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13.48 : Réponse inflammatoire et leucocytes - Biologie

13.48 : Réponse inflammatoire et leucocytes - Biologie



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Que se passe-t-il lorsqu'un ennemi dépasse la première ligne de défense ?

Pour que ce porteur de ballon franchisse la première ligne de défense, il doit généralement y avoir un trou ou une rupture dans la ligne. Il se heurte alors au secondaire, ou deuxième ligne de défense. Chaque fois que la peau est cassée, il est possible que des agents pathogènes pénètrent facilement dans votre corps. Ils dépassent la première ligne de défense et se heurtent à la deuxième ligne de défense.

La deuxième ligne de défense

Si vous avez une coupure à la main, la coupure de la peau permet aux agents pathogènes de pénétrer dans votre corps. Supposons que les bactéries pénètrent par la coupure et infectent la plaie. Ces bactéries rencontreraient alors la deuxième ligne de défense du corps.

Réaction inflammatoire

La coupure sur votre main peut devenir rouge, chaude et enflée. Ce sont les signes d'uneréaction inflammatoire. Il s'agit de la première réaction du corps à des lésions tissulaires ou à une infection. Comme expliqué dans Chiffre ci-dessous, la réponse est déclenchée par des produits chimiques appelés cytokines ethistamines, qui sont libérés lorsque les tissus sont blessés ou infectés. Les produits chimiques communiquent avec d'autres cellules et coordonnent la réponse inflammatoire. Vous pouvez voir une animation de la réponse inflammatoire à ce lien : http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/inflammatoire.html.

Ce dessin montre ce qui se passe pendant la réponse inflammatoire. Pourquoi les changements dans les capillaires sont-ils importants pour cette réponse ?

Leucocytes

Les produits chimiques qui déclenchent une réponse inflammatoire attirent les leucocytes sur le site de la blessure ou de l'infection. Leucocytes sont des globules blancs. Leur rôle est de combattre les infections et de se débarrasser des débris. Les leucocytes peuvent répondre par une défense non spécifique ou spécifique.

  • UNE défense non spécifique est le même quel que soit le type d'agent pathogène en cause. Un exemple de défense non spécifique est phagocytose. C'est le processus par lequel les leucocytes engloutissent et décomposent les agents pathogènes et les débris. Il est illustré dans Chiffre au dessous de. La première ligne de défense du système immunitaire est également une défense non spécifique.
  • UNE défense spécifique est adapté à un agent pathogène particulier. Les leucocytes impliqués dans ce type de défense font partie de la réponse immunitaire et sont décrits dans d'autres concepts.

Sur cette image, les leucocytes (blancs) attaquent les agents pathogènes (en forme d'étoile).

Sommaire

  • La deuxième ligne de défense attaque les agents pathogènes qui parviennent à pénétrer dans le corps.
  • La deuxième ligne de défense comprend la réponse inflammatoire et la phagocytose par les leucocytes non spécifiques.

Revoir

  1. Qu'est-ce qu'une défense non spécifique ?
  2. Quelle est la seconde vie de défense du corps ? Quand prend-il effet ?
  3. Identifier les rôles des leucocytes non spécifiques dans la deuxième ligne de défense du corps.
  4. Jera s'est coupé le doigt. Le lendemain, la peau autour de la coupure est devenue rouge et chaude. Pourquoi ces signes d'infection?

Activité sérique du DPPIV et son expression sur les lymphocytes chez les patients atteints de mélanome et chez les personnes atteintes de vitiligo

La dipeptidyl peptidase IV, une sérine protéase multifonctionnelle, est impliquée dans la régulation de la transformation maligne, la promotion et la progression ultérieure du cancer, exerçant des activités de suppression tumorale ou même complètement opposées - de promotion tumorale.

Le but de la présente recherche était de déterminer l'activité sérique de DPPIV, ainsi que les pourcentages de lymphocytes CD26+, de globules blancs CD26+ globaux et l'intensité de fluorescence moyenne de l'expression de CD26 sur les lymphocytes chez les patients atteints de mélanome, les personnes atteintes de vitiligo et chez les témoins sains.

Méthodes

L'activité de la DPPIV dans le sérum a été déterminée par test colorimétrique. L'expression de DPPIV (sous forme de CD26) sur des globules blancs périphériques immunocompétents a été réalisée en utilisant une analyse par cytométrie de flux.

Résultats

Les données de notre étude montrent pour la première fois une diminution statistiquement significative : de l'activité DPPIV sérique, du pourcentage de globules blancs CD26+ totaux et du pourcentage de lymphocytes chez les patients atteints de mélanome par rapport aux personnes témoins saines. De plus, une activité sérique de DPPIV significativement plus faible a été trouvée dans le groupe de patients atteints de mélanome par rapport aux personnes atteintes de vitiligo également.

Conclusion

Cette étude indique la nécessité d'explorer la cause et l'importance des perturbations de l'activité sérique de DPPIV et de l'expression de CD26 sur des cellules immunocompétentes dans des mécanismes moléculaires complexes sous-tendant le développement et la progression du mélanome.


