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Comment calculer ou connaître expérimentalement l'entropie d'enzymes ou de protéines ?

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Comment calculez-vous ou déterminez-vous expérimentalement l'entropie des enzymes ou des protéines ? En particulier, je m'intéresse à Boltzmann et à l'entropie conformationnelle, et à l'énergie libre de Gibbs. Toutes les références sont les bienvenues.


En pratique, comme les calculs d'énergie, l'entropie est un nombre relatif et difficile à obtenir. La chimie informatique et la bio ont travaillé sur ce problème avec un succès mitigé. Le résumé de ce que je vais dire ici est que lorsque vous essayez de calculer les différences d'entropie (ou d'énergie d'ailleurs), les différences d'énergie libre de Gibbs dans la plupart des processus biologiques tels que la liaison enzyme/substrat, protéine/protéine ou les interactions protéine/ADN ou le repliement des protéines, etc. sont si faibles par rapport aux erreurs dans ces calculs que les calculs sont difficiles à croire.

L'entropie est en fin de compte un terme que l'on utiliserait pour calculer l'énergie libre de Gibb qui dira si un processus chimique ou moléculaire donné se produira. C'est donc un numéro précieux à avoir. L'énergie libre de Gibbs (G) est égale à l'enthalpie (chaleur) moins la température (T) multipliée par le changement d'entropie.

g = H - T$Delta$S

Le terme entropique, $Delta$S est décrit dans les systèmes chimiques souvent comme un changement dans le changement combinatoire du système et le changement de la capacité thermique du système. Le premier d'entre eux pourrait être largement décrit comme un terme de « mélange ». Lorsque plus d'un solvant ou qu'un solvant et un soluté diffusent l'un dans l'autre se mélangent complètement, le nombre d'états possibles est maximisé.

La capacité calorifique du système est le plus souvent au centre des calculs d'entropie pour les protéines et les molécules biologiques. En effet, on pense que les conformations des molécules biologiques, en particulier leur liberté de mouvement, contribuent à la partie entropique de g.

Ainsi, des tentatives ont été faites pour estimer à partir de la RMN et de la cristallographie ainsi que de la dynamique moléculaire combien de domaines et de chaînes latérales sont libres de se déplacer. Malheureusement, ce n'est qu'une approximation insuffisante de l'entropie biologique. Une contribution substantielle sinon dominante à la T$Delta$S terme vient de solvant.

Comment est-ce ainsi ? Les molécules d'eau forment des structures autour des protéines qui ne sont pas statiques, mais impliquent de nombreuses molécules d'eau qui y résident en moyenne pour les voir dans les structures cristallines et les expériences de RMN. Bien que les eaux individuelles s'échangent rapidement, elles ne sont pas dans le même état entropique en solution aqueuse que lorsqu'elles forment une enveloppe d'hydratation autour d'une chaîne latérale aromatique ou chargée.

Des tentatives ont été faites pour paramétrer l'entropie du solvant en examinant la surface non polaire enfouie dans une protéine repliée, en examinant la mobilité des chaînes latérales avant et après le repliement/liaison, mais ces métriques semblent dépendre de la configuration au point qu'elles ne peuvent pas calculer l'entropie des protéines via ces efforts, au moins jusqu'à présent.

Classiquement, la dynamique moléculaire essaie de calculer cela en entourant les protéines ou d'autres molécules avec des molécules d'eau et une certaine approximation de l'entropie globale est calculée sur l'ensemble du système. Il s'avère que les petites différences entre les modèles moléculaires de l'eau et les simplifications dans les modèles d'eau à potentiel ball and stick/Hook que nous réalisons sont également des approximations problématiques lorsqu'il y a des centaines ou des milliers de molécules d'eau dans la simulation.


19.4 : Changements d'entropie dans les réactions chimiques

Nous avons vu que l'énergie dégagée (ou absorbée) par une réaction, et surveillée en notant le changement de température de l'environnement, peut être utilisée pour déterminer l'enthalpie d'une réaction (par exemple en utilisant un calorimètre). Malheureusement, il n'y a pas de moyen facile comparable de mesurer expérimentalement le changement d'entropie pour une réaction. Supposons que nous sachions que l'énergie entre dans un système (ou en sort), et pourtant nous n'observons aucun changement de température. Que se passe-t-il dans une telle situation ? Les changements d'énergie interne, qui ne s'accompagnent pas d'un changement de température, pourraient refléter des changements dans l'entropie du système.

Par exemple, considérons l'eau à °0C à une pression de 1 atm

  • C'est la condition de température et de pression où les phases liquide et solide de l'eau sont en équilibre (également connu sous le nom de point de fusion de la glace)

[ce label] À une telle température et pression, nous avons une situation (par définition) où nous avons de la glace et de l'eau liquide Si une petite quantité d'énergie est introduite dans le système, l'équilibre se déplacera légèrement vers la droite (c'est-à-dire en faveur de l'état liquide) De même, si une petite quantité d'énergie est retirée du système, l'équilibre se déplacera vers la gauche (plus de glace) Cependant, dans les deux situations ci-dessus, le changement d'énergie ne s'accompagne pas d'un changement de température (la température ne changera pas tant que nous n'aurons plus de condition d'équilibre, c'est-à-dire que toute la glace a fondu ou que tout le liquide a gelé) Étant donné que le terme quantitatif qui relie la quantité d'énergie calorifique à l'augmentation de la température est la capacité calorifique, il semblerait que d'une certaine manière, des informations sur la capacité calorifique (et comment elle change avec la température) nous permettraient de déterminer la changement d'entropie dans un système. En fait, les valeurs de "l'entropie molaire standard" d'une substance ont des unités de J/mol K, les mêmes unités que pour la capacité calorifique molaire. Diaporama

Le peroxyde d'hydrogène est un produit toxique de nombreuses réactions chimiques qui se produisent chez les êtres vivants. Bien qu'il soit produit en petites quantités, les êtres vivants doivent détoxifier ce composé et décomposer le peroxyde d'hydrogène en eau et en oxygène, deux molécules non nocives. L'organite responsable de la destruction du peroxyde d'hydrogène est le peroxysome utilisant l'enzyme catalase. Les plantes et les animaux ont des peroxysomes avec catalase. L'échantillon de catalase pour le laboratoire d'aujourd'hui proviendra d'une pomme de terre.


Structure des catalyseurs et des enzymes

UNE catalyseur est toute substance qui peut provoquer des modifications importantes de la vitesse d'une réaction chimique. Ainsi ce pourrait être un élément pur comme le nickel ou le platine, un composé pur comme la silice, le dioxyde de manganèse, des ions dissous comme les ions cuivre ou encore un mélange comme le fer-molybdène. Les catalyseurs les plus couramment utilisés sont les acides protoniques dans la réaction d'hydrolyse. Les réactions d'oxydoréduction sont catalysées par les métaux de transition et le platine est utilisé pour les réactions impliquant l'hydrogène. Certains catalyseurs se présentent comme des précatalyseurs et sont convertis en catalyseurs au cours de la réaction. L'exemple type est celui du catalyseur de Wilkinson’s – RhCl(PPh3)3 qui perd un ligand triphénylphosphine tout en catalysant la réaction.

Enzymes sont des protéines globulaires et peuvent être constituées de 62 acides aminés (4-oxalocrotonate) jusqu'à une taille de 2 500 acides aminés (acide gras synthase). Il existe également des enzymes à base d'ARN appelées ribozymes. Les enzymes sont spécifiques du substrat et sont généralement plus grandes que leurs substrats respectifs. Seule une petite partie d'une enzyme participe à une réaction enzymatique. Le site actif est l'endroit où les substrats se lient à l'enzyme pour faciliter la réaction. D'autres facteurs tels que les cofacteurs, les produits directs, etc. ont également des sites de liaison spécifiques sur l'enzyme. Les enzymes sont constituées de longues chaînes d'acides aminés qui se replient les unes sur les autres donnant naissance à une structure globulaire. La séquence d'acides aminés donne aux enzymes leur spécificité de substrat. La chaleur et les produits chimiques peuvent dénaturer une enzyme.


Protocole

1. Concevoir des amorces

La conception d'amorces appropriées est essentielle au succès d'une expérience PCR. Lors de la conception d'un ensemble d'amorces pour une région spécifique d'ADN souhaitée pour l'amplification, une amorce doit s'hybrider au brin plus, qui par convention est orienté dans la direction 5' → 3' (également connu sous le nom de brin sens ou non-modèle) et l'autre amorce doit compléter le brin moins, qui est orienté dans la direction 3' → 5' (brin antisens ou matrice). Il existe quelques problèmes courants qui surviennent lors de la conception des amorces : 1) auto-annelage des amorces entraînant la formation de structures secondaires telles que des boucles en épingle à cheveux (Figure 1a) 2) l'hybridation des amorces entre elles, plutôt qu'avec la matrice d'ADN, créant des dimères d'amorces (Figure 1b) 3) températures de fusion radicalement différentes (Tm) pour chaque amorce, ce qui rend difficile la sélection d'une température d'hybridation qui permettra aux deux amorces de se lier efficacement à leur séquence cible pendant le cycle thermique (Figure 1c) (Voir les sections CALCUL DE LA TEMPÉRATURE DE FUSION (Tm) et MODIFICATIONS DES CONDITIONS DE CYCLISME pour plus d'informations sur Tms).

Vous trouverez ci-dessous une liste de caractéristiques à prendre en compte lors de la conception des amorces.

La longueur de l'amorce doit être de 15 à 30 résidus nucléotidiques (bases).

La teneur optimale en G-C doit se situer entre 40 et 60 %.

L'extrémité 3' des amorces doit contenir un G ou un C afin de serrer l'amorce et d'empêcher la « respiration » des extrémités, augmentant ainsi l'efficacité de l'amorçage. La "respiration" de l'ADN se produit lorsque les extrémités ne restent pas recuites mais s'effilochent ou se séparent. Les trois liaisons hydrogène dans les paires GC aident à empêcher la respiration mais augmentent également la température de fusion des amorces.

Les extrémités 3' d'un jeu d'amorces, qui comprend une amorce brin plus et une amorce brin moins, ne doivent pas être complémentaires l'une de l'autre, et l'extrémité 3' d'une seule amorce ne peut pas non plus être complémentaire d'autres séquences dans l'amorce. Ces deux scénarios entraînent respectivement la formation de dimères d'amorces et de structures en boucle en épingle à cheveux.

Températures de fusion optimales (Tm) pour les amorces comprises entre 52-58 ଌ, bien que la plage puisse être étendue à 45-65 ଌ. Le T finalm pour les deux amorces ne doit pas différer de plus de 5 ଌ.

Les répétitions dinucléotidiques (par exemple, GCGCGCGCGC ou ATATATATAT) ou les analyses à base unique (par exemple, AAAAA ou CCCCC) doivent être évitées car elles peuvent provoquer un glissement le long du segment amorcé de l'ADN et/ou des structures en boucle en épingle à cheveux. Si cela est inévitable en raison de la nature de la matrice d'ADN, n'incluez que des répétitions ou des analyses de base unique avec un maximum de 4 bases.

Remarques:

Il existe de nombreux programmes informatiques conçus pour aider à la conception de paires d'amorces. L'outil de conception NCBI Primer http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ et Primer3 http://frodo.wi.mit.edu/primer3/ sont des sites Web recommandés à cet effet.

Afin d'éviter l'amplification de pseudogènes ou d'homologues apparentés, il pourrait être utile d'effectuer un blast sur NCBI pour vérifier la spécificité cible des amorces.

2. Matériaux et réactifs

Lors de la mise en place d'une expérience PCR, il est important d'être préparé. Porter des gants pour éviter de contaminer le mélange réactionnel ou les réactifs. Inclure un contrôle négatif, et si possible un contrôle positif.

