 × 10^7 grammes/mol.

0,1 ng d'ADN lambda -> 0,1 × 10^-9 grammes. 0,1×10^-9 g 2,762×10^7 g/mol = 3,619 × 10^-18 moles. 3,619 × 10^-18 moles × NA (nombre d'Avogradro) = 2,179 × 10^6 copies, soit 2 179 000 copies.

2,179×10^6 exemplaires × 100 000 = 2,179×10^11 exemplaires. 2,179×10^11 copies NA × 325 000 g/mol = 1,176×10^-7 grammes de séquence. 1,176 × 10^-7 grammes équivaut à 0,117 µg ou 117 ng.

Un rendement d'amplification de 100 000x après 25 cycles signifierait qu'à chaque cycle, 1 modèle donnerait 1,58 modèles pour le prochain cycle de synthèse.

Comment cela a-t-il été calculé ? Si c est le nombre de copies réalisées par tour de synthèse, alors :

c^25 = 100 000 = 10^5 donc c^5 = 10 et donc 5(log c) = log 10 = 1 donc log c = 0,2 et c = 1,58 (environ) (Ou vous pouvez calculer la 25e racine de 100 000 sur une calculatrice, si vous préférez.)

Si nous obtenons 1,58 copie au lieu du maximum théorique de 2 copies, alors l'efficacité de la réaction pourrait être dite de 79 % (car 1,58/2,00 = 0,79).

L'une des raisons pour lesquelles ce calcul est important est qu'une légère perte d'efficacité est amplifiée par l'amplification. Une réaction peut sembler ne pas avoir fonctionné si l'efficacité diminue (à chaque cycle) de quelques pour cent seulement. L'optimisation est d'une importance critique dans la réaction en chaîne par polymérase.


L'équation est correcte, mais il existe une limite asymptotique supplémentaire à une concentration maximale de produit en fonction de la concentration de départ des NTP, des paires matrice et amorce en solution également.


Équation de la respiration cellulaire

L'équation de la respiration cellulaire aide à calculer la libération d'énergie en décomposant le glucose en présence d'oxygène dans une cellule. Si vous recherchez des informations sur la formule de l'équation de la respiration cellulaire, l'article suivant de BiologyWise s'avérera utile.

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La respiration cellulaire est un processus courant qui est effectué par de nombreux organismes pour produire et libérer de l'énergie. Il s'agit essentiellement d'un processus par lequel les cellules transforment le glucose et l'oxygène en dioxyde de carbone et en eau, et libèrent donc de l'énergie pour l'ATP. L'ATP signifie adénosine triphosphate et est l'énergie libre utilisée par les cellules. Il s'agit essentiellement d'une molécule organique qui contient des liaisons phosphate à haute énergie. Lorsqu'un phosphate passe d'un ATP à une autre molécule, cette molécule a tendance à gagner de l'énergie. Cette réaction au cours de laquelle une molécule gagne de l'énergie est appelée réaction endergonique. La molécule dont le phosphate est éliminé a tendance à perdre de l'énergie et à dégager de la chaleur. Une telle réaction est connue sous le nom réaction exergonique et le niveau d'énergie de la molécule diminue.

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La respiration cellulaire est différente de la photosynthèse et est généralement une réaction aérobie qui se produit en présence d'oxygène. Il existe quatre processus distincts qui divisent le processus total de respiration cellulaire. Voyons brièvement les quatre étapes impliquées, avant d'entrer dans les détails de l'équation de la respiration cellulaire.

