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En quoi une RT-PCR est-elle représentative du contenu en ARN d'une cellule ?

En quoi une RT-PCR est-elle représentative du contenu en ARN d'une cellule ?


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Par exemple, nous collectons d'abord tout le contenu d'ARN d'une lignée cellulaire de mammifère. Disons, par exemple, que nous collectons 80 uL d'ARN avec une concentration de 150 ng/uL. Ensuite, pour fabriquer de l'ADNc, nous prélevons 1 000 ng d'ARN. Cependant, ces 1 000 ng sont un échantillonnage complètement aléatoire de l'ARN total que nous avions. Comment cet échantillon aléatoire d'ARN est-il représentatif du contenu d'ARN à l'origine dans nos cellules ?


Ce que demande le questionneur n'est pas vraiment clair, mais…

… une façon de penser à cela est de se demander quelle est la probabilité qu'un ARN de faible abondance soit absent de l'échantillon prélevé lors de la préparation de l'ARN. Cela rendrait l'échantillon non représentatif au niveau qualitatif.

La question indique que 12 000 ng d'ARN sont isolés. Comme rien d'autre n'est spécifié, je suppose qu'il s'agit d'ARN total. Une estimation approximative de l'ARN total par cellule eucaryote est de 20 pg.

Cela signifie que la préparation est venue de 6 x 105 cellules. (Je suppose un rendement de 100 %, mais cela n'affectera pas vraiment la conclusion.)

Supposons maintenant qu'un ARNm de faible abondance est présent à 10 copies par cellule. La préparation d'ARN total contient donc 6 x 106 copies de cet ARNm de faible abondance.

Nous prélevons un échantillon de 1 000 ng sur le total de 12 000 ng. En d'autres termes nous prenons 1/12ème de la préparation d'ARN. Si cette préparation d'ARN contient 106 copies de l'ARNm de faible abondance, quelle est la probabilité que nous prenions un échantillon qui ne contient aucune copie de cet ARNm de faible abondance ? Ici mes maths me font défaut, mais intuitivement je dis que la probabilité est très très petit.

Maintenant, s'il y a 1 000 ARNm différents de faible abondance dans la cellule, la probabilité de manquer chacun d'eux est très très petit, mais la probabilité globale d'en manquer un est de 1000 x très très petit, alors peut-être très petit.

Je vais continuer à réfléchir à la façon de calculer la valeur de très très petit, mais si quelqu'un veut aider, merci d'avance !


Quelles sont les différences entre la PCR, la RT-PCR, la qPCR et la RT-qPCR ?


La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une technique de biologie moléculaire relativement simple et largement utilisée pour amplifier et détecter des séquences d'ADN et d'ARN. Par rapport aux méthodes traditionnelles de clonage et d'amplification d'ADN, qui peuvent souvent prendre des jours, la PCR ne nécessite que quelques heures. La PCR est très sensible et nécessite une matrice minimale pour la détection et l'amplification de séquences spécifiques. Les méthodes de PCR de base ont encore progressé depuis la simple détection d'ADN et d'ARN. Ci-dessous, nous avons fourni un aperçu des différentes méthodes de PCR et des réactifs que nous fournissons chez Enzo Life Sciences pour vos besoins de recherche. Notre objectif est d'aider les scientifiques à accéder rapidement aux réactifs PCR à utiliser dans leur prochain projet de recherche !

Pour la PCR standard, tout ce dont vous avez besoin est une ADN polymérase, du magnésium, des nucléotides, des amorces, la matrice d'ADN à amplifier et un thermocycleur. Le mécanisme de PCR est aussi simple que son objectif : 1) l'ADN double brin (ADNdb) est dénaturé par la chaleur, 2) les amorces s'alignent sur les brins d'ADN simples et 3) les amorces sont prolongées par l'ADN polymérase, ce qui donne deux copies de l'original brin d'ADN. Le processus de dénaturation, de recuit et d'allongement sur une série de températures et de durées est connu sous le nom d'un cycle d'amplification. Chaque étape du cycle doit être optimisée pour le modèle et le jeu d'amorces utilisés. Ce cycle est répété environ 20 à 40 fois et le produit amplifié peut alors être analysé. La PCR est largement utilisée pour amplifier l'ADN en vue d'une utilisation expérimentale ultérieure. La PCR a également des applications dans les tests génétiques ou pour la détection d'ADN pathogène.

Comme la PCR est une méthode très sensible et que de très petits volumes sont nécessaires pour des réactions uniques, la préparation d'un master mix pour plusieurs réactions est recommandée. Le master mix doit être bien mélangé puis divisé par le nombre de réactions, en s'assurant que chaque réaction contiendra la même quantité d'enzyme, de dNTP et d'amorces. De nombreux fournisseurs, tels qu'Enzo Life Sciences, proposent également des mélanges PCR qui contiennent déjà tout, à l'exception des amorces et de la matrice d'ADN.

Les régions riches en guanine/cytosine (riches en GC) représentent un défi dans les techniques de PCR standard. Les séquences riches en GC sont plus stables que les séquences avec une teneur en GC plus faible. De plus, les séquences riches en GC ont tendance à former des structures secondaires, telles que des boucles en épingle à cheveux. En conséquence, les doubles brins riches en GC sont difficiles à séparer complètement pendant la phase de dénaturation. Par conséquent, l'ADN polymérase ne peut pas synthétiser le nouveau brin sans entrave. Une température de dénaturation plus élevée peut améliorer cela et des ajustements vers une température d'hybridation plus élevée et un temps d'hybridation plus court peuvent empêcher la liaison non spécifique des amorces riches en GC. Des réactifs supplémentaires peuvent améliorer l'amplification des séquences riches en GC. Le DMSO, le glycérol et la bétaïne aident à perturber les structures secondaires causées par les interactions GC et facilitent ainsi la séparation des doubles brins.


RT-PCR et synthèse d'ADNc

La synthèse d'ADN à partir d'une matrice d'ARN, via une transcription inverse, produit un ADN complémentaire (ADNc). Les transcriptases inverses (RT) utilisent une matrice d'ARN et une amorce complémentaire à l'extrémité 3&prime de l'ARN pour diriger la synthèse du premier brin d'ADNc, qui peut être utilisé directement comme matrice pour la réaction en chaîne par polymérase (PCR). Cette combinaison de transcription inverse et de PCR (RT-PCR) permet la détection d'ARN de faible abondance dans un échantillon, et la production de l'ADNc correspondant, facilitant ainsi le clonage de gènes à faible copie. En variante, l'ADNc de premier brin peut être rendu double brin en utilisant l'ADN polymérase I et l'ADN ligase. Ces produits de réaction peuvent être utilisés pour le clonage direct sans amplification. Dans ce cas, l'activité RNase H, soit de la RT soit fournie de manière exogène, est requise.

De nombreux RT sont disponibles auprès de fournisseurs commerciaux. La transcriptase inverse du virus de la myéloblastose aviaire (AMV) et la transcriptase inverse du virus de la leucémie murine de Moloney (M-MuLV, MMLV) sont des RT couramment utilisées dans les flux de travail de biologie moléculaire. La transcriptase inverse ProtoScript ® II est une transcriptase inverse M-MuLV recombinante avec une activité RNase H réduite et une thermostabilité accrue. Il peut être utilisé pour synthétiser l'ADNc du premier brin à des températures plus élevées que le M-MuLV de type sauvage. L'enzyme est active jusqu'à 50 °C, offrant une spécificité plus élevée, un rendement plus élevé d'ADNc et un produit d'ADNc plus complet, jusqu'à 12 kb de longueur.