Disposez tous les réactifs nécessaires à l'expérience PCR dans un seau à glace fraîchement rempli et laissez-les décongeler complètement avant de mettre en place une réaction (Figure 2). Gardez les réactifs sur la glace tout au long de l'expérience.

Les réactifs PCR standard comprennent un ensemble d'amorces appropriées pour le gène cible ou le segment d'ADN souhaité à amplifier, l'ADN polymérase, un tampon pour l'ADN polymérase spécifique, des désoxynucléotides (dNTP), une matrice d'ADN et de l'eau stérile.

Les réactifs supplémentaires peuvent inclure le sel de magnésium Mg 2+ (à une concentration finale de 0,5 à 5,0 mM), le sel de potassium K + (à une concentration finale de 35 à 100 mM), le diméthylsulfoxyde (DMSO à une concentration finale de 1 à 10 %) , formamide (à une concentration finale de 1,25-10%), albumine de sérum bovin (à une concentration finale de 10-100 μg/ml) et bétaïne (à une concentration finale de 0,5 M à 2,5 M). Les additifs sont discutés plus en détail dans la section de dépannage.

Organiser l'équipement de laboratoire sur l'établi.

Le matériel comprend des tubes et bouchons PCR, un support de tubes PCR, un marqueur résistant à l'éthanol et un ensemble de micropipettes qui distribuent entre 1 - 10 μl (P10), 2 - 20 μl (P20), 20 - 200 & #x003bcl (P200) et 200 - 1000 μl (P1000), ainsi qu'un thermocycleur.

Lors de la mise en place de plusieurs expériences PCR qui utilisent toutes les mêmes réactifs, elles peuvent être mises à l'échelle de manière appropriée et combinées dans un mélange maître (Master Mix). Cette étape peut être effectuée dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,8 ml (voir Notes).

Pour analyser les amplicons résultant d'une expérience PCR, des réactifs et du matériel pour l'électrophorèse sur gel d'agarose sont nécessaires. Pour approximer la taille d'un produit de PCR, une norme de taille de poids moléculaire appropriée et disponible dans le commerce est nécessaire.

3. Mise en place d'un mélange réactionnel

Commencez par faire un tableau des réactifs qui seront ajoutés au mélange réactionnel (voir Tableau 1).

Ensuite, étiquetez les tubes PCR avec le marqueur résistant à l'éthanol.

Les volumes de réaction varieront en fonction des concentrations des réactifs de base. Les concentrations finales (CF) pour une réaction typique de 50 μl sont les suivantes.

Tampon X (généralement fourni par le fabricant de l'ADN polymérase peut contenir 15 mM de MgCl2). Ajouter 5 μl de tampon 10X par réaction.

200 μM dNTP (50 μM de chacun des quatre nucléotides). Ajouter 1 μl de 10 mM de dNTP par réaction (dATP, dCTP, dTTP et dGTP sont à 2,5 mM chacun).

1,5 mM de Mg2+. Ajoutez uniquement s'il n'est pas présent dans le tampon 10X ou si nécessaire pour l'optimisation PCR. Par exemple, pour obtenir les 4,0 mM de Mg 2+ nécessaires à la production optimale d'amplicons d'un segment d'ADN conservé de 566 pb trouvé dans un mycobactériophage non caractérisé, ajoutez 8 μl de 25 mM de MgCl2 à la réaction (figure 3).

20 à 50 pmol de chaque amorce. Ajouter 1 μl de chaque apprêt 20 μM.

Ajouter 10 4 à 10 7 molécules (ou environ 1 à 1000 ng) matrice d'ADN. Ajouter 0,5 μl d'ADN de mycobactériophage génomique 2ng/μl.

Ajouter 0,5 à 2,5 unités d'ADN polymérase par réaction de 50 μl (Voir les recommandations des fabricants) Par exemple, ajouter 0,5 μl de Sigma 0,5 Unités/μl Taq ADN polymérase.

Ajouter Q.S. de l'eau distillée stérile pour obtenir un volume final de 50 μl par réaction comme prédéterminé dans le tableau des réactifs (Q.S. est une abréviation latine pour quantum satis signifiant la quantité nécessaire). Ainsi, 33 μl par réaction sont nécessaires pour porter le volume à 50 μl. Cependant, il est à noter que l'eau est ajoutée en premier mais nécessite dans un premier temps de faire un tableau des réactifs et de déterminer les volumes de tous les autres réactifs ajoutés à la réaction.

4. Protocole PCR de base

Placer une plaque à 96 puits dans le seau à glace comme support pour les tubes PCR à paroi mince de 0,2 ml. Permettre aux réactifs PCR d'être ajoutés dans des tubes PCR froids à paroi mince de 0,2 ml aidera à prévenir l'activité de la nucléase et l'amorçage non spécifique.

Pipeter les réactifs PCR suivants dans l'ordre suivant dans un tube PCR à paroi mince de 0,2 ml (Figure 4) : Eau stérile, tampon PCR 10X, dNTP, MgCl2, amorces et matrice d'ADN (voir Tableau 1). Étant donné que les expériences doivent avoir au moins un contrôle négatif et éventuellement un contrôle positif, il est avantageux de mettre en place un Master Mix dans un tube de microcentrifugeuse de 1,8 ml (voir l'explication dans les notes).

Dans des tubes PCR à paroi mince de 0,2 ml séparés (Figure 4) ajouter tous les réactifs à l'exception de l'ADN matrice pour un contrôle négatif (augmenter l'eau pour compenser le volume manquant). De plus, une autre réaction (si des réactifs sont disponibles) doit contenir un contrôle positif utilisant de l'ADN matrice et/ou des amorces connues pour s'amplifier dans les mêmes conditions que les tubes PCR expérimentaux.

Taq L'ADN polymérase est généralement stockée dans une solution de glycérol à 50 % et pour une dispersion complète dans le mélange réactionnel, il faut un mélange doux des réactifs PCR par pipetage vers le haut et vers le bas au moins 20 fois. La micropipette doit être réglée à environ la moitié du volume de réaction du mélange maître lors du mélange, et des précautions doivent être prises pour éviter d'introduire des bulles.

Mettez des bouchons sur les tubes PCR à paroi mince de 0,2 ml et placez-les dans le thermocycleur (Figure 5). Une fois le couvercle du thermocycleur bien fermé, démarrez le programme (voir Tableau 2).

Lorsque le programme est terminé, les tubes PCR à paroi mince de 0,2 ml peuvent être retirés et stockés à 4 ଌ. Les produits de PCR peuvent être détectés en chargeant des aliquotes de chaque réaction dans des puits d'un gel d'agarose, puis en colorant l'ADN qui a migré dans le gel après électrophorèse avec du bromure d'éthidium. Si un produit PCR est présent, le bromure d'éthidium s'intercalera entre les bases des brins d'ADN, permettant de visualiser les bandes avec un illuminateur UV.

Remarques:

Lors de la mise en place de plusieurs expériences de PCR, il est avantageux d'assembler un mélange de réactifs commun à toutes les réactions (c'est-à-dire Master Mix). Habituellement, le cocktail contient une solution d'ADN polymérase, de dNTP, de tampon de réaction et d'eau assemblés dans un tube de microcentrifugation de 1,8 ml. La quantité de chaque réactif ajouté au Master Mix est équivalente au nombre total de réactions plus 10 % arrondi à la réaction entière la plus proche. Par exemple, s'il y a 10 x 0,1 = 1 réaction, alors (10 + 1) x 5 μl 10X buffer équivaut à 55 μl de 10X buffer pour le Master Mix. Les réactifs du Master Mix sont soigneusement mélangés en pompant doucement le piston d'une micropipette de haut en bas environ 20 fois comme décrit ci-dessus. Chaque tube PCR reçoit une aliquote du Master Mix auquel la matrice d'ADN, les amorces requises et les réactifs spécifiques à l'expérience sont ensuite ajoutés (voir Tableaux 1 et 7).

Le site Web suivant propose une calculatrice pour déterminer le nombre de copies d'une matrice d'ADN (http://www.uri.edu/research/gsc/resources/cndna.html). Le nombre total de copies d'ADN double brin peut être calculé à l'aide de l'équation suivante : Nombre de copies d'ADN = (quantité d'ADN (ng) x 6,022x10 23 ) / (longueur d'ADN x 1x10 9 ng/ml x 650 Daltons) Le calcul du nombre de copies d'ADN est utilisé pour déterminer la quantité de matrice nécessaire par réaction.

Des faux positifs peuvent survenir à la suite d'un transfert d'une autre réaction PCR qui serait visualisé comme de multiples produits indésirables sur un gel d'agarose après électrophorèse. Par conséquent, il est prudent d'utiliser une technique appropriée, d'inclure un contrôle négatif (et un contrôle positif lorsque cela est possible).

Bien que le bromure d'éthidium soit la tache la plus courante pour les acides nucléiques, il existe plusieurs alternatives plus sûres et moins toxiques. Le site Web suivant décrit plusieurs des alternatives, notamment le bleu de méthylène, le violet cristal, le SYBR Safe et le rouge gel, ainsi que des descriptions de la façon d'utiliser et de détecter le produit final (http://bitesizebio.com/articles/ethidium-bromide-the- alternatives/).

Alors que la plupart des machines PCR modernes utilisent des tubes de 0,2 ml, certains modèles peuvent nécessiter des réactions dans des tubes de 0,5 ml.Consultez le manuel de votre thermocycleur pour déterminer la taille de tube appropriée.

5. Calcul de la température de fusion (Tm)

Connaissant la température de fusion (Tm) des amorces est impératif pour une expérience PCR réussie. Bien qu'il existe plusieurs Tm calculatrices disponibles, il est important de noter que ces calculs sont une estimation du T réelm en raison du manque d'informations spécifiques sur une réaction particulière et des hypothèses formulées dans les algorithmes pour le Tm calculatrices elles-mêmes. Cependant, les modèles thermodynamiques du plus proche voisin sont préférés au calcul plus conventionnel : Tm ≈ 4(G-C) + 2(A-T). Le premier donnera T plus précism estimation car elle prend en compte l'énergie d'empilement des paires de bases voisines. Ce dernier est utilisé plus fréquemment car les calculs sont simples et peuvent être effectués rapidement à la main. Voir la section Dépannage pour plus d'informations sur la manière dont les diverses conditions de PCR et les additifs affectent la température de fusion. Pour calculer le Tm valeurs par les modèles thermodynamiques du plus proche voisin, l'un des calculateurs suivants est recommandé : http://www6.appliedbiosystems.com/support/techtools/calc/ http://www.cnr.berkeley.edu/

6. Configuration des conditions de cyclage thermique

Les thermocycleurs PCR chauffent et refroidissent rapidement le mélange réactionnel, permettant la dénaturation induite par la chaleur de l'ADN duplex (séparation des brins), l'annelage des amorces aux brins plus et moins de la matrice d'ADN et l'allongement du produit PCR. Les temps de cycle sont calculés en fonction de la taille de la matrice et de la teneur en GC de l'ADN. La formule générale commence par une étape de dénaturation initiale à 94 ଌ à 98 ଌ en fonction de la température optimale pour l'activité de l'ADN polymérase et la teneur en G-C de l'ADN matrice. Une réaction typique commencera par une dénaturation d'une minute à 94 ଌ. Une durée supérieure à 3 minutes peut inactiver l'ADN polymérase, détruisant son activité enzymatique. Une méthode, connue sous le nom de PCR à démarrage à chaud, prolonge considérablement le temps de dénaturation initial de 3 minutes à 9 minutes. Avec la PCR à démarrage à chaud, l'ADN polymérase est ajoutée une fois l'étape initiale de dénaturation exagérée terminée. Cette modification du protocole évite une inactivation probable de l'enzyme ADN polymérase. Reportez-vous à la section Dépannage de ce protocole pour plus d'informations sur la PCR de démarrage à chaud et d'autres méthodes alternatives.