Étapes impliquées

  • La première étape implique la glycolyse. La glycolyse a lieu dans le cytoplasme de la cellule et est un processus anaérobie, qui ne nécessite pas d'oxygène. Le glucose est décomposé en deux molécules de pyruvate dans un processus en 10 étapes produisant 2 ATP.
  • L'étape suivante consiste en l'entrée du pyruvate dans les mitochondries qui conduit à la production de deux molécules d'acétyl-coenzyme A et de 2 molécules de CO2.
  • La troisième étape implique le cycle de l'acide citrique (CAC). Il s'agit d'une réaction en 9 étapes qui se déroule dans les mitochondries. Les réactions donnent 2 ATP et 4 CO2 molécules.
  • La dernière étape implique le système de transport d'électrons ou système de cytochrome qui se déroule à l'aide d'enzymes situées dans la membrane mitochondriale interne. Cette étape donne le nombre maximum d'ATP, soit 32 molécules d'ATP, ce qui porte l'énergie totale produite à 36 ATP.

Ces réactions complexes conduisent à la production de 36 ATP en utilisant une molécule de glucose et six molécules d'oxygène.

Équation

L'équation équilibrée de la respiration cellulaire donne 36 ou 38 molécules d'ATP qui dépendent des équivalents extramitochondriaux réducteurs de NADH, qui sont recyclés pour la glycolyse comme le glycérol 3-phosphate qui donne 36 molécules d'ATP et la navette malate ou aspartate produit 38 ATP.

C'est l'équation équilibrée qui donne de l'énergie. La respiration cellulaire aide les cellules à casser le sucre, ce qui contribue également à produire de l'énergie. C'est un processus d'oxydo-réduction ou réaction redox. L'oxydation du glucose sous forme de CO2 + H2O avec un électron retiré de C6H12O6. La réduction de l'oxygène en eau avec le passage de l'électron en oxygène est la réaction de réduction. Le NAD+ (nictotinadénine dinucléotide) est une co-enzyme qui se réduit en NADH, lorsqu'elle capte deux électrons et un ion hydrogène, ce qui en fait une molécule porteuse d'énergie. La flavine adénine dinucléotide (FAD + ) est réduite en FADH2, ce qui en fait une autre co-enzyme qui est un porteur d'électrons.

L'équation de la respiration cellulaire fait partie de la voie métabolique qui décompose les glucides complexes. C'est une réaction exergonique où les molécules de glucose à haute énergie sont décomposées en dioxyde de carbone et en eau. Il est également connu sous le nom de réaction catabolique car une grosse molécule comme un glucide est décomposée en molécules plus petites.

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Modèle d'évaluation de la dénaturation de l'ADN

L'étape de dénaturation initiale est effectuée au début de la PCR pour séparer l'ADN matrice double brin en brins simples afin que les amorces puissent se lier à la région cible et initier l'extension. La dénaturation complète de l'ADN d'entrée permet d'assurer une amplification efficace de la séquence cible pendant le premier cycle d'amplification. De plus, la température élevée à cette étape permet d'inactiver les protéases ou nucléases thermolabiles qui peuvent être présentes dans l'échantillon, avec un impact minimal sur les ADN polymérases thermostables. Lors de l'utilisation d'une ADN polymérase à démarrage à chaud, cette étape sert également à activer l'enzyme, bien qu'une étape d'activation distincte puisse être recommandée par le fournisseur de l'enzyme.

L'étape de dénaturation initiale est généralement effectuée à 94-98°C pendant 1 à 3 minutes. Le temps et la température de cette étape peuvent varier en fonction de la nature de l'ADN matrice et des concentrations en sel du tampon. Par exemple, l'ADN génomique de mammifère peut nécessiter des périodes d'incubation plus longues que les plasmides et les produits PCR, en fonction de la complexité et de la taille de l'ADN. De même, l'ADN avec une teneur élevée en GC (par exemple, >65%) nécessite souvent une incubation plus longue ou une température plus élevée pour la dénaturation (Figure 2). Les tampons à haute teneur en sels (comme requis par certaines ADN polymérases) ont généralement besoin de températures de dénaturation plus élevées (par exemple, 98 °C) pour séparer l'ADN double brin (figure 3).

Figure 2. L'augmentation du temps de dénaturation initial améliore le rendement PCR d'un fragment de 0,7 kb riche en GC amplifié à partir d'un échantillon d'ADNg humain. Les étapes de dénaturation initiales ont été fixées à 0, 0,5, 1, 3 et 5 minutes respectivement.