1. Introduction

Les ganglions lymphatiques (LN) sont de petits organes en forme de haricot situés le long des vaisseaux lymphatiques qui drainent le parenchyme des organes non lymphoïdes. Comme les autres organes lymphoïdes secondaires (SLO), les LN ont une architecture lymphoïde caractéristique, avec des domaines cellulaires B et T séparés organisés par des types de cellules stromales distincts [1, 2]. Cette structure facilite la rencontre de lymphocytes rares et spécifiques d'un antigène avec des cellules dendritiques (CD) porteuses d'antigène et soutient ainsi les réponses immunitaires primaires [3, 4]. La formation de LN se produit au cours de l'embryogenèse tardive selon un programme de développement qui se déroule indépendamment de l'antigène ou de l'inflammation [5]. Cependant, les lymphocytes peuvent également rencontrer des antigènes en dehors des LN, comme le montrent les reptiles et les oiseaux (espèces dépourvues de LN) et chez les souris expérimentales dépourvues de SLO [6]. Dans ces cas, les cellules T et B s'agrègent dans le parenchyme des organes périphériques non lymphoïdes et forment même des domaines distincts des cellules B et T similaires à ceux des SLO classiques. Parce que ces agrégats lymphoïdes ne se produisent pas dans le cadre d'un programme de développement et ne se forment qu'après une inflammation locale, ils sont appelés organes lymphoïdes tertiaires (TLO) [7, 8].

Trois types de TLO sont retrouvés dans le poumon : les foyers inflammatoires nodulaires (NIF), composés d'amas de cellules myéloïdes et de granulomes de cellules CD8+T [9], comme ceux formés au cours Mycobacterium tuberculosis infection, caractérisée par un noyau central de macrophages infectés entourés de cellules B et de cellules T [10] et de tissu lymphoïde associé aux bronches (iBALT) inductible, qui ressemble le plus à l'architecture des SLO classiques et se trouve dans l'espace périvasculaire entourant le gros sang vaisseaux et le long des voies respiratoires du poumon [7, 11]. La formation d'IBALT se produit en réponse à de nombreuses conditions inflammatoires, en utilisant une variété de voies moléculaires. Dans ce chapitre, nous résumerons la compréhension actuelle des étapes menant au développement d'iBALT et passerons brièvement en revue l'impact d'iBALT sur les réponses immunitaires pulmonaires contre les infections microbiennes, les allergènes et les auto-antigènes.


Résultats

Les PDC humains expriment l'ARNm des récepteurs de l'adénosine

Le schéma d'expression des 4 sous-types de récepteurs de l'adénosine, noté A1, UNE2a, UNE2b, et A3, dans les PDC humaines a été évaluée par RT-PCR. Ex vivo, les PDC ont exprimé l'ARNm pour A1 mais pas pour A2b ou un3 récepteurs (Figure 1). UNE2a l'expression de l'ARNm du récepteur a été observée à de faibles niveaux chez certains donneurs et était absente chez d'autres. Stimulation nocturne avec IL-3 et CD40L induite par la régulation négative de A1 et régulation à la hausse de A2a ARNm du récepteur (Figure 1). Comme observé avec les PDC immatures, aucun A2b ou un3 L'ARNm du récepteur a été détecté dans les PDC matures. Ce modèle différait des DC immatures dérivées de monocytes (MoDC), qui exprimaient des niveaux élevés d'A1 et un3 l'ARNm du récepteur et de faibles niveaux de A2a et un2b ARNm (données non présentées).

Expression du récepteur de l'adénosine des PDC humains. L'ARN messager a été extrait de PDC hautement purifiées (pureté supérieure à 96 %) immédiatement après isolement ou après une nuit de culture en présence d'IL-3 et de CD40L. Profils d'A1, UNE2a, UNE2b, et A3 l'expression du récepteur a été générée par RT-PCR. En plus du produit attendu de 278 pb pour l'A1 récepteur, un deuxième transcrit de 483 pb a été amplifié (flèches), qui contenait le A attendu1 séquence réceptrice avec un insert de 205 pb appartenant à l'intron entre les exons 5 et 6. Une expérience représentative de 6 est montrée.

Expression du récepteur de l'adénosine des PDC humains. L'ARN messager a été extrait de PDC hautement purifiées (pureté supérieure à 96 %) immédiatement après isolement ou après une nuit de culture en présence d'IL-3 et de CD40L. Profils d'A1, UNE2a, UNE2b, et A3 l'expression du récepteur a été générée par RT-PCR. En plus du produit attendu de 278 pb pour l'A1 récepteur, un deuxième transcrit de 483 pb a été amplifié (flèches), qui contenait le A attendu1 séquence réceptrice avec un insert de 205 pb appartenant à l'intron entre les exons 5 et 6. Une expérience représentative de 6 est montrée.

Dans les PDC, la réaction PCR pour le A1 récepteur a amplifié un deuxième transcrit, qui était plus gros que le produit attendu de 278 paires de bases (pb) et qui était également régulé à la baisse lors de la maturation. Le séquençage de l'ADN a révélé que ce produit de 483 pb contenait l'A attendu1 séquence réceptrice avec un insert de 205 pb, correspondant à la région 3' de l'intron située entre les exons 5 et 6 de l'A1 gène. Ces nucléotides ont très probablement été incorporés dans le transcrit en raison d'un autre site d'épissage en amont. Cependant, il est peu probable que le nouveau transcrit code pour un récepteur d'adénosine fonctionnel, car le décalage de cadre provoqué par l'insert génère une protéine qui est tronquée après l'hélice III, affectant le site de liaison à l'adénosine prédit (résidus dans les hélices III et VII) comme ainsi que le site de liaison de la protéine G. 31

Les PDC mobilisent le calcium intracellulaire en réponse à l'adénosine via A1 récepteurs