L'étape suivante consiste à régler le thermocycleur pour qu'il initie le premier des 25 à 35 cycles d'un cycle de température en trois étapes (Tableau 2). Alors qu'augmenter le nombre de cycles au-dessus de 35 entraînera une plus grande quantité de produits PCR, trop de cycles entraînent souvent l'enrichissement de produits secondaires indésirables. Les trois étapes de température dans un seul cycle accomplissent trois tâches : la première étape dénature la matrice (et dans les cycles ultérieurs, les amplicons également), la deuxième étape permet un annelage optimal des amorces, et la troisième étape permet à l'ADN polymérase de se lier à la matrice d'ADN et synthétiser le produit PCR. La durée et la température de chaque étape d'un cycle peuvent être modifiées pour optimiser la production de l'amplicon souhaité. La durée de l'étape de dénaturation est maintenue aussi courte que possible. Habituellement, 10 à 60 secondes suffisent pour la plupart des matrices d'ADN. Le temps et la température de dénaturation peuvent varier en fonction de la teneur en G-C de l'ADN matrice, ainsi que du taux de rampe, qui est le temps nécessaire au thermocycleur pour passer d'une température à l'autre. La température pour cette étape est généralement la même que celle utilisée pour la phase de dénaturation initiale (étape 1 ci-dessus, par exemple, 94 ଌ). Une étape de recuit de 30 secondes suit dans le cycle à une température réglée à environ 5 ଌ en dessous du T apparentm des amorces (idéalement entre 52 ଌ à 58 ଌ). Le cycle se termine par une étape d'allongement. La température dépend de l'ADN polymérase choisie pour l'expérience. Par exemple, Taq L'ADN polymérase a une température d'élongation optimale de 70 ଌ à 80 ଌ et nécessite 1 minute pour allonger les 2 premiers kb, puis nécessite une minute supplémentaire pour chaque 1 kb supplémentaire amplifié. L'ADN polymérase Pfu est une autre enzyme thermostable qui a une température d'élongation optimale de 75 ଌ. L'ADN polymérase Pfu est recommandée pour une utilisation dans les réactions de PCR et d'extension d'amorce qui nécessitent une haute fidélité et nécessitent 2 minutes pour chaque 1 kb à amplifier. Voir les recommandations du fabricant pour les températures d'élongation exactes et le temps d'élongation indiqués pour chaque ADN polymérase spécifique.

La phase finale du cycle thermique comprend une période d'allongement prolongée de 5 minutes ou plus. Cette dernière étape permet de terminer la synthèse de nombreux amplicons inachevés et, dans le cas de Taq L'ADN polymérase permet l'ajout d'un résidu adénine aux extrémités 3' de tous les produits PCR. Cette modification est médiée par l'activité transférase terminale de Taq ADN polymérase et est utile pour les procédures de clonage moléculaire ultérieures qui nécessitent un débord 3'.

La fin de la réaction est obtenue en refroidissant le mélange à 4 ଌ et/ou par l'ajout d'EDTA à une concentration finale de 10 mM.

7. Considérations importantes lors du dépannage de la PCR

Si les conditions PCR standard ne donnent pas l'amplicon souhaité, une optimisation PCR est nécessaire pour obtenir de meilleurs résultats. La rigueur d'une réaction peut être modulée de telle sorte que la spécificité est ajustée en modifiant les variables (par exemple, les concentrations de réactif, les conditions de cycle) qui affectent le résultat du profil d'amplicon. Par exemple, si la réaction n'est pas assez rigoureuse, de nombreux amplicons parasites seront générés avec des longueurs variables. Si la réaction est trop stricte, aucun produit ne sera produit. Le dépannage des réactions PCR peut parfois être une entreprise frustrante. Cependant, une analyse minutieuse et une bonne compréhension des réactifs utilisés dans une expérience PCR peuvent réduire le temps et les essais nécessaires pour obtenir les résultats souhaités. De toutes les considérations qui ont un impact sur la stringence de la PCR, le titrage du Mg 2+ et/ou la manipulation des températures de recuit résoudront probablement la plupart des problèmes. Cependant, avant de changer quoi que ce soit, assurez-vous qu'un résultat erroné n'est pas dû à une erreur humaine. Commencez par confirmer que tous les réactifs ont été ajoutés à une réaction donnée et que les réactifs n'étaient pas contaminés. Notez également le résultat erroné et posez les questions suivantes : Les dimères d'amorces sont-ils visibles sur le gel après électrophorèse (ceux-ci se présentent sous forme de petites bandes 𼄀 b près du bas de la piste) ? Existe-t-il des produits non spécifiques (bandes qui migrent à une taille différente de celle du produit souhaité) ? Y avait-il un manque de produit ? L'ADN cible est-il sur un plasmide ou dans un extrait d'ADN génomique ? En outre, il est sage d'analyser la teneur en G-C de l'amplicon souhaité.

Déterminez d'abord si l'un des réactifs PCR est catastrophique pour votre réaction. Cela peut être réalisé en préparant de nouveaux réactifs (par exemple, des stocks de travail frais, de nouvelles dilutions), puis en ajoutant systématiquement un nouveau réactif à la fois aux mélanges réactionnels. Ce processus déterminera quel réactif était le coupable de l'échec de l'expérience PCR. Dans le cas d'ADN très ancien, qui accumule souvent des inhibiteurs, il a été démontré que l'ajout d'albumine de sérum bovin peut aider à atténuer le problème.

Des dimères d'amorces peuvent se former lorsque les amorces s'auto-hybrident de préférence ou s'hybrident à l'autre amorce dans la réaction. Si cela se produit, un petit produit de moins de 100 pb apparaîtra sur le gel d'agarose. Commencez par modifier le rapport de la matrice à l'amorce si la concentration d'amorce est en excès extrême par rapport à la concentration de matrice, alors les amorces seront plus susceptibles de s'hybrider entre elles ou entre elles sur la matrice d'ADN. L'ajout de DMSO et/ou l'utilisation d'une méthode de cycle thermique de démarrage à chaud peuvent résoudre le problème. En fin de compte, il peut être nécessaire de concevoir de nouvelles amorces.

Des produits non spécifiques sont produits lorsque la stringence PCR est excessivement faible, ce qui entraîne des bandes PCR non spécifiques avec des longueurs variables. Cela produit un effet d'échelle sur un gel d'agarose. Il est alors conseillé de choisir des conditions de PCR qui augmentent la stringence. Un frottis de différentes tailles peut également résulter d'amorces conçues pour des séquences hautement répétitives lors de l'amplification de l'ADN génomique. Cependant, les mêmes amorces peuvent amplifier une séquence cible sur un plasmide sans rencontrer le même problème.

Le manque de produits PCR est probablement dû à des conditions de réaction trop strictes. Les dimères d'amorces et les structures en boucle en épingle à cheveux qui se forment avec les amorces ou dans l'ADN matrice dénaturé peuvent également empêcher l'amplification des produits de PCR car ces molécules peuvent ne plus s'apparier avec la contrepartie d'ADN souhaitée.

Si la teneur en G-C n'a pas été analysée, il est temps de le faire. La PCR des régions riches en G-C (contenu en GC 㹠%) pose certains des plus grands défis de la PCR. Cependant, il existe de nombreux additifs qui ont été utilisés pour aider à atténuer les problèmes.

8. Manipulation des réactifs PCR

Comprendre la fonction des réactifs utilisés sur la PCR conventionnelle est essentiel pour décider d'abord de la meilleure façon de modifier les conditions de réaction pour obtenir le produit souhaité. Le succès peut simplement dépendre de la modification de la concentration de MgCl2, KCl, dNTP, amorces, ADN matrice ou ADN polymérase. Cependant, la mauvaise concentration de ces réactifs peut conduire à des résultats erronés, diminuant la rigueur de la réaction. Lors du dépannage de la PCR, un seul réactif doit être manipulé à la fois. Cependant, il peut être prudent de titrer le réactif manipulé.

Sel de magnésium Mg 2+ (concentration réactionnelle finale de 0,5 à 5,0 mM) Les ADN polymérases thermostables nécessitent la présence de magnésium pour agir comme cofacteur pendant le processus de réaction. La modification de la concentration en magnésium est l'un des réactifs les plus faciles à manipuler avec peut-être le plus grand impact sur la rigueur de la PCR. En général, le rendement du produit PCR augmentera avec l'ajout de plus grandes concentrations de Mg 2+ . Cependant, des concentrations accrues de Mg 2+ diminueront également la spécificité et la fidélité de l'ADN polymérase. La plupart des fabricants incluent une solution de chlorure de magnésium (MgCl2) avec l'ADN polymérase et une solution tampon PCR 10X. Les solutions tampons 10 X PCR peuvent contenir 15 mM de MgCl2, ce qui est suffisant pour une réaction PCR typique, ou il peut être ajouté séparément à une concentration optimisée pour une réaction particulière. Mg 2+ n'est pas réellement consommé dans la réaction, mais la réaction ne peut pas se dérouler sans qu'il soit présent. Lorsqu'il y a trop de Mg 2+ , cela peut empêcher la dénaturation complète de la matrice d'ADN en stabilisant le brin duplex. Trop de Mg 2+ peut également stabiliser l'hybridation parasite des amorces à des sites de matrice incorrects et diminuer la spécificité résultant en des produits PCR indésirables. Lorsqu'il n'y a pas assez de Mg 2+ , la réaction ne se poursuit pas, ce qui entraîne l'absence de produit de PCR.

Sel de potassium K + (concentration réactionnelle finale de 35 à 100 mM) Les produits de PCR plus longs (10 à 40 kb) bénéficient de la réduction du sel de potassium (KCl) par rapport à sa concentration réactionnelle normale de 50 mM, souvent en conjonction avec l'ajout de DMSO et/ou glycérol. Si l'amplicon souhaité est inférieur à 1000 pb et que de longs produits non spécifiques se forment, la spécificité peut être améliorée en titrant le KCl, en augmentant la concentration par incréments de 10 mM jusqu'à 100 mM. L'augmentation de la concentration en sel permet aux molécules d'ADN plus courtes de se dénaturer préférentiellement en molécules d'ADN plus longues.

Désoxynucléotide 5'-triphosphates (concentration de réaction finale de 20 et 200 μM chacun) Les désoxynucléotide 5'-triphosphates (dNTP) peuvent poser des problèmes pour la PCR s'ils ne sont pas aux concentrations équivalentes appropriées (c'est-à-dire, [A] = [T] = [C] = [G]) et/ou en raison de leur instabilité due aux congélations et décongélations répétées. La concentration habituelle de dNTP est de 50 μM de CHACUN des quatre dNTP. Cependant, la PCR peut tolérer des concentrations comprises entre 20 et 200 μM chacune. Des concentrations plus faibles de dNTP peuvent augmenter à la fois la spécificité et la fidélité de la réaction, tandis que des concentrations excessives de dNTP peuvent en fait inhiber la PCR. Cependant, pour des fragments de PCR plus longs, une concentration de dNTP plus élevée peut être requise. Un grand changement dans la concentration de dNTP peut nécessiter un changement correspondant dans la concentration de Mg 2+.