Certaines ADN polymérases telles que Taq L'ADN polymérase peut se dénaturer facilement après une incubation prolongée au-dessus de 95°C. Pour compenser la diminution de l'activité dans ce scénario, plus d'enzymes peuvent être ajoutées après l'étape de dénaturation initiale, ou une quantité supérieure à celle recommandée d'ADN polymérase peut être ajoutée au début. Enzymes hautement thermostables telles que celles dérivées de Archées sont capables de résister à des températures élevées prolongées et de rester actifs tout au long de la PCR (en savoir plus sur les caractéristiques de l'ADN polymérase).


Résultats

Analyse des SM A. nidulans sur un milieu solide complexe identifie 42 composés.

Initialement, nous avons évalué la production de SM sur quatre milieux solides différents [agar à l'avoine (OTA), saccharose à l'extrait de levure (YES), autolysat de levure Czapek (CYA) et CYA avec 50 g/L de saccharose NaCl (CYAS) Matériaux et méthodes] à 4, 8 et 10 jours. L'objectif était d'identifier une sélection de médias qui (je) a donné autant de SM produits que possible, (ii) a montré un ou plusieurs SM uniques à chaque support, et (iii) avaient des MS qui n'étaient produits que sur deux des supports sélectionnés.

Ces caractéristiques devraient nous permettre d'avoir autant de clusters de gènes actifs que possible, ainsi que d'assurer des profils de production uniques pour autant de clusters de gènes SM que possible.

À partir de cette analyse initiale, nous avons sélectionné les médias YES, CYA et CYAS pour le profilage transcriptionnel. Sur ces supports, nous avons pu séparer et détecter 59 SM uniques, dont nous avons pu en nommer 42 par comparaison avec notre vaste bibliothèque interne de métabolites microbiens (31) et la base de données de produits naturels AntiBase 2010. Le profil de production des composés satisfaisait aux trois critères énumérés ci-dessus (Fig. 1, Fig. S1 et Dataset S1).

Diagramme de Venn des SM trouvés sur trois supports solides différents. Le nombre de métabolites différents est trié en fonction du milieu sur lequel les métabolites ont été identifiés. Le nombre de métabolites ne pouvant être identifiés avec certitude est indiqué entre parenthèses. Les détails peuvent être trouvés dans le jeu de données S1 et les structures chimiques sont illustrées sur la figure S1.

Génération d'un recueil d'expressions génétiques diversifiées pour A. nidulans.

Des échantillons ont été prélevés pour le profilage transcriptionnel à partir de plaques cultivées parallèlement à celles du profilage SM ci-dessus. L'ARN a été purifié, préparé pour le marquage et hybridé à des puces Agilent Technologies conçues sur mesure basées sur la version 5 de la A. nidulans annotation (32).

Les données produites ont été combinées avec des données de microarray précédemment publiées de A. nidulans cultures en bioréacteur (33, 34) pour former un recueil de puces à ADN couvrant un ensemble diversifié de conditions, comprenant 44 échantillons au total. L'ensemble comprend quatre souches de A. nidulans. Quatre milieux de croissance différents sont inclus : trois milieux complexes (voir ci-dessus) et un milieu minimal. Les variations moyennes comprennent cinq sources de carbone définies différentes (éthanol, glycérol, xylose, glucose et saccharose), ainsi que l'extrait de levure. Le recueil combiné des données d'expression est disponible dans l'ensemble de données S2.

Identification basée sur la corrélation des groupes de gènes.

Pour identifier efficacement les clusters de gènes autour des synthases SM, nous avons développé un score de clustering de gènes (CS) basé sur le coefficient de corrélation produit-moment de Pearson. Notre CS donne une valeur numérique pour la corrélation du profil d'expression d'un gène donné avec les profils d'expression des trois gènes voisins immédiats de chaque côté. Seule une corrélation positive est considérée. Les valeurs pour le CS sont disponibles dans l'ensemble de données S2.