Le A1 et un3 les récepteurs signalent par l'intermédiaire de la phospholipase C et mobilisent par conséquent le calcium des réserves intracellulaires. Pour évaluer la fonction des récepteurs de l'adénosine dans les PDC, nous avons étudié la signalisation calcique en réponse à l'adénosine et aux agonistes spécifiques des récepteurs de l'adénosine. L'adénosine a induit de fortes transitoires de calcium dans les PDC immatures (figure 2A). Des réponses ont été observées à des concentrations aussi faibles que 0,1 à 1,0 M et étaient maximales à 10 M. Les agonistes spécifiques du sous-type de récepteur ont révélé que la signalisation calcique était médiée par l'A1 récepteur, car les transitoires calciques n'ont été observés qu'en réponse à l'A1 agoniste du récepteur CHA mais pas à DPMA ou IB-MECA, agonistes de A2a et un3 récepteurs, respectivement (Figure 2B). La sensibilité des PDC à l'adénosine a été régulée au cours de la maturation. Dans les PDC ayant mûri avec le CD40L (24 heures), la signalisation du calcium en réponse à l'adénosine était significativement diminuée, en corrélation avec la régulation négative de A1 expression de l'ARNm du récepteur représentée sur la figure 1. Après 48 heures d'activation, les transitoires calciques n'étaient plus induites (figure 2B). Une forte signalisation calcique a été observée en réponse à CCL19 (MIP-3β) mais pas à CXCL12 (SDF-1α) dans les PDC ayant mûri avec CD40L (données non présentées).

Signalisation calcique des PDC en réponse à l'adénosine et aux agonistes spécifiques des récepteurs de l'adénosine. Transitoires calciques dans les PDC cultivés pendant la nuit avec IL-3 (AB) ou IL-3 plus CD40L pendant 48 heures (B) en réponse à l'adénosine ou aux agonistes spécifiques des récepteurs de l'adénosine, CHA, DPMA et IB-MECA (chacun 1 M), a été analysé par cytométrie en flux. Après avoir établi une ligne de base pendant 10 secondes, les réactifs ont été ajoutés aux concentrations indiquées. Les données représentatives de 4 expériences différentes sont présentées.

Signalisation calcique des PDC en réponse à l'adénosine et aux agonistes spécifiques des récepteurs de l'adénosine. Transitoires calciques dans les PDC cultivés pendant la nuit avec IL-3 (AB) ou IL-3 plus CD40L pendant 48 heures (B) en réponse à l'adénosine ou aux agonistes spécifiques des récepteurs de l'adénosine, CHA, DPMA et IB-MECA (chacun 1 M), a été analysé par cytométrie en flux. Après avoir établi une ligne de base pendant 10 secondes, les réactifs ont été ajoutés aux concentrations indiquées. Les données représentatives de 4 expériences différentes sont présentées.

L'adénosine induit la chimiotaxie des PDC immatures

Étant donné que la capacité des PDC à migrer en réponse aux chimiokines inflammatoires est faible, nous nous sommes intéressés à savoir si l'adénosine peut induire la chimiotaxie des PDC, comme cela a été précédemment rapporté pour d'autres leucocytes. 32-34 Dans un test de chimiotaxie Transwell standard, nous avons constaté que les PDC fraîchement isolées migraient vers des gradients d'adénosine d'une manière dépendante de la concentration (figure 3A). La migration vers l'adénosine a été observée à des concentrations physiologiquement pertinentes de 0,1 à 1,0 M, avec une migration maximale entre 1,0 et 10 M (7,5 % à 14,5 % des PDC totaux). La réponse chimiotactique à l'adénosine a augmenté après une période de repos d'une nuit en présence d'IL-3 pour certains donneurs, reflétant probablement des différences individuelles dans le taux de récupération du stress cellulaire induit par la procédure d'isolement (figure 3B). En revanche, la capacité des PDC à migrer vers CXCL12, dont l'amplitude était comparable à celle de l'adénosine, a diminué après une culture d'une nuit. De plus, les PDC cultivés avec IL-3 ont montré une forte réponse migratoire à CCL21 (figure 3C), en corrélation avec la régulation négative de CXCR4 et la régulation positive de l'expression de CCR7, comme évalué par l'analyse FACS (données non présentées). Un schéma de migration distinct a été observé pour les PDC mûries avec CD40L pendant 48 heures. Les PDC ayant mûri avec CD40L ont migré efficacement en réponse à CCL21 (données non présentées) mais plus à l'adénosine (figure 3D).

Migration des PDC vers l'adénosine ou les chimiokines. (A) Courbe dose-réponse pour la migration des PDC fraîchement isolées vers l'adénosine. La moyenne ± SEM de 7 expériences, chacune réalisée en double, est indiquée. (B) Courbe dose-réponse pour la migration des PDC cultivées pendant la nuit en présence d'IL-3 vers l'adénosine. La moyenne ± SEM de 3 expériences, chacune réalisée en double, est indiquée. (C) Réponse migratoire des PDC vers l'adénosine, CXCL12 (SDF-1α) ou CCL21 (6Ckine) après isolement (ex vivo) et après 1 jour de culture avec IL-3. La moyenne ± SEM de 4 à 6 expériences indépendantes, chacune réalisée en double, est indiquée. (D) Les PDC ont été cultivées pendant la nuit en présence d'IL-3 ou pendant 48 heures en présence d'IL-3 et de trimère CD40L avant l'évaluation de leur réponse migratoire à l'adénosine. La moyenne ± SEM des doublons est indiquée.

Migration des PDC vers l'adénosine ou les chimiokines. (A) Courbe dose-réponse pour la migration des PDC fraîchement isolées vers l'adénosine. La moyenne ± SEM de 7 expériences, chacune réalisée en double, est indiquée. (B) Courbe dose-réponse pour la migration des PDC cultivées pendant la nuit en présence d'IL-3 vers l'adénosine. La moyenne ± SEM de 3 expériences, chacune réalisée en double, est indiquée. (C) Réponse migratoire des PDC vers l'adénosine, CXCL12 (SDF-1α) ou CCL21 (6Ckine) après isolement (ex vivo) et après 1 jour de culture avec IL-3. La moyenne ± SEM de 4 à 6 expériences indépendantes, chacune réalisée en double, est indiquée. (D) Les PDC ont été cultivées pendant la nuit en présence d'IL-3 ou pendant 48 heures en présence d'IL-3 et de trimère CD40L avant l'évaluation de leur réponse migratoire à l'adénosine. La moyenne ± SEM des doublons est indiquée.