Les ADN polymérases thermiquement stables Les enzymes PCR et les tampons associés à ces enzymes ont parcouru un long chemin depuis le premier Taq L'ADN polymérase a été utilisée pour la première fois. Ainsi, le choix d'une enzyme appropriée peut être utile pour obtenir les produits d'amplicons souhaités. Par exemple l'utilisation de Taq L'ADN polymérase peut être préférée à l'ADN polymérase Pfu si la processivité et/ou l'addition d'un résidu adénine aux extrémités 3' du produit PCR est souhaitée. L'ajout d'une adénine 3' est devenu une stratégie utile pour cloner des produits de PCR dans des vecteurs TA avec des surplombs de thymine 3'. Cependant, si la fidélité est plus importante, une enzyme telle que la Pfu peut être un meilleur choix. Plusieurs fabricants ont une gamme d'ADN polymérases spécifiques conçues pour des besoins spécialisés. Jetez un œil aux conditions de réaction et aux caractéristiques de l'amplicon souhaité, puis faites correspondre l'expérience PCR avec l'ADN polymérase appropriée. La plupart des fabricants ont des tableaux qui facilitent la sélection de l'ADN polymérase en répertoriant des caractéristiques telles que la fidélité, le rendement, la vitesse, les longueurs cibles optimales et si elle est utile pour l'amplification riche en G-C ou la PCR à démarrage à chaud.

ADN modèle La qualité et la pureté de l'ADN auront un effet substantiel sur la probabilité d'une expérience PCR réussie. Les concentrations d'ADN et d'ARN peuvent être déterminées à l'aide de leurs mesures de densité optique à 260 nm (DO260). La masse d'acides nucléiques purifiés en solution est calculée à 50 μg/ml d'ADN double brin ou 40 μg/ml pour l'ARN ou l'ADN simple brin à une DO260 =1.0. Les contaminants d'extraction d'ADN sont des inhibiteurs courants dans la PCR et doivent être soigneusement évités. Les inhibiteurs courants d'extraction d'ADN de la PCR comprennent les protéines, l'ARN, les solvants organiques et les détergents. Utilisation de l'absorption maximale des acides nucléiques OD260 par rapport à celle des protéines DO280 (DO260/280), il est possible de déterminer une estimation de la pureté de l'ADN extrait. Idéalement, le rapport de DO260/280 est compris entre 1,8 et 2,0. OD inférieur260/280 indique une contamination par des protéines et/ou des solvants qui, selon toute probabilité, sera problématique pour la PCR. En plus de la qualité de l'ADN matrice, l'optimisation de la quantité d'ADN peut grandement bénéficier au résultat d'une expérience PCR. Bien qu'il soit pratique de déterminer la quantité en ng/μl, qui est souvent la sortie des nanospectrophotomètres modernes, l'unité pertinente pour une expérience PCR réussie est le nombre de molécules. C'est-à-dire, combien de copies de matrice d'ADN contiennent une séquence complémentaire aux amorces de PCR ? Les molécules cibles optimales sont comprises entre 104 et 107 molécules et peuvent être calculées comme cela a été décrit dans les notes ci-dessus.

9. Réactifs additifs

Les réactifs additifs peuvent donner des résultats lorsque tout le reste échoue. Comprendre les réactifs et à quoi ils servent est essentiel pour déterminer quels réactifs peuvent être les plus efficaces dans l'acquisition du produit PCR souhaité. L'ajout de réactifs à la réaction est compliqué par le fait que la manipulation d'un réactif peut avoir un impact sur la concentration utilisable d'un autre réactif. En plus des réactifs énumérés ci-dessous, des additifs exclusifs disponibles dans le commerce sont disponibles auprès de nombreuses sociétés de biotechnologie.

10. Additifs qui profitent aux modèles riches en G-C

Diméthylsulfoxyde (concentration réactionnelle finale de 1 à 10 % de DMSO) Dans les expériences de PCR dans lesquelles l'ADN matrice est particulièrement riche en G-C (teneur en GC 㹠%), l'ajout de DMSO peut améliorer la réaction en perturbant l'appariement des bases et en abaissant efficacement le Tm. Certains Tm les calculatrices incluent une entrée variable pour ajouter la concentration de DMSO souhaitée dans l'expérience PCR. Cependant, l'ajout de plus de 2% de DMSO peut nécessiter l'ajout de plus d'ADN polymérase car il a été démontré qu'il inhibe Taq ADN polymérase.

Formamide (concentration réactionnelle finale de 1,25-10%) Comme le DMSO, le formamide perturbe également l'appariement des bases tout en augmentant la stringence de l'hybridation des amorces, ce qui entraîne moins d'amorçage non spécifique et une efficacité d'amplification accrue. Le formamide s'est également avéré être un amplificateur pour les modèles riches en G-C.

7-déaza-2'-désoxyguanosine 5'-triphosphate (concentration réactionnelle finale de dc 7 GTP 3 dc 7 GTP:1 dGTP 50 μM) Utilisation de 3 parties, ou 37,5 μM, de l'analogue de guanosine base dc 7 GTP en conjonction avec 1 partie, ou 12,5 μM, le dGTP déstabilisera la formation de structures secondaires dans le produit. Lorsque l'amplicon ou l'ADN matrice est dénaturé, il formera souvent des structures secondaires telles que des boucles en épingle à cheveux. L'incorporation de dc 7 GTP dans l'amplicon d'ADN interdira la formation de ces structures aberrantes.

dc 7 GTP atténue le signal de coloration au bromure d'éthidium, c'est pourquoi il est utilisé dans un rapport 3:1 avec dGTP.

Bétaïne (concentration réactionnelle finale de 0,5 M à 2,5 M) La bétaïne (N,N,N-triméthylglycine) est un analogue d'acide aminé zwitterionique qui réduit et peut même éliminer la dépendance de la température de fusion de l'ADN à la composition nucléotidique. Il est utilisé comme additif pour faciliter l'amplification par PCR de cibles riches en G-C. La bétaïne est souvent utilisée en combinaison avec le DMSO et peut grandement augmenter les chances d'amplifier l'ADN cible avec une teneur élevée en G-C.

11. Additifs qui aident la PCR en présence d'inhibiteurs

Les détergents non ioniques ont pour fonction de supprimer la formation de structure secondaire et d'aider à stabiliser l'ADN polymérase. Des détergents non ioniques tels que Triton X-100, Tween 20 ou NP-40 peuvent être utilisés à des concentrations réactionnelles de 0,1 à 1 % afin d'augmenter la production d'amplicons. Cependant, des concentrations supérieures à 1% peuvent être inhibitrices de la PCR. La présence de détergents non ioniques diminue la stringence de la PCR, conduisant potentiellement à la formation de produits parasites. Cependant, leur utilisation neutralisera également les effets inhibiteurs du SDS, un contaminant occasionnel des protocoles d'extraction d'ADN.

L'ajout de protéines spécifiques telles que l'albumine sérique bovine (BSA) utilisée à 400 ng/μl et/ou la protéine T4 gène 32 à 150 ng/μl facilitent la PCR en présence d'inhibiteurs tels que FeCl3, hémine, acide fulvique, acide humique, acides tanniques ou extraits de matières fécales, d'eau douce et d'eau de mer. Cependant, certains inhibiteurs de PCR, y compris les sels biliaires, la bilirubine, l'EDTA, le NaCl, le SDS ou le Triton X-100, ne sont pas atténués par l'ajout de la protéine BSA ou du gène T4 32.

12. Modifications des conditions de cyclisme

L'optimisation de la température de recuit améliorera toute réaction de PCR et doit être envisagée en combinaison avec d'autres additifs et/ou avec d'autres modifications des conditions de cyclage. Ainsi, afin de calculer la température de recuit optimale, l'équation suivante est utilisée : Tune OPT = 0,3 Tm Apprêt + 0,7 Tm Produit -14,9 Tm L'amorce est calculée comme le Tm de la paire la moins stable en utilisant l'équation : Tm Amorce = ((ΔH/(ΔS+R x ln(c/4)))-273,15 + 16,6 log[K + ] Où ΔH est la somme des changements d'enthalpie du voisin le plus proche pour les hybrides ΔS est la somme des changements d'entropie du voisin le plus proche R est la constante de gaz (1,99 cal K-1 mol-1) C est la concentration d'amorce et [K + ] est la concentration en potassium. Cette dernière équation peut être calculée en utilisant l'un des Tm calculatrices répertoriées sur le site Web suivant : http://protein.bio.puc.cl/cardex/servers/melting/sup_mat/servers_list.html Tm Le produit est calculé comme suit : Tm Produit = 0,41(%G-C) + 16,6 log [K + ] - 675/longueur du produit Pour la plupart des réactions PCR, la concentration de potassium ([K + ]) sera de 50 mM.

La PCR à démarrage à chaud est une modification polyvalente dans laquelle le temps de dénaturation initial est considérablement augmenté (Tableau 4). Cette modification peut être incorporée avec ou sans autres modifications des conditions de cyclage. De plus, il est souvent utilisé en conjonction avec des additifs pour la formation d'amplicons capricieux. En fait, la PCR de démarrage à chaud est de plus en plus incluse comme un aspect régulier des conditions générales de cyclisme. Il a été démontré que le démarrage à chaud augmente le rendement en amplicon, tout en augmentant la spécificité et la fidélité de la réaction. La justification de la PCR à démarrage à chaud est d'éliminer l'amorce-dimère et l'amorçage non spécifique qui peuvent résulter de la mise en place de la réaction en dessous de la Tm. Ainsi, une réaction de démarrage à chaud typique chauffe l'échantillon à une température supérieure à la T optimalem, au moins à 60 ଌ avant qu'une amplification ne puisse se produire. En général, l'ADN polymérase est retirée de la réaction pendant le temps de dénaturation initial allongé. Bien que d'autres composants de la réaction soient parfois omis à la place de l'ADN polymérase, nous nous concentrerons ici sur l'ADN polymérase. Il existe plusieurs méthodes qui permettent à l'ADN polymérase de rester inactive ou physiquement séparée jusqu'à la fin de la période de dénaturation initiale, notamment l'utilisation d'une barrière de cire solide, d'anticorps anti-ADN polymérase et de protéines accessoires. En variante, l'ADN polymérase peut être simplement ajoutée à la réaction une fois le cycle de dénaturation initial terminé.

Touchdown PCR (TD-PCR) est destiné à prendre une partie de la conjecture de la Tm limites de calcul en mettant entre parenthèses les températures de recuit calculées. Le concept est de concevoir deux phases de conditions cyclables (Tableau 5). La première phase utilise des températures de recuit successivement plus basses tous les deux cycles (traditionnellement 1,0 ଌ), en commençant à 10 ଌ ci-dessus et en se terminant au T calculém ou légèrement en dessous. La phase deux utilise les conditions standard en 3 étapes avec la température de recuit réglée à 5 ଌ en dessous du T calculém pendant 20 à 25 cycles supplémentaires. La fonction de la première phase devrait atténuer les erreurs d'amorçage, conférant un avantage quadruple au bon produit. Ainsi, après 10 cycles, un avantage de 410 fois donnerait 4096 copies du produit correct par rapport à tout amorçage parasite.

La PCR progressive est similaire à la TD-PCR avec moins d'incréments dans la première phase d'amorçage. À titre d'exemple, la première phase abaisse les températures de recuit tous les deux cycles de 3 ଌ, en commençant à 10 ଌ au-dessus et en finissant à 2 ଌ en dessous du T calculém. Comme la TD-PCR, la phase deux utilise les conditions standard en 3 étapes avec la température de recuit réglée à 5 ଌ en dessous de la T calculéem pendant 20 à 25 cycles supplémentaires. Cela permettrait au bon produit un avantage de 256 fois par rapport aux faux produits d'amorçage.