L'utilisation de RT modifiées améliore l'efficacité de la formation complète du produit, garantissant que la copie de l'extrémité 5&prime du transcrit d'ARNm est complète et permettant la propagation et la caractérisation d'une copie d'ADN fidèle d'une séquence d'ARN. L'utilisation de RT plus thermostables, où les réactions sont effectuées à des températures plus élevées, peut être utile pour la transcription inverse de l'ARN contenant une structure secondaire.

Pour obtenir de l'aide pour comparer les réactifs RT et de synthèse d'ADNc disponibles, consultez notre tableau de sélection de RT/synthèse d'ADNc.

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Ce produit est destiné à des fins de recherche uniquement. Ce produit n'est pas destiné à être utilisé à des fins thérapeutiques ou diagnostiques chez les humains ou les animaux.


Présentation de la qPCR et de la RT-qPCR

La PCR quantitative, qu'elle implique ou non une étape de transcription inverse, est couramment utilisée dans les laboratoires de biologie moléculaire et a révolutionné la manière dont la recherche est menée en raison de son pipeline relativement simple (Figure 2). Ses avantages par rapport à la PCR standard incluent la possibilité de visualiser quelles réactions ont fonctionné en temps réel et sans avoir besoin d'un gel d'agarose. Il permet également une analyse véritablement quantitative. L'une des utilisations les plus courantes de la qPCR consiste à déterminer le nombre de copies d'une séquence d'ADN d'intérêt. En utilisant la quantification absolue, l'utilisateur est capable de déterminer les nombres de copies cibles en référence à une courbe standard de concentration définie d'une manière beaucoup plus précise que jamais. La RT-qPCR, d'autre part, permet d'étudier les changements d'expression génique lors du traitement de systèmes modèles avec des inhibiteurs, des stimulants, de petits ARN interférents (siARN) ou des modèles knock-out, etc. Cette technique est également couramment utilisée pour détecter les changements d'expression à la fois avant (comme contrôle de qualité) et après (confirmation du changement) les expériences RNA-Seq.

Flux de travail d'une expérience qPCR et RT-qPCR standard. Après l'isolement de l'échantillon, l'intégrité est analysée avant la génération d'ADNc et le début du test qPCR à l'aide de colorants intercalants ou de sondes d'hydrolyse. La fluorescence est détectée tout au long des cycles de PCR et utilisée pour générer une courbe d'amplification qui est utilisée pour quantifier l'échantillon cible pendant l'analyse des données.

La préparation des échantillons

L'étape la plus cruciale dans le pipeline qPCR et RT-qPCR est sans doute l'isolement de l'échantillon. Quelle que soit la qualité de la conception de votre test, si le matériau de départ est contaminé ou dégradé, vous n'obtiendrez pas des résultats précis. Un échantillon de bonne qualité est le point de départ de données de bonne qualité. Lors de l'isolement de l'ADN pour la qPCR, il est essentiel qu'il soit exempt de contaminants susceptibles d'inhiber la réaction. Le plus souvent, l'extraction est réalisée à l'aide de kits disponibles dans le commerce, qui ont l'avantage d'être conviviaux, simples et rapides, notamment lorsqu'ils sont intégrés à un système robotisé. Le type d'extraction d'ARN réalisée dépend du type d'ARN requis. La méthode d'extraction la plus couramment utilisée est celle des kits d'extraction d'ARN total. Cela isole l'ARN messager (l'ARNm précurseur de la synthèse des protéines), l'ARN de transfert (l'ARNt décode l'ARNm lors de la traduction avec le ribosome) et l'ARN ribosomique (l'ARNr lit l'ordre des acides aminés lors de la traduction et les relie au ribosome), mais souvent (pas toujours ) ne parvient pas à isoler les ARN plus petits tels que l'ARN non codant (ARN fonctionnel ARNnc transcrit à partir de l'ADN, mais non traduit en protéines) et les micro-ARN (les miARN régulent l'expression des gènes en inhibant la traduction de l'ARNm). Avec l'explosion de l'intérêt pour les ARN amplificateurs (ARNe petits ARN transcrits à partir d'amplificateurs) qui peuvent varier considérablement en longueur, il est essentiel que les méthodes d'extraction soient soigneusement étudiées pour assurer l'isolement de l'ARN d'intérêt. En plus des considérations d'extraction, il est essentiel que l'ARN ne soit pas contaminé par l'ADN, car celui-ci ne peut pas être distingué de l'ADNc dans la réaction qPCR. Pour surmonter cela, la plupart des protocoles reposent sur l'utilisation d'un traitement à la DNase I qui digère tout ADN.

Pendant l'isolement, la dégradation de l'échantillon est toujours possible. En conséquence, tout bon pipeline impliquera une étape de contrôle de la qualité pour évaluer l'intégrité de l'échantillon. Cela peut être fait rapidement en évaluant le ratio A260/280 (comparant l'absorbance à 260 vs 280 nm, une mesure de contamination par les protéines) et le ratio A260/230 (260 vs 230 nm, une indication de la présence de contaminants organiques) de l'échantillon cependant, ce n'est pas très précis et est sujet à l'interférence de plusieurs facteurs. Une mesure plus précise est l'utilisation d'un système d'électrophorèse sur gel virtuel tel que l'Aligent Bioanalyser. Ce système fonctionne à l'aide d'une puce qui sépare l'ARN en fonction de sa taille et détecte l'ARN par des colorants fluorescents. Ceci est ensuite traduit par un ordinateur qui, à l'aide d'un algorithme, produit un numéro d'intégrité de l'ARN (RIN) qui représente la qualité de l'échantillon, 10 étant le plus élevé.

L'étape finale de la préparation des échantillons pour la RT-qPCR est la génération d'ADNc. L'ADNc utilise la RT-PCR (Figure 1) pour générer l'ADNc à partir de la matrice d'ARN en utilisant une transcriptase inverse. Cela peut être fait en utilisant des amorces oligo(dT), qui s'hybrident à la queue polyA de l'ARN, ou en utilisant des hexamères aléatoires (amorces de six à neuf bases de long, qui s'hybrident en plusieurs points le long du transcrit d'ARN). Généralement, un mélange des deux amorces est considéré comme le meilleur car il permet l'amplification de l'ARN de queue polyA (principalement l'ARNm) et de l'ARN ne contenant pas de polyA (ARNt, ARNr, etc.). En plus de la considération de l'amorce, la génération d'ADNc peut faire partie de l'expérience qPCR (appelée RT-qPCR en une étape) ou est générée séparément de la qPCR (RT-qPCR en deux étapes), comme le montre la figure 3. L'avantage de RT-qPCR en une étape est qu'il y a moins de variation expérimentale et moins de risques de contamination, ainsi que permettre un criblage à haut débit, par conséquent, cette option est généralement utilisée pour le criblage clinique. Cependant, cela signifie que l'échantillon ne peut être utilisé qu'un nombre limité de fois, alors que la RT-qPCR en deux étapes permet plus de réactions par échantillon et des options d'amorçage flexibles et est généralement l'option préférée pour l'analyse de l'expression génique à grande échelle, mais ne nécessitent plus d'optimisation.