La migration des PDC vers l'adénosine est médiée par l'A1 récepteur

Régulation à la baisse de A1 récepteurs combinés à une perte de la fonction migratoire dans les PDC ayant mûri avec le CD40L nous ont amenés à supposer qu'A1 les récepteurs médient la chimiotaxie à l'adénosine. Pour tester cette hypothèse, l'influence d'agonistes et d'antagonistes sélectifs des récepteurs de l'adénosine sur la migration des PDC a été étudiée. Comme prévu, l'A1 agoniste du récepteur, CHA (1 M), chimiotaxie fortement induite des PDC, alors que l'A2a et un3 les agonistes des récepteurs DPMA et IB-MECA étaient tous deux inefficaces (figure 4A). À cet égard, aucune différence n'a été observée entre les PDC fraîchement isolées et cultivées en IL-3 (données non présentées). De plus, l'A1 l'antagoniste des récepteurs DPCPX a aboli la migration des PDC vers l'adénosine. CSC et MRS 1220, antagonistes de A2a et un3 récepteurs, étaient inefficaces (figure 4B).

La chimiotaxie des PDC en réponse à l'adénosine est médiée par l'A1 récepteur. (A) Migration des PDC cultivés pendant la nuit en présence d'IL-3 en réponse à 1 M de l'A1, UNE2a ou un3 les agonistes des récepteurs CHA, DPMA ou IB-MECA, respectivement. (B) Migration des PDC vers 100 M d'adénosine en l'absence ou en présence de 10 M de l'A1,UNE2a, ouA3 antagonistes des récepteurs DPCPX, CSC ou MRS 1220, respectivement. Les données représentent la moyenne ± SEM de 3 à 4 expériences différentes. *P < 0.05.

La chimiotaxie des PDC en réponse à l'adénosine est médiée par l'A1 récepteur. (A) Migration des PDC cultivés pendant la nuit en présence d'IL-3 en réponse à 1 M de l'A1, UNE2a ou un3 les agonistes des récepteurs CHA, DPMA ou IB-MECA, respectivement. (B) Migration des PDC vers 100 M d'adénosine en l'absence ou en présence de 10 M de l'A1,UNE2a, ouA3 antagonistes des récepteurs DPCPX, CSC ou MRS 1220, respectivement. Les données représentent la moyenne ± SEM de 3 à 4 expériences différentes. *P < 0.05.

L'adénosine améliore l'AMPc cytosolique et inhibe la production de cytokines dans les PDC matures

UNE2a les récepteurs sont couplés positivement à l'adénylate cyclase et stimulent la formation du second messager AMPc. Pour évaluer la fonction de A2a récepteurs dans les PDC, nous avons analysé les niveaux d'AMPc cytosolique en réponse à l'adénosine dans des PDC fraîchement isolées et après activation avec CD40L. Pour améliorer la sensibilité du dosage de l'AMPc sur un faible nombre de cellules, les PDC ont été incubées avec du rolipram, un inhibiteur de l'enzyme dégradant l'AMPc phosphodiestérase (PDE) de type IV. Par rapport aux PDC immatures, l'adénosine a significativement amélioré les niveaux d'AMPc dans les PDC activés par CD40L (augmentation de 4,4 fois ± 1,4 fois contre 1,8 fois ± 0,5 fois, n = 4, P = .01) (Figure 5). Ces résultats sont cohérents avec la fonction A2a expression du récepteur dans les PDC matures.

L'adénosine augmente les niveaux d'AMPc cytosolique dans les PDC matures. Des PDC fraîchement isolées ou des PDC activées par le trimère CD40L (24 heures) ont été incubées avec 100 M d'adénosine en présence de rolipram. Après 30 minutes, les taux d'AMPc ont été mesurés dans les lysats cellulaires par dosage immunoenzymatique (EIA). Les données sont exprimées sous forme d'augmentation n fois supérieure des niveaux d'AMPc et représentent la moyenne ± SEM de 4 donneurs différents. *P < 0.05.

L'adénosine augmente les niveaux d'AMPc cytosolique dans les PDC matures. Des PDC fraîchement isolées ou des PDC activées par le trimère CD40L (24 heures) ont été incubées avec 100 M d'adénosine en présence de rolipram. Après 30 minutes, les taux d'AMPc ont été mesurés dans les lysats cellulaires par dosage immunoenzymatique (EIA). Les données sont exprimées sous forme d'augmentation n fois supérieure des niveaux d'AMPc et représentent la moyenne ± SEM de 4 donneurs différents. *P < 0.05.