La simulation statistique de la distribution du CS sur l'ensemble de données donné a montré que les valeurs CS ≥ 2,13 correspondaient à un taux de faux positifs de 0,05 (Fig. S2). Par conséquent, CS ≥ 2,13 a été utilisé comme ligne directrice pour identifier l'étendue des groupes de gènes.

Prédiction de l'étendue de 51 clusters de gènes.

L'évaluation de la taille des clusters autour des gènes SM a été réalisée à l'aide d'une liste précalculée de 66 PKS, NRPS et DMATS putatifs à partir de l'algorithme de recherche de régions uniques de métabolite secondaire (SMURF) (3) basé sur le A. nidulans Ensemble de gènes FGSC A4 (35). En plus de ces 66 gènes, nous avons ajouté un gène de prényltransférase trouvé dans la littérature primaire (30) et trois gènes de diterpène synthase (DTS) prédits par Bromann et al. (25), résultant en 70 gènes biosynthétiques putatifs. Les 25 PKS, NRPS, DTS et prényltransférases vérifiés expérimentalement se sont avérés être inclus dans cette liste (tableaux 1 à 3).


Équation pour une prédiction précise du rendement PCR - Biologie

Construire et valider une signature génotypique prédictive pour la réponse pathologique complète (pCR) dans le cancer rectal localement avancé (PGS-LARC) après radiochimiothérapie néoadjuvante.

Méthodes et matériaux

Le séquençage de l'exome entier a été réalisé dans 15 tissus LARC. Les sites de mutation ont été sélectionnés en fonction de l'ensemble des données de séquençage de l'exome et de la littérature. Le séquençage cible a été effectué dans une cohorte d'entraînement (n = 202) pour construire le modèle PGS-LARC à l'aide d'une analyse de régression, et des cohortes de validation interne (n = 76) et externe (n = 69) ont été utilisées pour valider les résultats. Les performances prédictives du modèle PGS-LARC ont été comparées aux facteurs cliniques et entre les sous-groupes. Le modèle PGS-LARC comprenait 15 gènes.

Résultats

L'aire sous la courbe (AUC) du modèle PGS dans les cohortes de validation d'entraînement, interne et externe était de 0,776 (0,697-0,849), 0,760 (0,644-0,867) et 0,812 (0,690-0,915), respectivement, et a démontré une plus grande AUC, précision, sensibilité et spécificité par rapport au stade cT, au stade cN, au niveau d'antigène carcinoembryonnaire et au niveau CA19-9 pour la prédiction de la pCR. La performance prédictive du modèle était supérieure aux facteurs cliniques dans tous les sous-groupes. Pour les patients présentant une réponse clinique complète (cCR), la valeur de prédiction positive était de 94,7 %.

Conclusion

Le PGS-LARC est un outil prédictif fiable pour la pCR chez les patients atteints de LARC et pourrait être utile pour permettre une stratégie de gestion non opératoire chez les patients qui refusent la chirurgie. Il a le potentiel de guider les décisions thérapeutiques pour les patients présentant différentes probabilités de régression tumorale après un traitement néoadjuvant, en particulier en combinant les critères cCR et PGS-LARC.

Wei-Wei Xiao, Min Li, Zhi-Wei Guo, Rong Zhang, Shao-Yan Xi, Xiang-Guo Zhang et Yong Li ont contribué à parts égales à ce travail.

Ming Li et Yuan-Hong Gao sont des auteurs chevronnés qui ont contribué à parts égales à ce travail.

Cette recherche a été soutenue par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 81071891, 81672987) Fondation des sciences naturelles de la province du Guangdong (n° 2014A030312015) Programme scientifique et technologique du Guangdong (n° 2015B020232008), Programme scientifique et technologique de Guangzhou (n° 201508020250, 201604020003).

Divulgations : Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêts.