La PCR lente est simplement une modification de la TD-PCR et a réussi à amplifier des séquences extrêmement riches en G-C (au-dessus de 83 %) (Tableau 6). Le concept prend en compte une fonctionnalité relativement nouvelle associée aux thermocycleurs modernes, qui permet d'ajuster la vitesse de rampe ainsi que la vitesse de refroidissement. Le protocole utilise également dc 7 GTP pour réduire la formation de 2 &# x000b0structure qui pourrait inhiber la réaction. La vitesse de rampe est abaissée à 2,5 ଌ s -1 avec une vitesse de refroidissement de 1,5 ଌ s -1 pour les cycles de recuit. La première phase commence par une température de recuit de 70 ଌ et réduit la température de recuit de 1 ଌ tous les 3 tours jusqu'à ce qu'elle atteigne 58 ଌ. La deuxième phase se poursuit ensuite avec une température de recuit de 58 ଌ pendant 15 cycles supplémentaires.

La PCR nichée est un outil puissant utilisé pour éliminer les produits parasites. L'utilisation d'amorces imbriquées est particulièrement utile lorsqu'il existe plusieurs gènes paralogues dans un même génome ou lorsqu'il existe un faible nombre de copies d'une séquence cible au sein d'une population hétérogène de séquences orthologues. La procédure de base implique deux ensembles d'amorces qui amplifient une seule région d'ADN. Les amorces externes chevauchent le segment d'intérêt et sont utilisées pour générer des produits de PCR qui sont souvent non spécifiques en 20 à 30 cycles. Une petite aliquote, généralement à environ 5 μl de la première réaction de 50 μl, est ensuite utilisée comme matrice d'ADN pour 20 à 30 autres cycles d'amplification en utilisant le deuxième ensemble d'amorces qui s'hybrident à un emplacement interne par rapport au premier ensemble.

D'autres protocoles PCR sont plus spécialisés et dépassent le cadre de cet article. Les exemples incluent RACE-PCR, Multiplex-PCR, Vectorette-PCR, Quantitative-PCR et RT-PCR.

13. Résultats représentatifs

Des résultats de PCR représentatifs ont été générés en suivant les protocoles PCR de base décrits ci-dessus. Les résultats intègrent plusieurs stratégies de dépannage pour démontrer l'effet de divers réactifs et conditions sur la réaction. Gènes de la levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae et à partir d'un mycobactériophage non caractérisé ont été amplifiés dans ces expériences. Le protocole PCR standard en 3 étapes décrit dans le tableau 2 a été utilisé pour les trois expériences décrites ci-dessous.

Avant de mettre en place l'expérience PCR, l'ADN génomique des deux S. cerevisiae et les mycobactériophages ont été quantifiés et dilués à une concentration qui permettrait entre 10 4 et 10 7 molécules d'ADN par réaction. Les stocks de travail ont été préparés comme suit. Une préparation d'ADN de levure génomique a donné 104 ng/μl. Une dilution à 10 ng/μl a été générée en ajoutant 48 μl dans 452 μl de tampon TE pH 8,0. Depuis le S. cerevisiae le génome est d'environ 12,5 Mb, 10 ng contiennent 7,41 X 10 5 molécules. La préparation d'ADN de mycobactériophage génomique a donné 313 ng/μl. Une dilution à 2 ng/μl a été générée en ajoutant 6,4 μl dans 993,6 μl de tampon TE pH 8,0. Cet ADN de phage est d'environ 67 Kb. Ainsi, 1 ng contient 2,73 X 10 7 molécules, ce qui est à la limite supérieure de l'ADN généralement utilisé pour une PCR. Les stocks de travail ont ensuite été utilisés pour générer les solutions Master Mix décrites dans Tableau 7. Les expériences ont varié les conditions de cyclage comme décrit ci-dessous.

Dans Figure 3a, ADN génomique de S. cerevisiae a été utilisé comme matrice pour amplifier le gène GAL3, qui code pour une protéine impliquée dans le métabolisme du galactose. Le but de cette expérience était de déterminer la concentration optimale de Mg 2+ pour cet ensemble de réactifs. Pas de MgCl2 était présent dans le tampon PCR original et devait être complété aux concentrations indiquées avec une gamme testée de 0,0 mM à 5,0 mM. Comme le montre la figure, un produit PCR de la taille attendue (2098 pb) apparaît à partir d'une concentration en Mg 2+ de 2,5 mM (piste 6) avec une concentration optimale à 4,0 mM (piste 9). La concentration recommandée fournie par le fabricant était de 1,5 mM, ce qui correspond à la quantité fournie dans les tampons PCR typiques. De manière peut-être surprenante, la concentration nécessaire requise pour la formation du produit dans cette expérience dépassait cette quantité.

Une matrice d'ADN différente a été utilisée pour l'expérience présentée dans Figure 3b. L'ADN génomique d'un mycobactériophage a été utilisé pour amplifier un segment d'ADN conservé de 566 pb. Comme pour l'expérience précédente, la concentration optimale en Mg 2+ a dû être déterminée. Comme représenté sur la Figure 3b, l'amplification du produit de PCR souhaité nécessite au moins 2,0 mM de Mg 2+ (piste 5). Alors qu'il y avait plus de variabilité dans la quantité de produit formé à des concentrations croissantes de MgCl2, le plus de produit PCR a été observé à 4 mM de Mg 2+ (piste 9), la même concentration observée pour le gène GAL3 de levure.

Notez que dans les expériences présentées dans Figures 3A et 3B, une bande discrète a été obtenue en utilisant les conditions de cyclage considérées comme optimales sur la base des températures de recuit des amorces. Plus précisément, la température de dénaturation était de 95 ଌ avec une température d'hybridation de 61 ଌ, et l'extension a été réalisée pendant 1 minute à 72 ଌ pendant 30 cycles. L'extension finale de 5 minutes a ensuite été effectuée à 72 ଌ. Pour la troisième expérience présentée dans Figure 3c, trois changements ont été apportés aux conditions de cyclage utilisées pour amplifier le gène GAL3 de levure. Tout d'abord, la température de recuit a été réduite à une température sous-optimale de 58 ଌ. Deuxièmement, le temps d'extension a été prolongé à 1 minute et 30 secondes. Troisièmement, le nombre de cycles a été augmenté de 30 à 35 fois. Le but était de démontrer les effets de conditions d'amplification sous-optimales (c'est-à-dire, la réduction de la stringence de la réaction) sur une expérience de PCR. Comme représenté sur la Figure 3c, ce qui était un groupe discret dans Figure 3a, devient un frottis de produits non spécifiques dans ces conditions de cyclage sous-optimales. De plus, avec la stringence globale de la réaction réduite, une quantité inférieure de Mg 2+ est nécessaire pour former un amplicon.

Les trois expériences montrent que lorsque les concentrations de Mg 2+ sont trop faibles, il n'y a pas de production d'amplicon. Ces résultats démontrent également que lorsque les deux conditions de cyclage sont correctement conçues et que les réactifs sont à des concentrations optimales, l'expérience PCR produit un amplicon discret correspondant à la taille attendue. Les résultats montrent l'importance d'effectuer des expériences de PCR à une stringence suffisamment élevée (par exemple, des bandes discrètes par rapport à un frottis). De plus, les expériences indiquent que la modification d'un paramètre peut influencer un autre paramètre, affectant ainsi le résultat de la réaction.

Tableau 1. réactifs PCR dans l'ordre dans lequel ils doivent être ajoutés.

*Les unités peuvent varier d'un fabricant à l'autre

** Ajoutez tous les réactifs au Master Mix à l'exception de ceux nécessitant un titrage ou pouvant varier en fonction de la réaction. Le Master Mix représenté dans le tableau ci-dessus est calculé pour 11 réactions plus 2 réactions supplémentaires pour compenser la perte de transfert de la pipette en s'assurant qu'il y a suffisamment d'aliquotes dans chaque tube de réaction.

 Cycle PCR standard en 3 étapes 
Étape du cycleTempératureTempsNombre de cycles
Dénaturation initiale94 ଌ à 98 ଌ1 minute1
Dénaturation recuit Extension94 ଌ 5 ଌ en dessous de Tm 70 ଌ à 80 ଌ 10 à 60 secondes 30 secondes Dépendant de l'amplicon et de l'ADN polymérase 25-35
Prolongation finale70 ଌ à 80 ଌ5 minutes1
Prise*4 ଌ1

Tableau 2. Cycle PCR standard en 3 étapes.

* La plupart des thermocycleurs ont la possibilité de s'arrêter indéfiniment à 4ଌ à la fin des cycles.

 Cyclisme PCR en 2 étapes 
Étape du cycleTempératureTempsNombre de cycles
Dénaturation initiale94 ଌ à 98 ଌ1 minute1
Dénaturation Recuit/Extension94 ଌ 70 ଌ à 80 ଌ10 à 60 secondes Dépendant de l'amplicon et de l'ADN polymérase 25-35
Prolongation finale70 ଌ à 80 ଌ5 minutes1

Tableau 3. Cyclisme PCR en 2 étapes.

 Cycle PCR à démarrage à chaud 
Étape du cycleTempératureTempsCycles
Dénaturation initiale60 ଌ à 95 ଌ5 minutes puis ajouter l'ADN polymérase1
Dénaturation recuit Extension94 ଌ 5 ଌ en dessous de Tm 70 ଌ à 80 ଌ10 à 60 secondes 30 secondes Dépendant de l'amplicon et de l'ADN polymérase 25-35
Prolongation finale70 ଌ à 80 ଌ5 minutes1

Tableau 4. Cycle PCR à démarrage à chaud.

 Cyclisme PCR Touchdown 
Étape du cycleTempératureTempsCycles
Dénaturation initiale94 ଌ à 98 ଌ1 minute1
Dénaturation recuit Extension94 ଌ X =10 ଌ au-dessus de Tm 70 ଌ à 80 ଌ10 à 60 secondes 30 secondes Dépendant de l'amplicon et de l'ADN polymérase 2
Dénaturation recuit Extension94 ଌ X-1 ଌ réduire 1 ଌ tous les deux cycles 70 ଌ à 80 ଌ10 à 60 secondes 30 secondes Dépendant de l'amplicon et de la polymérase 28
Dénaturation recuit Extension94 ଌ 5 ଌ en dessous de Tm 70 ଌ à 80 ଌ10 à 60 secondes 30 secondes Dépendant de l'amplicon et de l'ADN polymérase 20-25
Prolongation finale70 ଌ à 80 ଌ5 minutes1

Tableau 5. Touchdown PCR Cyclisme.

 Ralentissement du cycle PCR 
Étape du cycleTempératureTempsCycles
Dénaturation initiale94 ଌ à 98 ଌ1 minute1
Dénaturation recuit Extension94 ଌ X ଌ =10 ଌ au-dessus de Tm 70 ଌ à 80 ଌ10 à 60 secondes 30 secondes Dépendant de l'amplicon et de la polymérase 2
Dénaturation recuit Extension94 ଌ X-1 ଌ réduire 1 ଌ tous les deux cycles 70 ଌ à 80 ଌ*10 à 60 secondes 30 secondes Dépendant de l'amplicon et de la polymérase 28
Dénaturation recuit Extension94 ଌ 5 ଌ en dessous de Tm 70 ଌ à 80 ଌ10 à 60 secondes 30 secondes Dépendant de l'amplicon et de la polymérase 20-25
Prolongation finale70 ଌ à 80 ଌ5 minutes1

Tableau 6. Ralentissement du cycle PCR.

*Pour la PCR au ralenti, la vitesse de rampe est abaissée à 2,5 ଌ s -1 avec une vitesse de refroidissement de 1,5 ଌ s -1 pour les cycles de recuit.

Tableau 7. Titrage du Mg 2+ utilisé dans figure 3.