Parce qu'un2a la signalisation des récepteurs a déjà été liée à des propriétés anti-inflammatoires, nous avons étudié si l'adénosine a un impact sur la production de cytokines des PDC en réponse à CpG ODN. Le protocole de stimulation utilisé dans notre étude a été précédemment rapporté par Krug et al. Les PDC ont été activés avec ODN 2006 en combinaison avec des cellules BKH transfectées par CD40L, un protocole de stimulation induisant l'IFN-α, l'IL-6, ainsi que l'IL-12, qui est maximal après une période de préculture de 60 heures avec l'IL-3. 13 PDC stimulés avec CpG ODN 2006 et CD40L ont produit de grandes quantités d'IFN-α et d'IL-6. L'adénosine (jusqu'à 100 uM) n'a eu aucune influence significative sur la production d'IFN-α (figure 6A) ou d'IL-6 (figure 6B) par les PDC immatures. Pour étudier l'effet de l'adénosine sur la production de cytokines par les cellules matures, les PDC ont été cultivées pendant 60 heures avec de l'IL-3, ce qui a entraîné une régulation négative de A1 et régulation à la hausse de A2a récepteurs (données non présentées). Dans les PDC matures, l'adénosine a inhibé de manière significative la production d'IFN-α et d'IL-6 en réponse à CpG et CD40L (Figure 6A-B). De plus, la culture avec IL-3 a induit dans les PDC la production de grandes quantités d'IL-12 en réponse à CpG ODN 2006 et CD40L, comme précédemment rapporté par Krug et al. 13 L'adénosine a également supprimé de manière significative la production d'IL-12p40 et d'IL-12p70 dans ces conditions (Figure 6C-D), soulignant le rôle potentiel de l'adénosine dans la modulation de la production de cytokines par les PDC matures. Aucun effet de l'adénosine sur la viabilité des PDC n'a été observé pour des concentrations allant jusqu'à 250 M, ce qui exclut les effets toxiques potentiels de l'adénosine. De plus, l'adénosine n'a pas induit la maturation des PDC, tel qu'évalué par la régulation à la hausse de l'expression de surface du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) classe I et du CMH de classe II ainsi que des molécules de costimulation CD80 et CD86 (Figure 7).

L'adénosine régule la production de cytokines des PDC matures. Les PDC (2,5 × 10 5 cellules par millilitre) ont été activées avec des cellules BHK transfectées CpG ODN 2006 et CD40L en présence ou en absence de 100 µM d'adénosine, soit directement ex vivo, soit après culture avec IL-3 pendant 60 heures. Les surnageants ont été récoltés après 48 heures et les concentrations d'IFN-α (A), d'IL-6 (B), d'IL-12p40 (C) et d'IL-12p70 (D) ont été mesurées par ELISA. Les données représentent la moyenne ± SEM de 3 donneurs différents. *P < 0.05.

L'adénosine régule la production de cytokines des PDC matures. Les PDC (2,5 × 10 5 cellules par millilitre) ont été activées avec des cellules BHK transfectées CpG ODN 2006 et CD40L en présence ou en absence de 100 µM d'adénosine, soit directement ex vivo, soit après culture avec IL-3 pendant 60 heures. Les surnageants ont été récoltés après 48 heures et les concentrations d'IFN-α (A), d'IL-6 (B), d'IL-12p40 (C) et d'IL-12p70 (D) ont été mesurées par ELISA. Les données représentent la moyenne ± SEM de 3 donneurs différents. *P < 0.05.

Expression des marqueurs de surface des PDC en réponse à l'adénosine. Les PDC ont été cultivées avec de l'IL-3 pendant 48 heures en l'absence ou en présence de 100 µM d'adénosine. L'expression de surface de HLA-ABC, HLA-DR, CD80 et CD86 a été évaluée par cytométrie en flux. Une expérience représentative de 3 est montrée.

Expression des marqueurs de surface des PDC en réponse à l'adénosine. Les PDC ont été cultivées avec de l'IL-3 pendant 48 heures en l'absence ou en présence de 100 µM d'adénosine. L'expression de surface de HLA-ABC, HLA-DR, CD80 et CD86 a été évaluée par cytométrie en flux. Une expérience représentative de 3 est montrée.


Migration de contrôleur de domaine

La migration des DC à partir de la peau est l'une des premières étapes de la phase d'initiation d'une réponse immunitaire (Fig. 2). Le contact cutané avec des antigènes est connu pour stimuler diverses cytokines épidermiques, par ex. IL-6, TNF-α, GM-CSF et CXCL2/CXCL3 (protéine inflammatoire macrophage-2, MIP-2) 19 , parmi lesquels IL-1β et TNF-α sont essentiels à la migration des DC 20, 21 .

Migration des cellules dendritiques. Le contact cutané avec un haptène déclenche la migration des cellules dendritiques à travers les vaisseaux lymphatiques afférents vers les ganglions lymphatiques drainant la peau. La production de cytokines – en particulier TNF-α, IL-1α et IL-1β – facilite la migration des cellules de Langerhans (LC) hors de l'épiderme. À un stade ultérieur, l'interaction CCR7-CCL21 joue un rôle central dans la migration de la LC dans les zones des lymphocytes T des ganglions lymphatiques. DC, IL des cellules dentritiques, interleukine MMP, métalloprotéinases matricielles TNF-α, facteur de nécrose tumorale-α.

Démêlage de la peau DC

La signalisation des cytokines entraîne une altération de l'expression des molécules d'adhésion, ce qui facilite la migration des DC hors de l'épiderme. La mobilisation des DC est associée à la perte de CD324 (E-cadhérine), causée par la production de TNF-α, IL-1β ou IL-1α 21, 22 . En bref, il est proposé que l'IL-1β dérivée de LC remplisse deux fonctions. Premièrement, l'IL-1β dérivée des DC active les DC dans une boucle autocrine via le récepteur 1 de l'IL-1 (IL-1RI). Deuxièmement, l'IL-1β stimule également les kératinocytes épidermiques (KC) pour sécréter le TNF-α, qui agit de manière paracrine pour faciliter la migration des DC à travers le TNF-RII23. Si la disponibilité de l'une ou l'autre de ces cytokines est compromise, alors la migration allergène-LC et la mobilisation des DC dans les ganglions lymphatiques drainants et le développement d'une sensibilisation de contact sont partiellement inhibés 24, 25.