Les éosinophiles humains et souris ont une activité antivirale contre le virus parainfluenza

Les virus respiratoires provoquent des exacerbations de l'asthme. Étant donné que les éosinophiles sont les leucocytes les plus importants dans les voies respiratoires de 60 à 70 % des patients asthmatiques, nous avons évalué les effets des éosinophiles sur un virus respiratoire courant, le parainfluenza 1, dans les poumons. Les éosinophiles recrutés dans les voies respiratoires des souris de type sauvage après sensibilisation à l'ovalbumine et provocation ont significativement diminué l'ARN du virus parainfluenza dans les poumons 4 jours après l'infection par rapport aux animaux non sensibilisés. Cet effet antiviral a également été observé chez les souris transgéniques IL-5 avec une abondance d'éosinophiles des voies respiratoires (NJ.1726) mais a été perdu chez les souris transgéniques déficientes en éosinophiles (PHIL) et chez les souris transgéniques IL-5 croisées avec des souris déficientes en éosinophiles (NJ .1726-PHIL). La perte de la protéine des granules d'éosinophiles éosinophile peroxydase, en utilisant des souris transgéniques déficientes en éosinophiles peroxydase, n'a pas réduit l'effet antiviral des éosinophiles. Les mécanismes antiviraux éosinophiles ont également été explorés in vitro. Les éosinophiles humains isolés ont considérablement réduit les titres de virus parainfluenza. Cet effet n'impliquait pas la dégradation de l'ARN viral par les RNases des granules éosinophiles. Cependant, les éosinophiles traités avec un inhibiteur de l'oxyde nitrique synthase ont perdu leur activité antivirale, suggérant que les éosinophiles atténuent l'infectiosité virale par la production d'oxyde nitrique. Par conséquent, la production d'oxyde nitrique éosinophile a été mesurée avec une sonde fluorescente intracellulaire. Les éosinophiles ont produit de l'oxyde nitrique en réponse au virus et à un agoniste synthétique du récepteur immunitaire inné détecteur de virus, Toll-like receptor (TLR) 7. L'IFNγ a augmenté l'expression de l'éosinophile TLR7 et a potentialisé la production d'oxyde nitrique induite par TLR7. Ces résultats suggèrent que les éosinophiles favorisent la clairance virale dans les poumons et contribuent aux réponses immunitaires innées contre les infections virales respiratoires chez l'homme.

Les éosinophiles humains et murins sont antiviraux contre le virus parainfluenza via la production d'oxyde nitrique et en servant d'hôte sans issue pour l'infection virale, mais pas via la production de RNases granulaires éosinophiles ou de peroxydase éosinophile. Les éosinophiles peuvent avoir un rôle antiviral sous-estimé dans les infections des voies respiratoires chez l'homme.

Les éosinophiles s'infiltrent dans les voies respiratoires d'environ deux tiers des patients asthmatiques (1) et ont été liés expérimentalement à l'hyperréactivité des voies respiratoires (2) et au remodelage des voies respiratoires (3). Naturellement, cela a conduit à l'hypothèse que les éosinophiles sont uniquement inadaptés dans l'asthme et, par conséquent, de nombreux traitements de l'asthme sont conçus pour réduire l'inflammation éosinophile (4-7). Cette stratégie a produit des résultats variables. De nombreux patients asthmatiques restent mal contrôlés malgré un traitement maximal (8). Les exacerbations des symptômes de l'asthme continuent de causer une morbidité, des dépenses de santé et des décès importants (9, 10). De plus, la prévention et le traitement de la cause la plus fréquente d'exacerbation de l'asthme, les infections virales respiratoires, sont pratiquement inexistants (11). Ces lacunes mettent en évidence notre compréhension limitée de la biologie des éosinophiles et ont incité des études à tenter de définir le rôle des éosinophiles lors des infections virales respiratoires dans l'asthme. Par exemple, les souris transgéniques IL-5 avec des éosinophiles systémiques élevés avaient des titres plus faibles de virus respiratoire syncytial (VRS) par rapport aux souris de type sauvage (12), tandis que les souris transgéniques IL-5 avec une éosinophilie des voies respiratoires avaient des titres plus faibles de virus de la pneumonie chez les souris par rapport avec commandes (13). De même, nous avons constaté que les éosinophiles recrutés dans les voies respiratoires après sensibilisation à l'ovalbumine étaient associés à moins de virus parainfluenza 1 dans les poumons des cobayes, bien que ces expériences n'aient pas été conçues pour établir un rôle causal pour les éosinophiles (14). Collectivement, ces études suggèrent que les éosinophiles contribuent à l'immunité antivirale dans les poumons.

Les éosinophiles détectent les virus envahissants via plusieurs mécanismes, notamment les interactions récepteur de type Toll (TLR)-ligand (15). TLR7 se lie à l'ARN simple brin qui est un motif génomique commun pour de nombreux virus respiratoires (16). La ligature de TLR7 déclenche une signalisation dépendant de la protéine adaptatrice de la réponse primaire de différenciation myéloïde 88 (MyD88) qui favorise une réponse antivirale éosinophile (12). Cependant, les médiateurs responsables de l'activité antivirale des éosinophiles sont en débat. Les éosinophiles libèrent une variété de protéines granulaires après activation qui peuvent être antivirales. La protéine cationique des éosinophiles et la neurotoxine dérivée des éosinophiles sont des membres de la superfamille des RNases A, et il est proposé qu'elles aient un effet virucide en dégradant les génomes d'ARN viraux (13, 17, 18). La peroxydase éosinophile est également libérée par les granules d'éosinophiles et contribue à la génération d'espèces réactives de l'oxygène antimicrobien (19). Que les éosinophiles ciblent tous les virus avec ces protéines ou par des mécanismes uniques nécessite une étude plus approfondie.

Le virus parainfluenza est l'un des nombreux virus connus pour provoquer des exacerbations de l'asthme (20). La parainfluenza est détectée dans les voies respiratoires de jusqu'à 18 % des adultes lors d'exacerbations aiguës de l'asthme (21). Sa prévalence est similaire à celle de la grippe et du coronavirus, et significativement plus élevée que le VRS chez les adultes. Étant donné qu'environ 16 millions de visites de soins aigus pour exacerbations d'asthme surviennent chaque année (22), les exacerbations induites par la parainfluenza représentent un fardeau considérable de la maladie, mais l'interaction entre le virus parainfluenza et les éosinophiles n'est pas clairement définie.

Dans cette étude, nous avons étudié l'hypothèse selon laquelle les éosinophiles inhibent l'infection par le virus parainfluenza dans les poumons. Les expériences décrites ici ont évalué l'effet des éosinophiles sur la clairance du virus parainfluenza in vivo et évalué le rôle des médiateurs antiviraux potentiels. Nous avons également examiné les effets de l'IFNγ sur les réponses antivirales des éosinophiles en tant que mécanisme potentiel pour augmenter l'activité antivirale médiée par les éosinophiles.