Figure 1. Problèmes courants qui surviennent avec les amorces et l'amplification PCR en 3 étapes de l'ADN cible. (a) Auto-annelage des amorces entraînant la formation d'une structure de boucle en épingle à cheveux secondaire. Notez que les amorces ne s'hybrident pas toujours aux extrémités et peuvent former des structures en boucle plus petites. (b) L'annelage des amorces entre elles, plutôt qu'avec la matrice d'ADN, créant des dimères d'amorces. Une fois que les amorces s'hybrident les unes aux autres, elles s'allongeront jusqu'aux extrémités des amorces. (c) Cycles PCR générant un amplicon spécifique. Le cycle PCR standard en 3 étapes comprend la dénaturation de l'ADN matrice, l'annelage des amorces et l'extension de l'ADN cible (amplicon) par l'ADN polymérase.

Figure 2. Seau à glace avec réactifs, pipettes et racks requis pour une PCR. (1.) Pipette P-200, (2.) Pipette P-1000, (3.) Pipette P-20, (4.) Pipette P-10, (5.) Plaque à 96 puits et tubes PCR à paroi mince de 0,2 ml , (6.) Réactifs comprenant Taq polymérase, tampon PCR 10X, MgCl2, eau stérile, dNTP, amorces et matrice d'ADN, (7.) tubes et rack de 1,8 ml.

Figure 3. Exemple de titrages Mg 2+ utilisés pour optimiser une expérience PCR à l'aide d'un protocole PCR standard en 3 étapes. (une) S. cerevisiae L'ADN génomique de levure a été utilisé comme matrice pour amplifier un gène GAL3 de 2098 pb. Dans les pistes 1 à 6, où la concentration en Mg 2+ est trop faible, il n'y a pas de produit formé (pistes 1 à 5) ou très peu de produit formé (piste 6). Les pistes 7 à 11 représentent les concentrations optimales de Mg 2+ pour cette expérience de PCR comme indiqué par la présence du produit d'amplicon de 2098 pb. (b) Une matrice d'ADN génomique de mycobactériophage non caractérisée a été utilisée pour amplifier un amplicon de 566 pb. Pistes 1 à 4, la concentration en Mg 2+ est trop faible, comme indiqué par l'absence de produit. Les pistes 5 à 11 représentent les concentrations optimales de Mg 2+ pour cette PCR comme indiqué par la présence du produit d'amplicon de 566 kb. (c) . S. cerevisiae L'ADN génomique de levure a été utilisé comme matrice pour amplifier un gène GAL3 de 2098 pb comme indiqué dans le panneau a. Cependant, la température de recuit a été réduite de 61 ଌ à 58 ଌ, résultant en des bandes PCR non spécifiques avec des longueurs variables produisant un effet de maculage sur le gel d'agarose. Pistes 1 à 4, où la concentration en Mg 2+ est trop faible, il n'y a pas de produit formé. Les pistes 5 à 8 représentent les concentrations optimales de Mg 2+ pour cette PCR comme le montre la présence d'un frottis et d'une bande autour de la taille du produit d'amplicon de 2098 kb. Les pistes 9 à 11 indiquent des conditions excessivement strictes sans formation de produit. (a-c) Les pistes 12 sont un contrôle négatif qui ne contenait aucun ADN matrice. Lane M (marqueur) a été chargée avec NEB 1kb Ladder.

Figure 4. Tubes stériles utilisés pour la PCR. (1.) Tube de 1,8 ml (2.) Tube PCR individuel à paroi mince de 0,2 ml, (3.) Tubes et bouchons PCR à paroi mince en bande de 0,2 ml.

Figure 5. Thermocycleur. Image de gauche du thermocycleur fermé. L'image de droite contient des tubes PCR à paroi mince de 0,2 ml placés dans le bloc chauffant d'un thermocycleur ouvert.


7.6.3 Expliquer que les enzymes abaissent l'énergie d'activation des réactions chimiques qu'elles catalysent.

Les réactifs d'une réaction chimique ont besoin de gagner de l'énergie avant de pouvoir subir la réaction. Cette énergie requise est appelée énergie d'activation de la réaction et elle est nécessaire pour rompre les liaisons au sein des réactifs. À un stade ultérieur de la réaction, de l'énergie sera libérée lorsque de nouvelles liaisons se formeront. La majorité des réactions biologiques sont exothermiques. Dans les réactions exothermiques, l'énergie libérée par les nouvelles liaisons formées est supérieure à l'énergie d'activation. En d'autres termes, la réaction libère de l'énergie. Les enzymes facilitent le déroulement des réactions en diminuant l'énergie d'activation nécessaire aux réactions qu'elles catalysent.

Figure 7.6.2 - Énergie d'activation d'une réaction exothermique


Comment calculer ou connaître expérimentalement l'entropie d'enzymes ou de protéines ? - La biologie

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Les changements d'enthalpie associés à une réaction chimique peuvent être mesurés avec un calorimètre, mais le changement d'entropie associé à une réaction ne peut pas être mesuré directement.

L'entropie est une fonction d'état, ce qui signifie que le changement d'entropie dépend uniquement des états initial et final d'un système. Ainsi, comme les changements d'enthalpie, les changements d'entropie peuvent provenir de tables de référence calculées d'entropies molaires standard. 

Pour une réaction se produisant dans des conditions standard, la variation d'entropie associée est déterminée par la différence entre la somme des entropies molaires standard des produits multipliée par leurs coefficients stoechiométriques et la somme des entropies molaires standard des réactifs multipliée par leurs coefficients stoechiométriques.

Considérons la combustion de l'éthylène dans des conditions standard, où 1 mole d'éthylène gazeux réagit avec 3 moles d'oxygène gazeux pour produire 2 moles de dioxyde de carbone gazeux et 2 moles d'eau.

Le changement d'entropie standard pour la réaction est égal à la somme de 2 fois l'entropie standard du gaz carbonique et 2 fois l'entropie standard de l'eau, moins la somme de l'entropie standard du gaz éthylène et 3 fois l'entropie standard de l'oxygène.&# 160

Notez que, contrairement aux enthalpies standard de formation des éléments, qui sont nulles, les entropies molaires standard de toutes les substances sont supérieures à zéro à 298 K.

La substitution des valeurs des entropies molaires des réactifs et des produits du tableau de référence donne [(2 × 213,8) + (2 × 70,0)] − [(219,5 + 3) × (205.3)]. L'entropie nette des produits est égale à 567,6 J/K et l'entropie nette des réactifs est de 835,4 J/K.

La différence entre les produits et les réactifs est de moins 268 J/K pour le changement d'entropie standard de la combustion de l'éthylène. La valeur négative indique qu'il y a une diminution de l'entropie.

Même sans calculer le changement d'entropie exact, la diminution de l'entropie peut être prédite en examinant la réaction. Rappelons que les gaz sont plus désordonnés que les liquides.

Il y a plus de moles de gaz dans les réactifs, 4 moles de gaz (avec 1 mole d'éthylène et 3 moles d'oxygène) par rapport aux produits (seulement 2 moles de gaz carbonique), tandis que l'autre produit est un liquide.

Ainsi, dans cette réaction, les réactifs sont plus désordonnés que les produits. Par conséquent, l'entropie diminue au fur et à mesure que la réaction progresse.

17.5 : Changement d'entropie standard pour une réaction

L'entropie est une fonction d'état, donc le changement d'entropie standard pour une réaction chimique (ΔS°rxn) peut être calculé à partir de la différence d'entropie standard entre les produits et les réactifs.

mp et mr représentent les coefficients stoechiométriques dans l'équation équilibrée des produits et des réactifs, respectivement.

Par exemple, ΔS°rxn pour la réaction suivante à température ambiante

Une liste partielle des entropies standard est fournie dans le tableau.

Substance   S° (J/mol·K)  
C (s, graphite) 5.740
  C (s, diamant)   2.38
CO (g) 197.7
CO2 (g) 213.8
CH4 (g) 186.3
C2H4 (g) 219.5
C2H6 (g) 229.5
CH3OH (je) 126.8
 C2H5OH (je 160.7
H2 (g) 130.57
H (g) 114.6
H2O (g) 188.71
H2O (je) 69.91
HCI (g) 186.8
H2S (g) 205.7
O2 (g) 205.03

Détermination de ΔS°

Considérons la condensation de l'eau, dans laquelle 1 mole de H gazeux2O se transforme en 1 mole de liquide H2O.

L'entropie standard change pour la réaction, ΔS°rxn est calculé en utilisant les entropies molaires standard et les coefficients stoechiométriques.

La valeur pour ΔS°rxn est négatif, comme prévu pour cette transition de phase (condensation).
Comme deuxième exemple, considérons la combustion du méthanol, CH3OH:

La même procédure est suivie pour calculer le changement d'entropie standard de la réaction :


AP Lab 2 Rapport 2001

introduction
Les enzymes sont des protéines produites par des cellules vivantes qui agissent comme des catalyseurs, qui affectent la vitesse d'une réaction biochimique. Ils permettent à ces réactions biochimiques complexes de se produire à une température relativement basse et avec une consommation d'énergie moindre.

Dans les réactions catalysées par une enzyme, un substrat, la substance sur laquelle agir, se lie au site actif d'une enzyme pour former le produit souhaité. Chaque site actif sur l'enzyme est unique au substrat avec lequel il se liera, chacun ayant une structure tridimensionnelle individuelle. Cette réaction est réversible et se présente comme suit :

Les enzymes sont recyclables et inchangées pendant la réaction. Le site actif est la seule partie de l'enzyme qui réagit avec le substrat. Cependant, sa structure protéique unique dans certaines circonstances peut facilement être dénaturée. Certains des facteurs qui affectent les réactions enzymatiques sont la concentration en sel, le pH, la température, la concentration en substrat et en produit, ainsi que les activateurs et les inhibiteurs.

Les enzymes nécessitent un environnement très spécifique pour être efficaces. La concentration en sel doit être dans une concentration intermédiaire. Si la concentration en sel est trop faible, les chaînes latérales enzymatiques s'attirent et forment un précipité inactif. De même, si la concentration en sel est trop élevée, la réaction enzymatique est bloquée par les ions sels. Le pH optimal pour une réaction catalysée par une enzyme est neutre (7 sur l'échelle de pH). Si le pH augmente et devient basique, l'enzyme commence à perdre ses ions H+, et s'il devient trop acide, l'enzyme gagne des ions H+. Ces deux conditions dénaturent l'enzyme et provoquent un changement de forme de son site actif.

Les enzymes ont également une température optimale, qui est obtenue lorsque l'enzyme fonctionne à son maximum, et si elle est augmentée davantage, l'enzyme se dénaturera. Pour les concentrations de substrat et de produit, les enzymes suivent la loi d'action de masse, qui dit que la direction d'une réaction dépend directement de la concentration. Les activateurs permettent aux sites actifs de mieux s'adapter à un substrat, ce qui augmente la vitesse de réaction. Les inhibiteurs se lient au site actif des enzymes et empêchent le substrat de se lier, provoquant l'arrêt de la réaction.

L'enzyme de ce laboratoire est la catalase, qui est produite par des organismes vivants pour empêcher l'accumulation de peroxyde d'hydrogène toxique. Le peroxyde d'hydrogène se décompose pour former de l'eau et de l'oxygène comme dans l'équation suivante :

Cette réaction se produit spontanément sans catalase, mais l'enzyme accélère considérablement la réaction. Le but de ce laboratoire est de prouver que la catalase accélère la décomposition du peroxyde d'hydrogène et de déterminer la vitesse de cette réaction.

Hypothèse
L'enzyme catalase, dans des conditions optimales, accélère efficacement la décomposition du peroxyde d'hydrogène.