Simultanément, la production d'enzymes de dégradation de la membrane basale épidermique, telles que les métalloprotéinases matricielles (MMP), est régulée à la hausse dans la LC 26 activée. Les MMP-2, MMP-3 et MMP-9 ont été décrites pour faciliter le passage de la LC à travers la membrane basale. Par la suite, les MMP sont également essentielles pour la migration de la LC et de la DDC à travers la matrice tissulaire dermique, par clivage du collagène de type IV 27 . L'activité de MMP-2 et MMP-9 est sous le contrôle d'inhibiteurs de protéinases naturels tels que la métalloprotéinase inhibitrice des tissus (TIMP)-1 et TIMP-2, respectivement. Plusieurs études ont démontré que les inhibiteurs des MMP empêchaient l'émigration de la CL de l'épiderme et l'accumulation de DC vers le ganglion lymphatique afférent en réponse à l'application épicutanée de sensibilisants, tels que le nickel, l'oxazolone (OXA) et le dinitrochlorobenzène (DNCB) 27- 29 . Ces résultats suggèrent que le développement d'une hypersensibilité de contact pourrait être prévenu par l'inhibition de l'activité MMP. Cependant, le développement de l'hypersensibilité de contact n'a pas été altéré chez les souris déficientes en MMP-9, bien que la migration des LC ait été considérablement inhibée chez ces souris déficientes en gènes 27 . Apparemment, les quelques DDC et LC qui migrent encore en l'absence de MMP-9 induisent avec succès une hypersensibilité de contact. De plus, l'hypersensibilité de contact pourrait être induite par la libre diffusion de l'allergène de contact dans les ganglions lymphatiques afférents où il peut être présenté par les CD locales 30 .

Pendant ce temps, l'expression différentielle des molécules d'adhésion est induite pour médier les interactions avec la matrice extracellulaire, les cellules épidermiques et dermiques. Parmi les événements les plus importants se trouve l'expression réduite de CD324, qui permet à LC de se dissocier des KC 31 environnants. Des rôles supplémentaires sont pensés pour le CD54 (molécule d'adhésion intracellulaire, ICAM-1) et l'antigène-1 associé à la fonction lymphocytaire, car le blocage de ces molécules d'adhésion a inhibé la migration des DC épidermiques vers les ganglions lymphatiques régionaux. L'expression régulée à la hausse de l'6-intégrine et de l'β1-intégrine comprend l'antigène 6 très tardif qui confère à la LC une activité de liaison à la laminine et ainsi la capacité d'interagir avec la membrane basale. Une autre molécule d'adhésion, la molécule d'adhésion jonctionnelle 1 (JAM-1), est exprimée par les DC et affecte donc la migration des DC 32, 33 . L'absence de JAM-1 facilite le trafic des DC vers les ganglions lymphatiques 34 . Combinés, ces événements entraînent un démêlage des LC des KC environnants, permettant ainsi la migration des LC.

Chimiokines et récepteurs de chimiokines

La migration des CL est également associée à l'expression de récepteurs de chimiokines à la surface des cellules. Les iDC expriment les récepteurs des chimiokines, et ceux-ci peuvent les guider vers les sites inflammatoires où l'échantillonnage d'antigène se produit. Lors de l'échantillonnage de l'antigène, les CD se différencient rapidement en un phénotype mature. Ce processus de maturation est associé à un changement de profil des récepteurs des chimiokines. Les récepteurs cutanés des chimiokines sont régulés à la baisse (CCR1, CCR2, CCR5 et CCR6), tandis que les récepteurs impliqués dans le homing vers le ganglion lymphatique local sont régulés à la hausse (CCR4, CXCR4 et CCR7) 35 . Il est important de noter que la mobilisation des DC de la périphérie vers les ganglions lymphatiques afférents est régulée par le récepteur de chimiokine « garde-porte » CCR7 9, 36. Les veinules lymphatiques et hautes endothéliales produisent CCL21, un ligand majeur de CCR7 37, 38 . Les DC résidant dans les zones paracorticales des ganglions lymphatiques produisent CCL19, un deuxième ligand de CCR7. À côté de la LC porteuse d'antigène, les cellules T naïves expriment également CCR7. Cela orchestre la rencontre des DC et des cellules T naïves dans les zones ganglionnaires paracorticales.

Les médiateurs lipidiques, les cystéinyl leucotriènes (cysLT) et la prostaglandine E2 (PGE2), tous produits au niveau des sites d'inflammation, sont également nécessaires à la migration des CL 39, 40 . Ces médiateurs lipidiques favorisent, par régulation positive de CCR7, une chimiotaxie optimale des DC vers la chimiokine CCL19 mais pas vers CCL21. De plus, le transporteur cysLT multidrug resistance protein-1 et le transporteur lipidique p-les glycoprotéines (multi-drug resistance, MDR-1) sont également exprimées par les DC et sont nécessaires à leur entrée dans les lymphatiques afférents 41, 42 .

Régulation négative de la migration DC

Chez la souris, quelle que soit la nature du stimulus (par exemple, contact cutané avec des allergènes, des agents pathogènes ou un traumatisme), seulement jusqu'à 30% des LC épidermiques quittent le tissu 43, 44. Peut-être que ces LC résidentielles ont pour fonction de protéger la peau des expositions ultérieures. La rétention des LC pourrait être causée par l'apparition rapide de la production de régulateurs négatifs de la migration des LC tels que l'IL-4, l'IL-10 et le TGF-β d'origine épidermique.1. La première cytokine inhibe la migration de la LC humaine par régulation négative de l'expression du TNF-RII 44 . Ces deux dernières cytokines induisent l'expression de CCR6, facilitant également la rétention de LC dans l'épiderme 8 . Au cours de l'inflammation cutanée, l'IL-10 fournit un contrepoids homéostatique pour l'IL-1β et le TNF-α 19 . TGF-β1 inhibe la migration des DC par l'inhibition de l'expression de CCR7 et la régulation à la hausse de l'expression de CD324 45 .