Les souris exprimant l'IL-5 dans l'épithélium des voies respiratoires (NJ.1726) (23), les souris déficientes en éosinophiles (PHIL) (24) et les souris déficientes en éosinophiles peroxydase (25) ont été maintenues par rétrocroisement sur un fond C57BL/6. Les animaux ont été manipulés conformément à la loi américaine sur la protection des animaux. Les protocoles ont été approuvés par les comités institutionnels de protection et d'utilisation des animaux de l'Oregon Health & Science University (Portland, OR) et de la Mayo Clinic (Scottsdale, AZ).

Le virus parainfluenza (virus Sendai ATCC, Manassas, VA) a été cultivé dans des monocouches de cellules de rein de singe rhésus (RMK), purifié par centrifugation de densité de saccharose et titré dans des cellules RMK (26) (voir les supports et méthodes en ligne). Les titres ont été exprimés en multiples de la dose infectieuse de 50 % de culture tissulaire (TCID50 quantité de virus nécessaire pour infecter 50 % des monocouches de RMK).

Des souris femelles âgées de 6 à 8 semaines ont été sensibilisées par injection intrapéritonéale avec 0,04 g et 0,2 g d'ovalbumine (Sigma, St. Louis, MO) avec de l'alun aux jours 1 et 14, respectivement. Aux jours 24, 26 et 28, les souris ont été anesthésiées avec de la kétamine (45 mg/kg) et de la xylazine (8 mg/kg) et soumises à une provocation intratrachéale à 2 % d'ovalbumine. Les souris ont été infectées par parainfluenza (2,8 × 10 4 TCID50 unités) par voie intranasale au jour 27. Au jour 31, les poumons ont été lavés et homogénéisés (voir les supports et méthodes en ligne).

L'ARN de la protéine matricielle Parainfluenza dans les homogénats pulmonaires a été amplifié par RT-PCR en temps réel et normalisé à 18S. L'expression relative de l'ARN a été convertie en réplicats absolus d'ARN à l'aide d'une courbe standard d'ARN parainfluenza (voir les supports et méthodes en ligne).

Les éosinophiles ont été isolés à plus de 99 % de pureté et à plus de 99 % de viabilité à partir de sang de volontaires humains sains par centrifugation de densité en utilisant Ficoll-Paque Plus (Sigma) et sélection négative (voir les supports et méthodes en ligne). Le protocole a été approuvé par l'Institutional Review Board. Les sujets ont fourni un consentement éclairé écrit.

Les éosinophiles humains ont été incubés pendant une nuit avec ou sans IFNy (300 U/ml). Le milieu a été retiré et le parainfluenza (1 × 10 5 TCID50) a été ajouté pendant 2 heures. Certaines cultures ont été prétraitées avec un inhibiteur de l'oxyde nitrique synthase, le chlorhydrate d'ester méthylique de Nω-nitro-L-arginine ([ l -NOM] 100 M Sigma) 30 minutes avant l'inoculation. L'infectivité virale a été quantifiée dans les cellules RMK par un test d'hemadsorption. Les titres infectieux sont exprimés en TCID50 U/ml de surnageant de culture.

Des éosinophiles humains ont été chargés d'une sonde fluorescente détectant l'oxyde nitrique (Strem, Newburyport, MA) et exposés à un parainfluenza ou à un agoniste synthétique du TLR7, voir les supports et méthodes en ligne. La fluorescence a été mesurée 60 minutes plus tard par un lecteur de plaque.

Des éosinophiles humains ont été inoculés avec du parainfluenza (1 × 10 5 TCID50) pendant 2 heures, lavé pour éliminer le virus non lié et maintenu dans un milieu frais pendant 72 heures. L'ARN viral dans les surnageants de culture a été quantifié toutes les 24 heures par RT-PCR en temps réel (voir les supports et méthodes en ligne).

L'expression des éosinophiles TLR7 a été évaluée par RT-PCR en temps réel et immunofluorescence (voir les supports et méthodes en ligne).

Les données ont été comparées par ANOVA à un facteur avec l'analyse de Bonferroni post-hoc test. Les données sont présentées sous forme de moyenne (± SEM). UNE P une valeur inférieure à 0,05 a été considérée comme significative.

Les souris C57BL/6, sensibilisées et provoquées par l'ovalbumine, présentaient une réduction significative (d'environ 90 %) de l'ARN du virus parainfluenza dans les poumons 4 jours après l'infection par rapport aux animaux non sensibilisés (figure 1A). La sensibilisation et la provocation à l'ovalbumine ont provoqué une augmentation substantielle des éosinophiles dans le liquide de lavage bronchoalvéolaire, ainsi que des macrophages et des neutrophiles (figure 1B).

Figure 1. La sensibilisation et la provocation à l'ovalbumine augmentent la clairance de l'infection par le virus parainfluenza dans les poumons in vivo. (UNE) Des souris C57BL/6 ont été sensibilisées (intrapéritonéale, jours 1 et 14) et soumises à une provocation (intratrachéale, jours 24, 26 et 28) avec de l'ovalbumine et infectées par le virus parainfluenza (intranasale, jour 27). L'ARN du virus parainfluenza a été quantifié par RT-PCR en temps réel 4 jours après l'infection. Les souris sensibilisées et provoquées présentaient une réduction significative de l'ARN parainfluenza dans les poumons par rapport aux souris témoins non sensibilisées et infectées par la parainfluenza. (B) La sensibilisation à l'ovalbumine et la provocation ont augmenté les cellules inflammatoires totales, les macrophages (MΦ), les éosinophiles (Eos) et les neutrophiles (Neut) dans le liquide de lavage bronchoalvéolaire par rapport aux témoins non sensibilisés. Il n'y avait aucune différence dans les lymphocytes (lymphe) entre les groupes (m = 5). *P < 0,05 par rapport aux souris témoins non sensibilisées et infectées par le parainfluenza. Les données sont présentées sous forme de moyennes (±SEM).

Les souris NJ.1726 (↑Eos ↑IL-5) expriment de manière constitutive l'IL-5 dans l'épithélium pulmonaire et ont un nombre élevé d'éosinophiles dans les poumons (23). 4 jours après l'infection, l'ARN parainfluenza était significativement diminué dans les poumons des souris NJ.1726 par rapport aux témoins de la portée de type sauvage (figure 2A). Des souris transgéniques NJ.1726 IL-5 ont été croisées avec des souris PHIL (ØEos), qui sont congénitalement dépourvues d'éosinophiles, pour différencier l'effet des éosinophiles de l'IL-5. La teneur en ARN parainfluenza dans les poumons des souris NJ.1726-PHIL déficientes en éosinophiles exprimant l'IL-5 (ØEos ↑IL-5) était similaire à celle des souris de type sauvage infectées, indiquant que les éosinophiles, et non l'IL-5, étaient médiateurs l'effet antiviral. De même, les souris PHIL déficientes en éosinophiles seules avaient des niveaux d'ARN parainfluenza comparables à ceux des souris de type sauvage infectées (figure 2A). Le lavage broncho-alvéolaire a confirmé une augmentation significative des éosinophiles dans les voies respiratoires des souris NJ.1726 par rapport aux témoins de la même portée de type sauvage, et une absence d'éosinophiles chez les souris PHIL et NJ.1726-PHIL (figure 2B). Il n'y avait pas de différences significatives dans les leucocytes totaux ou d'autres sous-ensembles de cellules inflammatoires dans le lavage bronchoalvéolaire entre les groupes (figure 2C).