Taille et autres limitations

La PCR fonctionne facilement avec une matrice d'ADN d'une longueur allant jusqu'à deux à trois mille paires de bases. Cependant, au-dessus de cette taille, les rendements en produits diminuent souvent, car avec l'augmentation de la longueur, des effets stochastiques tels qu'une terminaison prématurée par la polymérase commencent à affecter l'efficacité de la PCR. Il est possible d'amplifier de plus gros morceaux jusqu'à 50 000 paires de bases avec un cycle de chauffage plus lent et des polymérases spéciales. Ce sont des polymérases fusionnées à une protéine de liaison à l'ADN améliorant la processivité, améliorant l'adhérence de la polymérase à l'ADN. [5] [6]

D'autres propriétés intéressantes des polymérases chimériques TopoTaq et PfuC2 comprennent une thermostabilité, une spécificité et une résistance améliorées aux contaminants et aux inhibiteurs. [7] [8] Ils ont été conçus en utilisant les domaines uniques de liaison à l'ADN hélice-épingle-hélice (HhH) de la topoisomérase V [9] de l'hyperthermophile Methanopyrus kandleri. Les polymérases chimériques surmontent de nombreuses limitations des enzymes natives et sont utilisées dans l'amplification PCR directe à partir de cultures cellulaires et même d'échantillons alimentaires, contournant ainsi les étapes laborieuses d'isolement de l'ADN. Une activité robuste de déplacement de brin de la polymérase hybride TopoTaq aide à résoudre les problèmes de PCR qui peuvent être causés par les épingles à cheveux et les doubles hélices chargées de G. Les hélices à haute teneur en G-C possèdent une température de fusion plus élevée, altérant souvent la PCR, selon les conditions. [dix]


4. DISCUSSION

La chimiothérapie néoadjuvante est de plus en plus utilisée pour traiter les patientes atteintes d'un cancer du sein. Cela est dû à ses avantages en termes de réduction de la taille de la tumeur, d'amélioration des options chirurgicales et d'augmentation significative de la survie des répondeurs. Cependant, une large application clinique reste discutable en raison d'un faible taux de réponse et du potentiel d'effets secondaires importants. Le cas le plus extrême est le TNBC, qui est le sous-type de cancer du sein le plus agressif et a le pire pronostic. En raison de son hétérogénéité, les patients atteints de TNBC répondent différemment au NCT. De nombreux efforts ont été déployés pour développer les signatures prédictives du TNBC, mais, à l'heure actuelle, il n'existe aucune signature prédictive appliquée en clinique. Par conséquent, il existe un besoin urgent de développer des biomarqueurs prédictifs robustes pour les patients TNBC. Bien que de nombreuses études se soient concentrées sur la différence de programme de régulation de la chimiothérapie entre pCR et RD, 61-63 les mécanismes sous-jacents à la survie des cellules tumorales résistantes restent mal compris.

Dans cette étude, nous avons développé un nouveau cadre pour identifier les signatures génétiques prédictives chez les patientes atteintes d'un cancer du sein. Nous avons validé l'efficacité de ce cadre en montrant que le RPS prédit la réponse NCT chez les patientes atteintes d'un cancer du sein, en particulier chez les patientes ER-positives (figure 2A-C et tableau S6). De plus, par rapport aux signatures commercialisées, le RPS avait une capacité de prédiction comparable pour chaque ensemble de données individuel (Figure 2D-E et Tableau S6). Nous avons ensuite appliqué le cadre aux patients TNBC et calculé le TNBC-RPS. Le TNBC-RPS était prédictif de la réponse chez les patients TNBC (Figure 3A-C et Tableau S7). Par rapport aux signatures de prédiction ER-négatives et non spécifiques précédemment développées, le TNBC-RPS a surpassé 143 signatures génétiques prédictives et a présenté une précision de prédiction robuste (figure 3D-F et tableau S7). D'importance, le TNBC-RPS conduit à une ASC plus élevée allant jusqu'à 0,80 chez les patients TNBC (Figure 5A-B) et a dépassé les performances des 143 signatures génétiques prédictives lorsqu'il est combiné avec des prédicteurs cliniques (Figure 5C). Nous proposons donc un nouveau cadre pour identifier les marqueurs prédictifs de la réponse NCT. De plus, pour faciliter l'utilité clinique des signatures RPS et TNBC-RPS, nous avons également fourni une version révisée de ces deux signatures géniques avec moins de gènes (tableau S15).