Matériaux
Exercice 2A : Test de l'activité catalase

Dans la partie 1, les matériaux utilisés étaient 10 ml de H2O à 1,5 %, un bécher en verre de 50 ml, 1 ml de catalase et 2 pipettes et pompes à pipettes de 10 ml. Dans la partie 2, les matériaux utilisés étaient 5 ml de catalase, un bain-marie bouillant, 1 tube à essai, un support pour tubes à essai, 10 ml de H2O à 1,5 %, un bécher de 50 ml et 2 pipettes et pompes à pipettes de 10 ml. Dans la partie 3, les matériaux utilisés étaient 10 ml de H2O à 1,5 %, un bécher de 50 ml, du foie et une seringue.

Exercice 2B : Le test de base

Cette partie du laboratoire nécessitait 10 ml de H2O à 1,5 %, 1 ml de H2O distillé, 10 ml de H2SO4, 2 béchers de 50 ml, une feuille de papier blanc, 5 ml de KMnO4, 2 seringues de 5 ml et 2 seringues de 10 ml. pipettes et pompes.

Exercice 2C : Le taux non catalysé de décomposition de H2O2

Les matériaux utilisés pour cette section étaient 15 ml de H2O à 1,5 %, 1 ml de H2O distillé, 10 ml de H2SO4, 2 béchers de 50 ml, une feuille de papier blanc, 5 ml de KMnO4, 2 seringues de 5 ml et 2 seringues de 10 ml. pipettes et pompes.

Exercice 2D : Un taux de décomposition de H2O2 catalysé par une enzyme

Le matériel requis pour l'exercice 2D était de 70 ml de H2O2 à 1,5 %, 70 ml de H2SO4, 6 ml de solution de catalase, 13 gobelets en plastique étiquetés, 3 béchers de 100 ml, 1 bécher de 50 ml, 1 seringue de 10 ml, 1 Seringue de 5 ml, 1 seringue de 60 ml, une feuille de papier blanc, une minuterie et 30 ml de KMnO4.

Méthode
Exercice 2A : Test de l'activité catalase

Dans la partie 1, 10 ml de H2O2 à 1,5 % ont été transférés dans un bécher de 50 ml. Ensuite, 1 ml de solution de catalase fraîche a été ajouté et la réaction a été observée et enregistrée. Dans la partie 2, 5 ml de catalase ont été placés dans un tube à essai et placés dans un bain d'eau bouillante pendant cinq minutes. 10 ml de H202 à 1,5 % ont été transférés dans un bécher de 50 ml et 1 ml de la catalase bouillie a été ajouté. La réaction a été observée et enregistrée. Dans la partie 3, 10 ml de H2O2 à 1,5 % ont été transférés dans un bécher de 50 ml. 1 cm3 de foie a été ajouté dans le bécher et la réaction a été observée et enregistrée.

Exercice 2B : Le test de base

10 ml de H2O2 à 1,5 % ont été transférés dans un bécher de 50 ml. 1 ml de H2O a été ajouté à la place de la catalase, puis 10 ml de H2SO4 ont été ajoutés. Après avoir bien mélangé, un échantillon de 5 ml a été prélevé et placé sur une feuille de papier blanc. Une seringue de 5 ml a été utilisée pour ajouter du KMnO4, 1 goutte à la fois jusqu'à l'obtention d'une couleur brune ou rose persistante. La solution a été agitée après chaque goutte, et les résultats ont été observés et enregistrés. Le dosage de base a été calculé.

Exercice 2C : Le taux non catalysé de décomposition de H2O2

Une petite quantité de H2O2 a été placée dans un bécher et stockée à découvert pendant environ 24 heures. Pour déterminer la quantité de H2O2 restante, 10 ml de H2O2 à 1,5 % ont été transférés dans un bécher de 50 ml. 1 ml de H2O a été ajouté à la place de la catalase, puis 10 ml de H2SO4 ont été ajoutés. Après avoir bien mélangé, un échantillon de 5 ml a été prélevé et placé sur une feuille de papier blanc. Une seringue de 5 ml a été utilisée pour ajouter du KMnO4, 1 goutte à la fois jusqu'à l'obtention d'une couleur brune ou rose persistante. La solution a été agitée après chaque goutte, et les résultats ont été observés et enregistrés. Le pourcentage de H2O2 spontanément décomposé a été calculé.

Exercice 2D : Un taux de décomposition de H2O2 catalysé par une enzyme

Le dosage de base a été rétabli en suivant les instructions de l'exercice 2B. Avant de commencer l'expérience proprement dite, il a fallu beaucoup de préparation. Six tasses étiquetées ont été disposées en fonction de leurs temps et 10 ml de H2O2 ont été ajoutés à chaque tasse. 6 ml de catalase ont été placés dans une seringue de 10 ml et 60 ml de H2SO4 ont été placés dans une seringue de 60 ml. Pour démarrer le laboratoire proprement dit, 1 ml de catalase a été ajouté à chacune des tasses, tandis que simultanément, la minuterie a été démarrée. Chacune des tasses a été agitée. A 10 secondes, 10 mL de H2SO4 ont été ajoutés pour arrêter la réaction. Les mêmes étapes ont été répétées pour les coupes de 30, 60, 120, 180 et 360 secondes, respectivement.

Ensuite, cinq échantillons de 5 ml de chacun des plus grands gobelets ont été déplacés vers les plus petits gobelets étiquetés correspondants. Chaque échantillon a été dosé séparément en plaçant chacun sur une feuille de papier blanc. Une seringue de 5 ml a été utilisée pour ajouter du KMnO4, 1 goutte à la fois jusqu'à l'obtention d'une couleur brune ou rose persistante. La solution a été agitée après chaque goutte, et les résultats ont été observés et enregistrés.


Biologie Moléculaire 02 : 'Thermodynamique du repliement des protéines'

Suite de la leçon 01. ω est toujours 0 ou +180°. Si vous tracez Φ et , vous constatez que seuls quelques clusters sont bien représentés : une gamme de combinaisons d'hélices , une zone de feuille β et une troisième zone plus rare (appelée Lα et peuplée d'hélices de gauche). ω se trouve généralement dans le trans conformation due à l'encombrement stérique des chaînes latérales consécutives, cependant, la proline parce qu'elle est ancrée à l'épine dorsale a une torsion unique qui permet une cis conformation.

Structure secondaire

Les hélices et les feuillets sont deux manières de permettre aux groupes NH et C=O du squelette de former des liaisons hydrogène. Les hélices contiennent 3,6 résidus par rotation, ou en d'autres termes, chaque résidu couvre 100° de rotation. Les barreaux consécutifs d'une hélice sont séparés de 5,4Å. les hélices sont presque exclusivement droitier. Dans une hélice α à droite, vous tournez dans le sens inverse des aiguilles d'une montre au fur et à mesure en haut. Dans une hélice α gauche, vous tournez dans le sens des aiguilles d'une montre en montant. Les chaînes latérales pointent vers l'extérieur de l'hélice. Si vous tracez l'endroit où chaque résidu tombe sur l'hélice en fonction de la règle de 3,6 résidus/tour, vous constatez que les hélices amphipathiques à moitié enterrées ont tous les résidus hydrophobes d'un côté et les hydrophiles de l'autre côté. Une hélice entièrement enterrée sera constituée de tous les résidus hydrophobes et une hélice entièrement exposée sera constituée de tous les résidus hydrophiles.

Dans les feuillets , toutes les liaisons H potentielles sont satisfaites à l'exception des brins « flanquants » à chaque extrémité de la feuille. Environ 20% des feuillets β trouvés dans la nature sont mixtes parallèles et anti-parallèles, les 80% restants sont purs l'un ou l'autre. Les feuilles β ne sont pas plates, mais plissées.

Structure tertiaire

Une seule feuille ou hélice n'est pas stable dans l'eau. La structure tertiaire est l'emballage de ces éléments et des boucles les reliant les uns aux autres.

Thermodynamique du repliement des protéines

Il y a deux problèmes fondamentaux dans le repliement des protéines :

  1. Peut-on prédire la structure d'une protéine à partir de sa séquence ? est-ce que l'échantillonnage de toutes les conformations possibles d'une chaîne polypeptidique pour trouver l'état de plus faible énergie prendrait des millions d'années plutôt que quelques secondes, alors comment les protéines se replient-elles si rapidement ?

À titre d'exemple, considérons le clivage métalloprotéase de Notch pour créer le domaine intracellulaire de Notch (NICD), qui se transfère ensuite vers le noyau et affecte la transcription. Le site protéolytique de Notch est protégé par des répétitions Lin12/Notch qui sont connectées aux répétitions EGF qui interagissent avec le ligand de Notch. On pense que le ligand applique une force qui déplie cette région, permettant le clivage. Les mutations qui déstabilisent ce repli et entraînent une activation constitutive provoquent des tumeurs.

La thermodynamique ne peut décrire que qu'il s'agisse une réaction chimique se produira spontanément ou non, pas à quelle vitesse elle se produira (voir Biochimie 01).

L'énergie d'un système est sa capacité à travailler.

Où U est l'énergie interne, q est la chaleur et w est le travail.

Où C est la capacité calorifique et f et i signifient final et initial.

Où F est la force et Δx est le déplacement le long de l'axe x.

Si vous dissolvez l'urée dans l'eau dans une solution 4M, elle se dissoudra spontanément et la solution deviendra froide (tout comme la guanidine, comme je l'ai appris ici).

L'énergie libre de Gibb est définie comme :

Où G, H, T et S sont respectivement l'énergie libre, l'enthalpie, la température et l'entropie de Gibb.

Si ΔG < 0 la réaction se déroulera spontanément.

Dans l'exemple de l'urée, H > 0 car de l'énergie est nécessaire pour séparer les molécules d'urée en interaction, en utilisant la chaleur de l'eau. Pourtant, la réaction se produit toujours spontanément car ΔS > 0 de beaucoup - la solution d'urée est beaucoup plus entropique que l'urée et l'eau séparément.

Pour la réaction A + B C + D, on définit :

L'ATP est une molécule particulière : son hydrolyse en ADP est spontanée aux concentrations physiologiques des réactifs et produits, c'est-à-dire ΔG < 0 pour cette réaction :

Le principe de Le Chatelier dit que vous pouvez conduire la réaction en sens inverse, en produisant de l'ATP spontanément, simplement en augmentant les concentrations des produits. Cependant [Pje] n'est jamais assez élevé dans la cellule pour que l'ATP soit généré spontanément à partir de l'ADP. La production défavorable d'ATP est plutôt créée via une réaction couplée avec des réactions favorables telles que la libération de protons à travers la membrane mitochondriale (voir Biochimie 08).

Enthalpie

Où U, P et V sont l'énergie interne, la pression et le volume.

Dans des conditions physiologiques, les changements de pression et de volume sont presque toujours négligeables, de sorte que H et U sont étroitement couplés. En d'autres termes, dans la plupart des systèmes biologiques, l'enthalpie est égale à l'énergie interne.

Les gens ont développé des simulations de dynamique moléculaire des forces atomiques fondamentales qui déterminent l'enthalpie d'une protéine (angles dièdres, interactions de Van der Waals, interactions électrostatiques, etc.) et tentent de minimiser l'énergie pour déterminer le repliement d'une protéine. Mais il y a tellement de degrés de liberté que les dépenses de calcul empêchent d'exécuter la simulation assez longtemps pour trouver l'état d'énergie le plus bas. Il existe encore des tentatives, telles que [email protected], Foldit et D.E. Anton de Shaw. Anton détient le record de la plus longue simulation de dynamique moléculaire - elle a duré un temps incalculable, calculant l'énergie qu'une protéine aurait à chaque femtoseconde ou quelque chose du genre, afin de simuler 1 milliseconde du mouvement de la protéine. De toute évidence, le temps qu'Anton a mis pour simuler cette milliseconde était supérieur à une milliseconde.