Figure 2. Les éosinophiles favorisent la clairance du virus parainfluenza dans le poumon murin in vivo. Souris de contrôle de type sauvage (WT) (C57BL/6), souris transgéniques avec des éosinophiles pulmonaires élevés en raison de la surexpression de l'IL-5 par un promoteur spécifique du poumon (NJ.1726 ↑Eos ↑IL-5), souris transgéniques avec des poumons élevés L'IL-5 mais dépourvue d'éosinophiles (NJ.1726-PHIL ØEos ↑IL-5), et des souris déficientes en éosinophiles (souris transgéniques PHIL ØEos) ont été infectées par le virus parainfluenza (intranasal). (UNE) La teneur en ARN parainfluenza dans le poumon a été quantifiée par RT-PCR en temps réel 4 jours après l'infection. Les souris NJ.1726 (↑Eos ↑IL-5) avaient un ARN parainfluenza significativement réduit par rapport aux souris témoins (WT). Les souris NJ.1726-PHIL (ØEos ↑IL-5) et les souris PHIL (ØEos) avaient des niveaux d'ARN parainfluenza comparables à WT. (B) Le lavage broncho-alvéolaire de souris NJ.1726 infectées par le parainfluenza (↑Eos ↑IL-5) contenait significativement plus d'éosinophiles par rapport à tous les autres groupes. Aucun éosinophile n'a été détecté dans le lavage bronchoalvéolaire chez les souris PHIL (ØEos) ou NJ.1726-PHIL (ØEos ↑IL-5). (C) Il n'y avait aucune différence dans les autres types de cellules inflammatoires entre les groupes (m = 7–10). *P < 0.05. Les données sont présentées sous forme de moyennes (±SEM).

La peroxydase éosinophile est une protéine granulaire libérée par les éosinophiles. Des souris de type sauvage et transgéniques déficientes en éosinophiles peroxydase ont été sensibilisées et exposées à l'ovalbumine et infectées par le virus parainfluenza. L'ARN du virus parainfluenza a été quantifié à partir d'un poumon homogénéisé par RT-PCR en temps réel 4 jours après l'infection. La sensibilisation et la provocation à l'ovalbumine étaient associées à une réduction significative de l'ARN parainfluenza chez les souris de type sauvage et les souris déficientes en peroxydase éosinophile par rapport aux témoins non sensibilisés (figure 3A), indiquant que l'effet antiviral médié par les éosinophiles ne dépendait pas de la libération de peroxydase éosinophile. Les souris de type sauvage sensibilisées et provoquées et les souris déficientes en peroxydase éosinophile avaient des éosinophiles des voies respiratoires significativement élevés par rapport aux souris de type sauvage non sensibilisées et déficientes en peroxydase éosinophile (figures 3B et 3C).

Figure 3. La peroxydase éosinophile n'est pas requise pour l'effet antiviral des éosinophiles in vivo. (UNE) Des souris WT et des souris knock-out pour la peroxydase éosinophile (EPX −/− ) ont été sensibilisées et provoquées (S/C) avec de l'ovalbumine et infectées par le virus parainfluenza. L'ARN viral a été quantifié par RT-PCR en temps réel 4 jours après l'infection. Les souris WT sensibilisées et provoquées (WT S/C) et EPX −/− (EPX −/− S/C) présentaient une réduction significative de l'ARN parainfluenza dans les poumons par rapport aux souris témoins non sensibilisées et infectées par la parainfluenza. (B) La sensibilisation à l'ovalbumine et la provocation ont augmenté les éosinophiles dans le liquide de lavage bronchoalvéolaire chez les souris WT et EPX −/− par rapport aux témoins non sensibilisés. (C) Il n'y avait aucune différence dans les autres types de cellules inflammatoires entre les groupes (m = 4–5). *P < 0.05. Les données sont présentées sous forme de moyennes (±SEM).

Des éosinophiles humains isolés ont été inoculés avec du parainfluenza pendant 2 heures, puis lavés pour éliminer le virus non lié et cultivés dans un milieu frais pendant 72 heures pour évaluer si le parainfluenza infecte directement les éosinophiles et, le cas échéant, si les éosinophiles soutiennent la production de descendance virale. L'ARN parainfluenza, quantifié par RT-PCR en temps réel à partir de surnageants de culture, a augmenté progressivement sur 72 heures ( Figure 4 , axe gauche), indiquant que le virus est capable d'infecter les éosinophiles et de produire des transcrits viraux. Cependant, malgré la réplication, les titres du virus parainfluenza, tels que déterminés par le test d'hémadsorption, sont restés indétectables à ces moments (Figure 4, axe droit), indiquant que les éosinophiles ne supportent pas la production de virus infectieux.

Figure 4. Les éosinophiles infectés par le parainfluenza produisent une descendance virale qui n'est pas infectieuse. Les éosinophiles humains ont été isolés du sang périphérique et infectés par le virus parainfluenza pendant 2 heures, lavés pour éliminer le virus non lié et maintenus en culture pendant 72 heures. L'ARN parainfluenza des surnageants d'éosinophiles a été quantifié par RT-PCR en temps réel toutes les 24 heures (carré plein, axe gauche). Simultanément, les titres du virus parainfluenza infectieux ont été évalués par un test d'hémadsorption utilisant des cellules rénales de singe rhésus et exprimés en dose infectieuse de 50 % de culture tissulaire (TCID50) U/ml (cercle ouvert, axe droit) (m = 4). Les données sont présentées sous forme de moyennes (±SEM).

Les niveaux d'ARN codant pour trois protéines structurelles du virus parainfluenza (c. résulte de la libération d'ARNases granulaires éosinophiles. Simultanément, les titres du virus parainfluenza ont été évalués à ce moment dans les cellules RMK par un test d'hémadsorption. Les éosinophiles ont significativement diminué les titres de virus parainfluenza par rapport aux cultures inoculées de virus sans éosinophiles, montrant que les éosinophiles réduisent l'infectivité du virus parainfluenza (figure 5A). Une réduction supplémentaire des titres de virus a été observée lorsque les éosinophiles ont été prétraités avec de l'IFNγ. Cependant, les quantités d'ARN pour les trois protéines structurelles du virus parainfluenza étaient similaires entre les cultures contenant des éosinophiles infectés par le virus et les cultures inoculées par le virus dépourvues d'éosinophiles (figure 5B), démontrant que la réduction de l'infectivité n'était pas due à la dégradation du génome de l'ARN viral. par les RNases des granules éosinophiles.