Des études antérieures ont calculé les scores de différentes signatures génétiques en utilisant une seule méthode. Cette stratégie ne prend pas en compte la variation des méthodes utilisées pour calculer les scores à partir des signatures géniques. Au lieu d'utiliser cette stratégie à méthode unique, nous avons validé les signatures précédemment publiées en appliquant les mêmes algorithmes qui ont été utilisés pour calculer les scores de chaque signature aux mêmes ensembles de données et reproduit les performances de prédiction publiées. Ensuite, nous avons appliqué les signatures génétiques aux métadonnées de validation pour la prédiction. Cela a rendu la comparaison de la précision des prédictions plus objective puisque nous avons pris en compte l'impact des différentes méthodes (Figures 2 et 3). Dans le tableau S4, nous présentons les résultats de validation des signatures précédentes. Nous avons obtenu des résultats cohérents en répétant les signatures génétiques publiées précédemment dans leurs ensembles de données de validation. Malgré les subtiles différences entre les P-valeur rapportée précédemment et notre AUC calculée (probablement causée par la mise à jour ou différentes méthodes de normalisation sur les données brutes de puces à ADN), nous avons montré que notre modèle surclassait de manière significative la plupart des signatures rapportées.

Les mécanismes de réponse aux médicaments dans le cancer du sein ont été étudiés pendant de nombreuses années mais étaient encore mal compris. Nous avons étudié l'association entre le RPS et les caractéristiques du microenvironnement tumoral ER-positif, ainsi qu'entre le TNBC-RPS et les caractéristiques du microenvironnement tumoral TNBC respectivement (Figure 6). Il convient de noter que le RPS a identifié des changements dans le taux de prolifération des cellules tumorales et l'infiltration des cellules immunitaires chez les patients ER-positifs, ce qui a été soutenu par des études antérieures montrant que les signatures géniques liées au cycle cellulaire 16, 64-66 et à l'infiltration immunitaire 67-69 étaient associés à la réactivité. Cette observation pourrait être davantage validée grâce aux performances de prédiction des 143 signatures génétiques prédictives. Par exemple, Oncotype DX, une signature composée de gènes liés au cycle cellulaire, et le score Immune Signature Gene Module étaient tous deux prédictifs de la réponse chez les patients ER-positifs (tableau S6). 16, 28 Le TNBC-RPS a principalement capturé l'abondance relative des cellules stromales dans le microenvironnement tumoral. Agriculteur et al ont également rapporté le même résultat chez les patients TNBC. 29 Pendant ce temps, nous avons également utilisé l'abondance des cellules stromales pour la prédiction chez les patients TNBC et avons obtenu une AUC = 0,55, indiquant un rôle prédictif des cellules stromales dans la réponse NCT des patients TNBC (Figure S3E-F). 69-72 Par conséquent, nos résultats permettent de comprendre la biologie du cancer du sein en montrant quel(s) aspect(s) du microenvironnement tumoral pourrait influencer la réponse au NCT.

Bien que nous ayons démontré l'efficacité du RPS et du TNBC-RPS pour prédire la réponse au NCT, la puissance de prédiction et la plage applicable du modèle pourraient être encore améliorées. En plus des signatures géniques, d'autres signatures de coloration IHC ou des modèles de prédiction basés sur l'imagerie IRM ont été utilisés pour prédire la réponse à la NCT. 73-75 Cependant, nous manquons de données pour comparer les performances de nos signatures à ces méthodes ou pour les intégrer dans le modèle pour une meilleure prédiction. De plus, nos signatures étaient applicables à la prédiction de l'association de patients traités par chimiothérapie à base d'antimétabolites, d'anthracyclines, d'agents alkylants et de taxanes et n'ont pas été étendues pour étudier son pouvoir prédictif avec d'autres agents chimiothérapeutiques ou agents thérapeutiques ciblés. Avec la publication de plus de données d'expression génique, il sera peut-être possible d'étendre la gamme applicable de nos signatures ou de développer des signatures géniques prédictives spécifiques à un médicament.