Entropie

Où kb est la constante de Boltzmann et W est le nombre de microétats qui donnent lieu au macroétat d'intérêt.

Mon explication préférée à ce sujet est celle donnée par Richard Feynman. En le lisant, j'ai compris pour la première fois à quel point l'entropie physique et l'entropie de l'information sont le même concept :

Nous devons donc maintenant parler de ce que nous entendons par désordre et de ce que nous entendons par ordre. … Supposons que nous divisons l'espace en petits éléments de volume. Si nous avons des molécules noires et blanches, de combien de manières pourrions-nous les répartir entre les éléments de volume de sorte que le blanc soit d'un côté et le noir de l'autre ? D'un autre côté, de combien de manières pourrions-nous les distribuer sans aucune restriction quant à savoir qui va où ? De toute évidence, il existe de nombreuses autres façons de les organiser dans ce dernier cas. Nous mesurons le « désordre » par le nombre de façons dont l'intérieur peut être arrangé, de sorte que de l'extérieur, il se ressemble. Le logarithme de ce nombre de voies est l'entropie. Le nombre de voies dans le cas séparé est moindre, donc l'entropie est moindre, ou le "désordre" est moindre.

— Richard Feynman, cité ici

En biologie, l'entropie est très souvent la force motrice, par exemple pour l'enfouissement de domaines protéiques hydrophobes. Imaginez une molécule d'eau dans un tétraèdre. Le tétraèdre a quatre coins et l'eau a deux hydrogènes, vous pouvez donc placer la molécule dans 4 choix 2 = 6 orientations. Si vous ajoutez un groupe non polaire d'une molécule voisine à un coin du tétraèdre, seuls trois des six états restent favorables (en permettant toujours la liaison hydrogène). Donc Shydrophobe = kbln(3) - kbln(6) < 0, ce qui signifie que l'entropie a diminué.

Considérez le mélange d'époxy et de durcisseur dans de l'époxy durci. Cette réaction a ΔS < 0 car le solide a moins de micro-états que les liquides. Pourtant, la réaction se produit spontanément à température ambiante, il doit donc être vrai que ΔH < 0. De la chaleur est donc libérée - en fait, la réaction est extrêmement exothermique. Joe a mesuré la température de « 5 minutes d'époxy » et elle est passée de 21 °C à >40°C au bout de 5 minutes.

Une vue incorrecte et simpliste du repliement des protéines est la suivante. Une protéine dépliée a une entropie configurationnelle élevée mais également une enthalpie élevée car elle a peu d'interactions stabilisantes. Une protéine repliée a beaucoup moins d'entropie, mais aussi beaucoup moins d'enthalpie.Il y a ici un compromis entre H et S. Notez que parce que ΔG = ΔH - TΔS, l'augmentation de la température pèse plus lourdement sur le terme S, ce qui signifie qu'une température plus élevée favorise le développement.

Toute cette explication ne considère que l'énergie de la protéine et non celle du solvant. En fait, les domaines hydrophobes d'une protéine contraignent les configurations possibles de l'eau environnante (voir explication ci-dessus), et donc leur enfouissement lors du repliement augmente l'entropie de l'eau. De plus, il s'avère que la liaison hydrogène des résidus polaires et du squelette est satisfaite à la fois à l'état déplié (par l'eau) et à l'état replié (l'un par l'autre). Par conséquent, l'enthalpie est « à somme nulle » et le repliement des protéines est presque entièrement dû à l'entropie.

Voici une description d'une technique appelée calorimétrie différentielle à balayage. Vous appliquez des quantités égales de chaleur à deux solutions, une avec uniquement un tampon et l'autre avec un tampon et des protéines, et vous mesurez la température dans chaque solution. Finalement, la protéine atteint sa température de fusion Tm, où la protéine est repliée à 50 % et dépliée à 50 % et G = 0. À Tm, la fusion de la protéine absorbe une grande partie de la chaleur appliquée et la température n'augmente donc pas autant que dans la solution tampon uniquement.

Une autre technique pour mesurer la stabilité de la protéine est la force requise pour la déplier en utilisant la microscopie à force atomique à molécule unique.

Les dénaturants courants sont l'urée et le chlorhydrate de guanidine. Étonnamment, nous ne savons toujours pas comment ils fonctionnent. On pense qu'ils stabilisent toutes les parties constitutives de la protéine dépliée. La guanidine peut entourer ces domaines hydrophobes défavorables de la protéine mais ensuite exposer son propre côté hydrophile à l'eau, de sorte que le mouvement de l'eau n'est pas contraint.

À propos d'Eric Vallabh Minikel

Eric Vallabh Minikel est dans une quête permanente pour prévenir la maladie à prions. Il est un scientifique basé au Broad Institute du MIT et à Harvard.


Digestion enzymatique de restriction

La préparation d'ADN pour les méthodes de clonage traditionnelles dépend de la digestion par des enzymes de restriction pour générer des extrémités compatibles capables d'être ligaturées ensemble. L'ADN à cloner peut être très variable, allant de l'ADN génomique extrait d'une culture bactérienne pure ou d'une population mixte, à un gène préalablement cloné qui doit être déplacé d'un vecteur à un autre (sous-clonage). Les enzymes de restriction peuvent également être utilisées pour générer des extrémités compatibles sur les produits PCR. Dans tous les cas, une ou plusieurs enzymes de restriction sont utilisées pour digérer l'ADN, ce qui entraîne une insertion non directionnelle ou directionnelle dans le plasmide compatible.

L'ADN génomique, quelle que soit la source, est généralement digéré avec des enzymes de restriction qui reconnaissent 6 à 8 bases consécutives, car ces sites de reconnaissance se produisent moins fréquemment dans le génome que les sites à 4 bases et entraînent des fragments d'ADN plus gros. La taille d'insert souhaitée pour la bibliothèque de clones détermine quelles enzymes sont sélectionnées, ainsi que les conditions de digestion. Le plus souvent, une dilution en série de la ou des enzymes de restriction sélectionnées est utilisée pour digérer le matériau de départ et la plage de tailles d'insert souhaitée est isolée par électrophorèse suivie d'une extraction sur gel de l'ADN. Ce procédé de préparation fournit des fragments d'ADN de la taille souhaitée avec des extrémités compatibles avec l'ADN vecteur sélectionné.

Le sous-clonage nécessite l'utilisation de 1 à 2 enzymes de restriction qui coupent immédiatement à l'extérieur du fragment d'insert sans couper à l'intérieur de l'insert lui-même. Les enzymes de restriction qui ont un site de reconnaissance dans le site de clonage multiple (MCS) sont couramment utilisées car elles ne coupent pas ailleurs dans l'ADN du vecteur et produisent généralement deux fragments d'ADN facilement résolus. Le gène d'intérêt est le plus souvent sous-cloné dans un vecteur d'expression pour une expression protéique améliorée et/ou l'ajout d'un marqueur de purification. Dans ce cas, il est essentiel que le gène soit inséré dans la bonne orientation et dans le cadre avec le promoteur de transcription.

La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est couramment utilisée pour amplifier un gène ou un fragment d'ADN d'intérêt, à partir de n'importe quelle source d'ADN, à cloner. Afin de générer des extrémités compatibles, il est courant d'ajouter des sites de restriction à l'extrémité 5&rsquo des deux amorces PCR. Lors de l'ajout de sites de restriction à une amorce PCR, il est recommandé d'inclure 6 bases entre le site de reconnaissance et l'extrémité 5&rsquo de l'amorce. Ces bases supplémentaires fournissent suffisamment d'ADN pour que l'enzyme de restriction se lie au site de reconnaissance et coupe efficacement. Lors de la sélection d'un ou plusieurs sites de restriction à ajouter aux amorces, il est important de déterminer quel(s) site(s) sera compatible avec votre vecteur sélectionné, si un clonage directionnel est souhaité et, surtout, de confirmer que le ou les sites de reconnaissance ne se produit pas dans le gène ou le fragment d'ADN.


Calcul de l'enthalpie et de l'entropie de fusion d'un solide inconnu.

Le volume molaire d'un certain solide est de 142,0 cm3/mol à 1,00 atm et 427,15 K, sa température de fusion.
Le volume molaire du liquide à cette température et pression est de 152,6 cm3/mol.
A 1,2 MPa, la température de fusion passe à 429,26 K. Calculez l'enthalpie et l'entropie de fusion du solide.

1 réponse

#DeltaS_"fus" = "5,52 J/mol K"#
#DeltaH_"fus" = "2,36 kJ/mol"#

Explication:

Votre outil de choix pour ce problème sera le Équation de Clapeyron utilisé sous la forme

Maintenant, vous savez que la relation suivante existe entre le changement d'enthalpie de fusion, #DeltaH_f# , et le changement d'entropie de fusion, #DeltaS_f#

Ceci est dérivé de la Changement d'énergie gratuite de Gibbds à l'équilibre

Comme à l'équilibre #DeltaG = 0# , il s'ensuit que vous avez

#DeltaH = T * DeltaS implique DeltaS = (DeltaH)/T#

Maintenant, dans votre cas, #T# représenterait le température de mesure. Une bonne règle à suivre ici est que vous pouvez utiliser le moyenne des deux températures de fusion données

Maintenant, c'est à votre tour devrait réorganiser l'équation #color(violet)((1))# pour résoudre #dT# , puis intégrer, mais toi pourrait sautez cette étape si vous partez du principe que le changement de température, #dT# , est assez petit.

Vous pouvez vous en tirer avec une telle approximation parce que vous travaillez sur la ligne de phase solide - liquide, vous êtes donc obligé d'avoir de petits changements de température dans de tels cas.

Maintenant, si vous prenez cette route, vous pouvez dire que

À ce stade, vous avez tout ce dont vous avez besoin pour résoudre #DeltaS_"fus"# . Plus précisément, vous savez que

Voici la partie délicate - vous devez convertir #DeltaV_"fus"# et #DeltaP# en mètres cubes par mole, #"m"^3"/mol",# et pascal, #"Pa"# - vous comprendrez pourquoi dans une minute !

#DeltaV_"fus" = V_2 - V_1 = "152,6 cm"^3 - "142,0 cm"^3 = "10,6 cm"^3#

#10.6couleur(rouge)(annuler(couleur(noir)("cm"^3)))/"mol" * "1 m"^3/(10^6couleur(rouge)(annuler(couleur(noir)(" cm"^3)))) = 10,6 * 10^(-6)"m"^3"/mol"#

#DeltaP = 1,2 * 10^6"Pa" - 1,01325 * 10^5"Pa" = 10,987 * 10^5"Pa"#

Alors, branchez ces valeurs et résolvez pour #DeltaS_"fus"#

#DeltaS_"fus" = (DeltaP)/(DeltaT) * DeltaV_"fus"#

#DeltaS_"fus" = (10,987 * 10^5"Pa")/"2,11 K" * 10,6 * 10^(-6)"m"^3/"mol"#

Mais #"Pa" xx "m"^3 = "J"# , donc la réponse sera

Utilisez maintenant l'équation #color(violet)((2))# pour obtenir

#DeltaH_"fus" = DeltaS_"fus" * T_"moyenne"#

#DeltaH_"fus" = 5.52"J"/("mol" * couleur(rouge)(annuler(couleur(noir)("K")))) * 428.21couleur(rouge)(annuler(couleur(noir)(" K"))) = 2363,72 "J"/"mol"#

Je vais également laisser cette valeur arrondie à trois sig figs, mais exprimée en kilojoules par mole