Figure 5. L'activité antivirale des éosinophiles contre le parainfluenza n'implique pas les RNases granulaires. Des éosinophiles humains ont été isolés du sang périphérique et infectés par le virus parainfluenza. (UNE) L'infectiosité virale a été évaluée 2 heures après l'inoculation par un test d'hemadsorption et exprimée en TCID viral50 U/ml. L'infectivité parainfluenza était presque indétectable dans les surnageants d'éosinophiles cultivés (Eos) et d'éosinophiles prétraités avec IFNγ (Eos + IFNγ) par rapport au virus parainfluenza cultivé dans des milieux sans éosinophiles (Media + IFNγ). (B) L'ARN codant pour les protéines structurelles, la matrice, la fusion et la nucléoprotéine (NP) du virus parainfluenza a été quantifié dans les surnageants d'éosinophiles par RT-PCR en temps réel 2 heures après l'inoculation. Aucune différence n'a été détectée entre les trois gènes, ce qui suggère que la réduction de l'infectiosité parainfluenza n'était pas due à la dégradation de l'ARN viral par les RNases des granules éosinophiles (m = 4–7). *P < 0.05. Les données sont présentées sous forme de moyennes (±SEM).

Le virus parainfluenza a été incubé en présence d'éosinophiles humains isolés pendant 2 heures, puis l'infectivité virale a été quantifiée par titrage dans des cellules RMK (via un test d'hémadsorption). Comme le montre la figure 6A, les éosinophiles ont significativement diminué les titres de virus parainfluenza par rapport aux parainfluenza incubés dans des milieux sans éosinophiles. Les éosinophiles ont été cultivés avec l'inhibiteur de l'oxyde nitrique synthase, l -NOM, pour déterminer si l'effet antiviral médié par les éosinophiles était dû à la production d'oxyde nitrique. Éosinophiles traités avec l -NAME lost their ability to reduce virus titers, indicating that, upon exposure to virus, eosinophils attenuate viral infectivity through the production of nitric oxide ( Figure 6A ). The quantity of nitric oxide produced by eosinophils was evaluated with a copper-conjugated intracellular nitric oxide–detecting fluorescent probe 1 hour after addition of virus. Eosinophils exposed to parainfluenza virus had significantly increased fluorescence, indicating that eosinophils produce nitric oxide in response to parainfluenza infection. This increased fluorescence was blocked by l -NAME, confirming that nitric oxide was the mediator responsible ( Figures 6B and 6C ).

Figure 6. Eosinophil-derived nitric oxide reduces parainfluenza virus infectivity. Human eosinophils isolated from peripheral blood were cultured overnight with IFNγ. (UNE) Eosinophils were treated with the nitric oxide synthase inhibitor Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride ( l -NAME 100 μM) or vehicle for 30 minutes, then infected with parainfluenza virus. Virus infectivity was quantified 2 hours after infection by hemadsorption assay and expressed as viral TCID50 U/ml. Parainfluenza virus infectivity was significantly decreased in the presence of eosinophils. Eosinophils treated with l -NAME lost their antiviral activity (m = 4). (B) Nitric oxide production was assessed using an intracellular nitric oxide–detecting fluorescent probe. Eosinophils loaded with the probe were treated with l -NAME or vehicle and infected with parainfluenza for 1 hour. Eosinophil fluorescence increased significantly in response to parainfluenza infection, indicating an increase in nitric oxide production by eosinophils. l -NAME treatment prevented parainfluenza-induced nitric oxide production by eosinophils (m = 4). (C) Representative images of eosinophils loaded with nitric oxide–detecting fluorophore. Magnification, ×100. *P < 0.05. Data are presented as means (±SEM).

Eosinophils were cultured with or without IFNγ overnight. IFNγ increased eosinophil TLR7 expression relative to unstimulated eosinophils, both quantitatively by real-time RT-PCR ( Figure 7A ) and qualitatively by immunostaining ( Figure 7B ). Eosinophils’ response to TLR7 agonist was also evaluated with a nitric oxide–detecting fluorescent probe. Eosinophils treated for 1 hour with the synthetic TLR7 agonist, R837, had significantly increased fluorescence compared with vehicle-treated controls, indicating that TLR7 agonist induces nitric oxide production ( Figures 7C and 7D ). R837-mediated nitric oxide production was potentiated in eosinophils exposed to IFNγ. l -NAME and the oligonucleotide TLR7 antagonist, IRS661, but not a control oligonucleotide, blocked R837-induced nitric oxide production.

Figure 7. IFNγ up-regulates Toll-like receptor 7 (TLR7) expression and potentiates TLR7-induced nitric oxide production in eosinophils. Human eosinophils were isolated from peripheral blood and grown in culture. (UNE) TLR7 expression was quantified by real-time RT-PCR from eosinophils treated with or without IFNγ. TLR7 RNA was significantly increased in eosinophils treated with IFNγ compared with untreated eosinophils (m = 5). (B) Eosinophils were immunostained with antibodies against TLR7 (green), and nuclei were labeled with 4′,6-diamidino-2-phenylindole (blue). TLR7 was expressed in unstimulated (−IFNγ) and IFNγ stimulated (+IFNγ) eosinophils. Images obtained with an LSM780 confocal microscope (numerical aperture 1.4 Zeiss, Thornwood, NY). (C) Eosinophils were loaded with an intracellular nitric oxide–detecting fluorescent probe and stimulated with synthetic TLR7 agonist R837. Eosinophil fluorescence increased in response to R837. IFNγ pretreatment potentiated the R837-induced increase in fluorescence. R837-induced fluorescence was blocked by l -NAME and by the oligonucleotide TLR7 antagonist IRS661, but not by a control oligonucleotide (IRS control) (m = 6). () Representative images of eosinophils loaded with nitric oxide–detecting fluorophore. Magnification, ×100. *P < 0.05 compared with no IFNγ control. # P < 0.05 compared with all other groups, except between IFNγ-treated R837 and R837 + IRS control. Data are presented as means (±SEM).

Our results demonstrate a significant antiviral effect of eosinophils on parainfluenza virus infection in mouse airways in vivo and in isolated human eosinophils in vitro. Eosinophils appear to mediate their antiviral effects via both passive and proactive mechanisms. Specifically, our data show that eosinophils are a “dead-end” cellular host for parainfluenza, failing to propagate infectious viral progeny after infection. Thus, elevated eosinophil numbers in the lung may passively disrupt airway infection by acting as a cellular decoy and/or “sink,” interfering with the progressive expansion of viral numbers during infection. Our data also show that eosinophils proactively mediated antiviral activities through the production of nitric oxide and up-regulation of TLR7. In contrast, we did not find evidence that eosinophils directly attenuate parainfluenza through the release of eosinophil peroxidase or by degrading the viral RNA genome through the release of granule RNases.

These findings expand on prior eosinophil studies (12–14, 17, 18, 27) by establishing an antiviral role for eosinophils against parainfluenza virus, while suggesting that key differences exist in the eosinophils’ antiviral mechanisms against different viruses. Previous studies proposed that eosinophils inhibit RSV and pneumonia virus in mice, in part via the degradation of viral RNA genomes by eosinophils’ granule RNases, eosinophil cationic protein, and eosinophil-derived neurotoxin (13, 17, 18). However, we found that eosinophils did not alter the quantity of viral RNA transcripts for three key parainfluenza virus structural proteins (i.e., matrix, fusion, and nucleoprotein), despite causing a substantial reduction in parainfluenza infectivity, titered in RMK cells by hemadsorption assay. This suggests that eosinophils do not inhibit parainfluenza through RNase activity on the viral genome. Importantly, our methods differed from prior studies by quantifying both viral RNA and infectivity compared with only assessing viral infectivity after treating infected eosinophils with RNase inhibitors. Concurrent measurement of viral RNA levels and infectivity led to the additional finding that, although human eosinophils infected with parainfluenza produce viral RNA, these viral progeny are not infectious. This phenomenon, termed an “abortive” infection, has been described for many viruses, including RSV (28) and coronavirus (29) in macrophages, and influenza A in neutrophils (30), as well as for parainfluenza virus in Madin-Darby bovine kidney cells (31) and chick embryo fibroblasts (32). Evidence suggests that specific virus and host cell characteristics impact productive versus abortive outcomes during virus infections (33), but those characteristics require further investigation.