En résumé, nous avons développé un cadre pour identifier une signature génique prédictive dans le cancer du sein et défini deux signatures géniques qui pourraient être utilisées pour prédire la réponse NCT chez les patientes ER-positives et TNBC respectivement. Nous avons démontré que le RPS fonctionnait à un niveau comparable aux signatures commercialisées actuelles, tandis que le TNBC-RPS surpassait 143 signatures génétiques pour les patients TNBC en prédiction. Plus important encore, l'intégration du RPS ou du TNBC-RPS avec les prédicteurs cliniques actuellement établis a amélioré le pouvoir prédictif, par rapport à l'utilisation des seuls prédicteurs cliniques. En outre, le RPS et le TNBC-RPS ont capturé différents aspects du microenvironnement tumoral, ce qui a permis de mieux comprendre les mécanismes biologiques potentiels à l'origine des différences dans la réponse chimiothérapeutique. Ce cadre informatique peut également être facilement étendu pour définir des biomarqueurs prédictifs dans d'autres types de cancer.


Équation de la respiration cellulaire

Équation de la respiration aérobie

L'équation de la respiration aérobie montre que le glucose est combiné à l'oxygène et à l'ADP pour produire du dioxyde de carbone, de l'eau et de l'ATP :

C6H12O6 (glucose)+ 6O2 + 36 ADP (ATP appauvri) + 36 Pje (groupes phosphates)→ 6CO2 + 6H2O + 36 ATP

En fermentation lactique, une molécule de glucose est décomposée en deux molécules d'acide lactique. L'énergie chimique qui était stockée dans les liaisons glucose rompues est transférée dans des liaisons entre l'ADP et un groupe phosphate.

C6H12O6 (glucose) + 2 ADP (ATP appauvri) + 2 Pje (groupes phosphates) → 2 CH3CHOHCOOH (acide lactique) + 2 ATP

Équation de fermentation alcoolique

La fermentation alcoolique est similaire à la fermentation lactique en ce que l'oxygène n'est pas l'accepteur d'électrons final. Ici, au lieu d'oxygène, la cellule utilise une forme convertie de pyruvate pour accepter les électrons finaux. Cela crée de l'alcool éthylique, que l'on trouve dans les boissons alcoolisées. Les brasseurs et distillateurs utilisent des cellules de levure pour créer cet alcool, qui sont très bons pour cette forme de fermentation.

C6H12O6 (glucose) + 2 ADP (ATP appauvri) + 2 Pje (groupes phosphates)→ 2 C2H5OH (alcool éthylique) + 2 CO2 + 2 ATP


Résultats

Pour la prédiction des performances hybrides, la médiane des corrélations (r(y,hat )) entre les valeurs observées et prédites en validation croisée avec les hybrides de type 2 était comprise entre 0,74 et 0,75 pour le rendement en grains et entre 0,88 et 0,99 pour la teneur en matière sèche des grains (Fig. 2). Les différences dans la médiane de la corrélation entre la prédiction avec les AFLP, avec tous les ARNm 10k (mRNA10k) et avec des échantillons aléatoires de 1k sur les 10k ARNm (mRNAr1k) étaient négligeables. La prédiction avec les ARNm avait une variation légèrement plus petite autour de la médiane que la prédiction avec les AFLP. Les erreurs de prédiction absolues moyennes (|y-hat |) avaient à peu près les mêmes tailles pour la prédiction avec les AFLP, tous les 10 000 ARNm et des échantillons aléatoires de 1 000 des 10 000 ARNm.