Différences dans la migration LC et DDC

Chez la souris, la LC et la DDC présentent des capacités migratoires différentes lors d'une exposition épicutanée à des sensibilisateurs antigéniques. Des études sur des souris ont montré que lors de l'exposition de la peau au colorant fluorescent tétraméthyl rhodamine iso-thiocyanate, la migration DDC a clairement précédé la migration LC 46 . Cela pourrait être dû au fait que le LC met plus de temps à atteindre les ganglions lymphatiques afférents, car ils doivent d'abord se détacher des KC voisins. Fait intéressant, dans la zone des cellules T, les DDC sont situés dans le paracortex externe juste en dessous des follicules des cellules B, tandis que les LC sont situés dans le paracortex interne riche en cellules T 46 . Ces résultats suggèrent que les DDC sont impliquées dans l'amorçage des cellules B, tandis que les LC sont impliquées dans l'activation des cellules T. La capacité de migration différentielle et la destination des ganglions lymphatiques entre la LC et la DDC pourraient résulter d'une expression distincte du récepteur médiateur des chimiokines ou des lipides sur la LC et la DDC 47 . Récemment, il a été suggéré que l'expression de CCR7 joue un rôle important dans cette controverse. In vitro Les DDC générés acquièrent une faible expression de CCR7, tandis que les LC acquièrent un niveau élevé d'expression de CCR7 48 . Cette découverte pourrait expliquer la migration de la LC, et non de la DDC, vers les zones de lymphocytes T dans le ganglion lymphatique.


Remerciements

Les auteurs souhaitent remercier le Dr Ann Word pour les discussions utiles et la lecture critique du manuscrit. Les auteurs remercient le Dr Borna Mehrad pour avoir fourni l'anticorps RB6-8C5 et pour les discussions utiles au cours de ce travail. Nous remercions le Dr Judith Head pour avoir fourni des conseils techniques pour l'immunohistochimie et pour la lecture critique du manuscrit. Nous remercions également le Dr David Russell pour la lecture critique du manuscrit. L'excellente assistance technique de John Shelton et Kelly Straach est grandement appréciée.


5 Conclusion et perspectives

Cette revue a mis en évidence quelques exemples récents de complexes de métaux de transition qui ont été étudiés pour leur activité anti-inflammatoire ou anti-auto-immune. Une stratégie commune qui a été utilisée est la coordination de composés anti-inflammatoires ou d'autres molécules bioactives aux ions métalliques, ce qui entraîne une activité accrue. Par exemple, les activités anti-inflammatoires des complexes métalliques 32–35 d'un dérivé 1,2-dihydroquinazolinone étaient supérieures à celles du ligand libre. 46 Cela a été attribué à la lipophilie plus élevée des complexes métalliques par rapport au ligand libre, améliorant potentiellement la capacité des complexes à traverser les membranes cellulaires et dans les cellules. Dans le cas des AINS acéclofénac 9, la complexation avec le zinc a généré un complexe zinc-acéclofénac qui a induit moins d'ulcères d'estomac chez le rat, tout en ayant une activité anti-inflammatoire comparable à celle du médicament parent. 29 Les auteurs ont postulé que le groupe carboxyle ulcérogène de l'acéclofénac pourrait être efficacement masqué par sa coordination avec le zinc, entraînant des effets secondaires indésirables moins graves dans l'estomac.

La seconde stratégie utilise des complexes métalliques avec des ligands labiles qui peuvent se coordonner directement avec des biomolécules. Trávníček et ses collaborateurs ont démontré que les complexes d'or( I ) 41 porteurs de ligands substitués 6-benzylaminopurine et triphénylphosphine ont montré une activité anti-inflammatoire plus forte in vitro et in vivo vis-à-vis de l'auranofine à des doses équitoxiques. 63 Il est intéressant de noter que les analogues contenant un groupe 2-chloro sur la fraction adénine étaient inactifs in vivo , ce qui indique que des changements mineurs dans la structure de ces complexes d'or ( I ) peuvent avoir un effet significatif sur leurs propriétés anti-inflammatoires. 65 La troisième approche décrite dans cette revue implique des complexes métalliques cinétiquement inertes qui ciblent des biomolécules spécifiques de manière non covalente. Par exemple, le complexe Ir(III) cyclométallé [Ir(ppy)2(biq)]PF6 développé par Leung, Ma et ses collègues a représenté le premier inhibiteur à base de métal du TNF-α 48. 77 Alternativement, la porphyrine de Mn, la polyamine cyclique et les dérivés de salen sont capables de catalyser des réactions redox qui éliminent les espèces réactives et suppriment le stress oxydatif et l'inflammation.

Un aspect important qui doit être considéré de manière critique dans la conception et le développement de complexes métalliques en tant qu'agents anti-inflammatoires est leur toxicité. Les effets secondaires indésirables notables des médicaments à base d'or comprennent des ulcères buccaux, une altération du goût, des éruptions cutanées, une pigmentation de la peau, une anémie (thrombocytopénie) ou une toxicité rénale (protéinurie, néphropathie). De plus, des effets toxiques sur le cerveau ont également été rapportés. D'autre part, les composés du platine ont été liés à la néphrotoxicité, la neurotoxicité, la cardiotoxicité et la myélosuppression, 115 et leur utilisation dans le corps peut également conduire au développement de la chimiorésistance via de multiples mécanismes. 116 Comme l'utilisation de complexes métalliques en tant qu'agents anti-inflammatoires est encore un sujet relativement nouveau et émergent, des études approfondies sur la toxicité des composés décrits dans cette revue ont été rarement réalisées. Néanmoins, comme la toxicité représente souvent l'une des limites les plus courantes à l'utilisation des complexes métalliques en médecine, l'évaluation de la toxicité est une étape essentielle nécessaire pour déterminer l'application pharmacologique potentielle de ces complexes métalliques en tant qu'agents anti-inflammatoires.