Eosinophils also inhibit parainfluenza through the production of nitric oxide. Previously, systemic suppression of nitric oxide production using an inhibitor of nitric oxide synthase delayed clearance of RSV in wild-type mice and in IL-5 transgenic animals with systemic eosinophilia in vivo (12, 34). Given the widespread expression of nitric oxide synthases, however, these studies were unable to distinguish the specific role of eosinophil-derived nitric oxide, which our study has elucidated. The ability of eosinophils to produce nitric oxide has been suspected for some time, given the presence of both constitutive and inducible nitric oxide synthase isoforms in eosinophils (35), but detecting nitric oxide has historically been challenging due to its short half-life and rapid diffusion across biologic membranes (36). These issues were overcome by using a copper-conjugated intracellularly retained fluorescent probe. We found that eosinophils generate nitric oxide in response to virus infection, and in response to stimulation with synthetic TLR7 agonist. IFNγ potentiated TLR7-mediated nitric oxide production in eosinophils, likely in part through the up-regulation of TLR7 expression. Thus, our results show that antiviral cytokine signaling augments eosinophils’ viral detection and their antiviral nitric oxide response.

Nitric oxide mediates antiviral effects via the production of a variety of reactive nitrogen products that inhibit viral proteases (37), and alter host cell function through nitrosylation of tyrosine and thiol groups (38). The consequences of these nitrogen species are diverse, ranging from inhibition of virus protein and RNA synthesis to potentiation of inflammation and injury to the respiratory tract (39). Nitric oxide also regulates many other physiologic processes, including eosinophil migration (40) and survival (41, 42), airway epithelial cell ciliary motility (43), and airway caliber through airway smooth muscle relaxation (44). Eosinophil-derived nitric oxide may affect multiple functions in the airway beyond what our experiments were designed to assess.

Eosinophils’ attenuation of parainfluenza virus infection was not dependent on the release of eosinophil peroxidase. Eosinophil peroxidase is a granule protein that, together with the respiratory burst from activated eosinophils, generates potent reactive oxygen species that have been suggested to contribute to host immune defense (45). For example, eosinophil peroxidase has been shown to have virucidal effects against human immunodeficiency virus in vitro (46). However, the role of eosinophil peroxidase in vivo as a host defense mechanism remains unclear. Eosinophil peroxidase deficiency had no effect in an experimental model of helminthic parasite infections in mice (47), and its deficiency has also been detected in humans without manifesting an apparent phenotype (48). Our data further suggest that eosinophil peroxidase has no role in eosinophils’ antiviral activity against parainfluenza.

Importantly, our experiments differentiate the effects of eosinophils’ versus IL-5. Although NJ.1726 IL-5 transgenic mice (↑Eos ↑IL-5) with an abundance of airway eosinophils had reduced parainfluenza virus in the lung, NJ.1726-PHIL mice (ØEos ↑IL-5) with elevated IL-5 in the absence of eosinophils did not. This is pertinent given the presence of IL-5 receptors on leukocytes other than eosinophils, including macrophages and neutrophils (49), which could have contributed to the antiviral effect in vivo. Furthermore, our data demonstrate that, although an induced airway eosinophilia promoted viral clearance, clearance of virus was similar for eosinophil-deficient mice relative to wild-type control animals. This suggests that the presence of a specific airway eosinophilia mediates one or more unique antiviral mechanisms not occurring at homeostatic baseline, and underlines the need for better characterization of asthma phenotypes when evaluating respiratory virus infections in humans.

Human studies have historically been confounded by the heterogeneity of asthma phenotypes (50), the need for invasive bronchoscopic testing, the immune effects of corticosteroid treatment, differences in virus detection methods (i.e., PCR, ELISA, culture) and the variety of respiratory viruses that cause asthma exacerbations (20). Recent trials that studied exacerbation rates in well characterized steroid-resistant eosinophilic subjects with asthma treated with mepolizumab, a monoclonal antibody against IL-5, found no difference in the incidence of respiratory tract infections (4, 5). However, airway infections were rare events, and were diagnosed clinically without objective evidence of the presence of an infecting virus. Furthermore, these trials did not quantify airway and lung parenchymal eosinophils, nor did they characterize the eosinophils’ activation state after treatment. Nonetheless, future studies that define the interaction between eosinophils and viruses may lead to novel treatment targets for eosinophilic asthma and for respiratory virus infections in humans.

The results of our study paradoxically suggest that eosinophils have beneficial antiviral effects during respiratory virus infections despite considerable evidence linking viruses to asthma exacerbations (20, 21). However, we cannot conclude that eosinophils’ antiviral effects result in fewer exacerbations. On the contrary, it is possible, and perhaps likely, that eosinophils’ ability to detect and respond to viruses promotes an exuberant, and ultimately detrimental, airway inflammatory response in subjects with asthma. Although our study did not specifically address airway physiology, Adamko and colleagues (14) found that eosinophils mediate virus-induced airway hyperreactivity in sensitized guinea pigs, and were associated with lower viral titers, yet lower viral titers did not improve airway hyperreactivity. Thus, the negative effects of activated eosinophils’ in the airway may mask any positive impact from fewer viral transcripts. Consequently, as therapies become progressively more targeted against pulmonary eosinophils, there will be an even greater need for understanding the complexity of eosinophil biology in the lungs.


Advantages & Limitations of scRNA-Seq Assays

scRNA-Seq is a very powerful method that allows transcriptomic analysis of heterogeneous tissue, or dynamic processes in one single experiment. Without microdissection or FACS-sorting, samples can be directly prepared for the scRNA-Seq protocol. Depending on the number of cells and the sequencing depth, scRNA-Seq can be very sensitive and detect a population representing less than 1% of the total population.

Because of the quantity of information generated by scRNA-Seq, some of the protocol steps have to be handled with care. The preparation of the single-cell solution can be challenging especially for tissues or cells surrounded by an extracellular matrix. The protocols used to isolate these cells can by themselves modify the transcriptome and the sequencing data could be the result of these manipulations instead of an endogenous cellular process. In contrast, for bulk RNA-Seq, tissues can be directly lysed in trizol, freezing the transcriptome at the very first step of the extraction. scRNA-Seq identifies fewer transcripts than bulk RNA-Seq and this imperfect coverage can lead to a biased quantification. However, this flaw can be corrected by bioinformatic analysis. Finally, most scRNA-Seq protocols only focus on poly-A RNAs, which excludes all non-coding RNAs.

scRNA-Seq is more expensive and more time-consuming than bulk RNA-Seq but in one experiment, you obtain the transcriptome profile of several populations.