Précision des prédictions pour les performances hybrides des hybrides de type 2 (à gauche, en gris clair) et les hybrides de type 0 (à droite, en gris foncé). Corrélations (r(y,hat )) entre le rendement en grains observé et prévu et la teneur en matière sèche des grains, et l'erreur de prédiction absolue moyenne (|y-hat |) pour les ensembles de prédicteurs AFLP (970 marqueurs AFLP), mRNAr1k (1000 transcrits d'ARNm aléatoires), mRNA10k (10 810 transcrits d'ARNm). Les boxplots montrent les distributions pour 1000 exécutions de validation croisée, ?? sont les moyennes arithmétiques et Z les médianes

Pour les hybrides de type 0, les corrélations entre les performances hybrides observées et prévues pour les deux caractères étaient plus faibles que pour les hybrides de type 2. La médiane des corrélations en validation croisée était comprise entre 0,54 et 0,56 pour le rendement en grains et entre 0,29 et 0,41 pour la teneur en matière sèche des grains. Les différences dans la médiane entre les ensembles de prédicteurs AFLP, mRNA10k et mRNAr1k étaient faibles. Les plages de corrélations étaient très larges et, dans certains passages de validation croisée, même des corrélations négatives importantes ont été observées. Les erreurs de prédiction absolues moyennes étaient supérieures à celles des hybrides de type 2 et montraient des valeurs similaires pour les AFLP et l'ARNm.

Pour la prédiction de l'hétérosis mi-parent, la médiane de (r(y,hat )) avec les hybrides de type 2 était comprise entre 0,81 et 0,82 pour le rendement en grains et entre 0,90 et 0,91 pour la teneur en matière sèche des grains (Fig. 3). Les différences entre les ensembles de prédicteurs AFLP, mRNA10k, mRNAr1k étaient négligeables. L'erreur de prédiction absolue moyenne (|y-hat |) avait à peu près les mêmes tailles pour les trois ensembles de prédicteurs.

Précision de la prédiction pour l'hétérosis mi-parent des hybrides de type 2 (à gauche, en gris clair) et les hybrides de type 0 (à droite, en gris foncé). Corrélations (r(y,hat )) entre le rendement en grains observé et prévu et la teneur en matière sèche des grains, et l'erreur de prédiction absolue moyenne (|y-hat |) pour les ensembles de prédicteurs AFLP (970 marqueurs AFLP), mRNAr1k (1000 transcrits d'ARNm aléatoires), mRNA10k (10 810 transcrits d'ARNm). Les boxplots montrent les distributions pour 1000 exécutions de validation croisée, ?? sont les moyennes arithmétiques et Z les médianes

Pour les hybrides de type 0, les corrélations entre l'hétérosis mi-parent observé et prévu se situaient entre 0,26 et 0,4 pour le rendement en grains. Pour la teneur en matière sèche des grains, aucune corrélation entre les valeurs observées et prédites lors de la validation croisée n'a été observée.

Dans des analyses supplémentaires, nous avons étudié l'effet d'une réduction supplémentaire du nombre de variables prédictives en dessous de 1000. Une baisse de la précision de la prédiction a été observée pour les deux traits (résultats non présentés), ce qui est conforme aux résultats de [6].

Nous avons en outre étudié un modèle de régression de crête dans lequel nous avons inclus 1000 ARNm aléatoires et en plus les marqueurs AFLP comme prédicteurs. Nous n'avons trouvé aucune situation où la combinaison des ensembles de prédicteurs a entraîné une plus grande précision de prédiction que de les utiliser individuellement (résultats non présentés).


Affiliations

Département de chimie et de biochimie, Ohio State University, Columbus, OH, 43210, États-Unis

Sarah E. Biehn & Steffen Lindert

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Contributions

SEB. et S.L. conceptualisé et conçu l'approche de recherche, modélisé et analysé les données, implémenté le terme de notation dans Rosetta et rédigé l'article.

Auteur correspondant


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