Pulmonary Adenocarcinoma—Pathology and Molecular Testing

Prodipto Pal MD, PhD , . Ming-Sound Tsao MD, FRCPC , in Pulmonary Adenocarcinoma: Approaches to Treatment , 2019

Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction

Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) is feasible in clinical laboratories, however, with its own set of challenges. As noted earlier, ALK rearrangement has many different candidate fusion partners, even for the ALK-EML4, the most common fusion in NSCLC, there are many fusion variants, largely due to different breakpoint regions on EML4, thus would require a multiplexed approach. However, with RT-PCR-based methods, a priori knowledge of the candidate fusion genes is needed to identify fusion variants which can later be confirmed by subsequent sequencing 101 and has been used in studies with high level of sensitivity albeit with varying level of specificity (85%–100%) compared with FISH. 102,103 A negative result by RT-PCR requires appropriate caution due to the potential of false-negative results due to the missing unknown fusion variants. In addition, RT-PCR assays are dependent on procuring high-quality RNA from FFPE tissue. Newer RNA-based assays are under active development (assays such as NanoString system) that can simultaneously detect various fusion partners as well as offer the added advantage of detecting other driver fusion-type alterations in a multiplexed setup (such as ROS1, RET, etc.). 104–106


Conclusion

In summary, we described an alternative method using Real-Time RT-PCR to determine the rate of mRNA degradation by accurately measuring the number of mRNA molecules relative to total RNA. Using this approach, we obtained a values for the β-actin mRNA half-life in Nalm-6 cells that are comparable to those estimated from Northern blot studies using normal human leukocytes [13]. Therefore, Real-Time RT-PCR is a reliable method for measuring mRNA half-life. Because of its sensitivity, half-life of mRNAs expressed at very low level can be determined in cases in which Northern blots may not be sensitive enough. The length of the amplified fragment is important to determine the mRNA half-life because incomplete or degraded mRNA can interfere with the measurement of the actual mRNA half-life. Ideally, full-length cDNA molecules should be amplified to ensure integrity and identity of the mRNA species. The use of the fluorogenic SYBR Green I dye limits the length of the amplified product (cDNA recommended to be less than 200 bp). However, the use of TaqMan ® (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), molecular beacons (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USA), or fluorescence resonance energy transfer (FRET) probes (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, USA) could overcome this limitation and allow amplification of longer PCR products. In addition, since multiplex Real-Time RT-PCR can be achieved in the same reaction tube using different fluorogenic dyes, this method could be modified to simultaneously estimate mRNA half-life of several genes. Thus, our approach represents a rapid and sensitive assay to determine mRNA half-life.


Sars-CoV-2 RNA on surfaces poor indicator of quantity, timing of previous contamination

Novel Coronavirus SARS-CoV-2 Transmission electron micrograph of SARS-CoV-2 virus particles, isolated from a patient. Image captured and color-enhanced at the NIAID Integrated Research Facility (IRF) in Fort Detrick, Maryland. Credit: National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH

A team of UK investigators has shown that RNA copies recovered from surfaces are a poor indicator for determining the numbers of viable SARS-CoV-2 virus particles.

The research, published in Applied and Environmental Microbiology, a publication of the American Society for Microbiology, found that a common UK isolate of SARS-CoV-2 that may have initially contaminated surfaces in the general environment became undetectable within 48 hours. The isolate of SARS-CoV-2 remained viable for more than twice as long on hydrophobic surfaces as on hydrophilic surfaces.

The materials tested in the study were representative of those in personal protective equipment, as well as high hand-touch sites such as stainless steel.

An impediment to determining how long SARS-CoV-2 remains viable on different surfaces has been that in most cases, viable virus that has landed on surfaces is rarely detected, according to corresponding author Thomas Pottage, BSc, Senior Project Leader—Biosafety and Bioresponse, Public Health England, Porton Down, UK. However, many studies have used reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) successfully to detect viral RNA and use this as an indicator of how much of the virus was previously found on the surface.

Therefore, the investigators first sought to determine the relationship between initial quantities of viable virus, and subsequent RNA copy number on a contaminated surface, hoping that the latter could serve as a surrogate for the former. To test this, they contaminated surfaces of interest with artificially high concentrations of the virus in the laboratory. But there was no clear relationship between the numbers of RNA copies recovered over time to the number of viable virus particles in the initial inoculum. The investigators did observe that the numbers of virus particles decreased quite rapidly.

The relationship in levels of RNA and viable SARS-CoV-2 shows that in previous surface sampling studies where SARS-CoV-2 RNA was recovered, there were likely low concentrations of viable virus on those surfaces at the time of contamination, according to Pottage.

"This study estimates that the SARS-CoV-2 would survive less than two days on surfaces under normal environmental concentrations," said Pottage.

Conversely, artificially high concentrations of SARS-CoV-2 that were deliberately deposited on surgical mask material and stainless steel in a laboratory setting resulted in relatively lengthy persistence, with 99.9% reductions in viable virus taking place over 122 and 114 hours, respectively. Viability dropped the fastest on a polyester shirt, with a 99.9% reduction occurring over 2.5 hours.

"Our results show that the porous but hydrophobic surfaces of the surgical mask and Tyvek coverall produce similar decay rates when compared to the non-porous hydrophobic surfaces of stainless steel," with a reduction in numbers of virus particles of 99.999% over seven days, said the authors. Viable SARS-CoV-2 was recovered from these surface materials over longer periods of time compared to the porous, hydrophilic surfaces tested, cotton and woven polyester.


Small RNA Detection by in Situ Hybridization Methods

Small noncoding RNAs perform multiple regulatory functions in cells, and their exogenous mimics are widely used in research and experimental therapies to interfere with target gene expression. MicroRNAs (miRNAs) are the most thoroughly investigated representatives of the small RNA family, which includes short interfering RNAs (siRNAs), PIWI-associated RNA (piRNAs), and others. Numerous methods have been adopted for the detection and characterization of small RNAs, which is challenging due to their short length and low level of expression. These include molecular biology methods such as real-time RT-PCR, northern blotting, hybridization to microarrays, cloning and sequencing, as well as single cell miRNA detection by microscopy with in situ hybridization (ISH). In this review, we focus on the ISH method, including its fluorescent version (FISH), and we present recent methodological advances that facilitated its successful adaptation for small RNA detection. We discuss relevant technical aspects as well as the advantages and limitations of ISH. We also refer to numerous applications of small RNA ISH in basic research and molecular diagnostics.

Mots clés: LNA probe PLA Piwi-interacting RNA TIRCA enzyme-labeled fluorescence signal amplification padlock probes rolling circle amplification short interfering RNA tyramide signal amplification.

Les figures

Types of nucleotide modifications used…

Types of nucleotide modifications used in small RNA ISH probes. ( UNE )…

Sequence amplification and detection methods…

Sequence amplification and detection methods for small RNA ISH include ( UNE )…

Sequence amplification and detection methods…

Sequence amplification and detection methods for small RNA ISH include ( UNE )…


Voir la vidéo: The principle of Real Time PCR, Reverse Transcription, quantitative rt-PCR (Juillet 2022).


Commentaires:

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