Pour l'avenir, nous pensons qu'une élucidation plus poussée du mécanisme d'action précis de l'activité anti-inflammatoire des complexes métalliques bioactifs est nécessaire afin de faciliter la conception rationnelle d'analogues de complexes métalliques qui pourraient afficher une puissance ou une sélectivité améliorée, tout en minimisant la toxicité. En particulier, les transformations ou réactions chimiques potentielles des complexes métalliques in vivo devraient être mieux caractérisées. De plus, nous pensons que l'application de complexes métalliques cinétiquement inertes pour cibler spécifiquement les biomolécules dans les cellules mérite une enquête plus approfondie. Les membres des voies inflammatoires ou immunitaires cellulaires interagissent les uns avec les autres via des interfaces protéine-protéine qui sont généralement grandes et amorphes. De telles interactions protéine-protéine pourraient être potentiellement ciblées par des complexes métalliques cinétiquement inertes qui possèdent des ligands de forme et d'hydrophobie appropriés pour se lier à l'interface protéine-protéine. Enfin, les progrès de la biologie moléculaire et de l'interactomique pourraient présenter de nouvelles cibles pour le développement de nouveaux complexes métalliques anti-inflammatoires ou anti-auto-immuns. Compte tenu de la diversité des études prometteuses mises en évidence dans cette revue, nous pensons que ce n'est qu'une question de temps avant que les prochains complexes de métaux de transition ne soient approuvés en clinique pour le traitement des maladies inflammatoires ou auto-immunes.


Partie 2: Un rôle pour la protéine Drebrin réorganisant l'actine dans la fonction des mastocytes

00:00:08.02 Bonjour.
00:00:09.12 Je suis Avery August,
00:00:10.24 Je suis à l'Université Cornell,
00:00:12.02 et dans la deuxième partie de cette conférence
00:00:13.27 Je vais vous parler un peu
00:00:15.19 certaines de nos études de recherche
00:00:16.27 essayer de comprendre la base moléculaire
00:00:18.23 pour la réponse allergique dans les mastocytes.
00:00:23.04 Alors, voici un résumé
00:00:25.10 de la façon dont la réponse allergique se produit.
00:00:29.02 Vous avez un allergène,
00:00:30.02 il génère une réponse IgE,
00:00:32.16 que les IgE recouvrent ensuite les mastocytes et les basophiles
00:00:36.20 pour que la deuxième fois que vous soyez exposé à un allergène,
00:00:39.01 les mastocytes se dégranulent
00:00:41.11 et vous obtenez ces symptômes
00:00:43.18 d'une réponse allergique.
00:00:45.29 Donc, nous sommes très intéressés à essayer de comprendre
00:00:48.13 la base moléculaire de cette réponse de dégranulation,
00:00:50.21 parce que nous aimerions comprendre
00:00:52.26 comment mieux cibler ce processus
00:00:55.10 pour empêcher à la fois la dégranulation
00:00:57.27 et le développement de ces symptômes.
00:01:00.29 Donc, comme je vous l'ai dit dans la première partie de mon discours,
00:01:04.24 bloquant les mastocytes
00:01:06.20 et blocage de la dégranulation des mastocytes
00:01:08.08 peut réduire la libération des composants,
00:01:10.28 et en réduisant la libération de ces composants,
00:01:12.25 nous réduisons en fait les symptômes.
00:01:14.28 Mais quelle est la base moléculaire pour cela ?
00:01:17.10 Comme je vous l'ai dit, le médicament Chromolyn
00:01:19.26 est capable de le faire,
00:01:21.10 mais nous ne comprenons pas très bien comment fonctionne Chromolyn,
00:01:23.26 et aussi Chromolyn a des effets secondaires.
00:01:26.22 Donc, ce que nous savons, c'est que
00:01:29.13 le mastocyte a un récepteur pour IgE,
00:01:32.00 et que les récepteurs des IgE
00:01:34.00 est en fait très similaire aux récepteurs
00:01:36.14 que l'on trouve sur les cellules T, comme le récepteur des cellules T,
00:01:38.22 ou sur les cellules B, le récepteur des cellules B.
00:01:40.25 Et tous ces récepteurs,
00:01:42.13 ce qu'ils ont en commun,
00:01:44.03 sont des queues cytoplasmiques
00:01:45.23 qui ont ce qu'on appelle des motifs ITAM,
00:01:47.11 et ces motifs ITAM
00:01:49.10 interagir avec des familles de kinases
00:01:52.10 qui conduisent à une voie de signalisation intracellulaire
00:01:54.08 qui conduit finalement à la dégranulation
00:01:56.12 et libération d'histamine,
00:01:58.03 comme je l'ai expliqué dans la première partie,
00:01:59.24 ainsi que la production de cytokines.
00:02:01.25 Et donc ce qui nous intéresse le plus, c'est
00:02:05.14 essayant de comprendre comment ces voies
00:02:07.14 conduisent en fait à ces différents effets.
00:02:10.01 Donc, ce que nous savons, c'est que
00:02:13.00 le récepteur FC pour IgE
00:02:14.16 déclenche une augmentation du calcium intracellulaire,
00:02:16.14 et cette augmentation du calcium intracellulaire
00:02:18.10 est très important
00:02:20.09 pour la dégranulation et la production de cytokines,
00:02:23.08 et l'un des composés
00:02:26.02 qui a été découvert qui peut en fait
00:02:28.24 inhiber cette libération de calcium est
00:02:30.27 une molécule qui a été signalée pour la première fois par d'autres laboratoires Abbott
00:02:33.02 comme immunosuppresseur.
00:02:34.27 Et cette molécule, que j'appellerai BTP en abrégé,
00:02:38.12 est en fait très intéressant,
00:02:40.27 parce qu'il peut réellement inhiber
00:02:42.27 signalisation du calcium dans les cellules.
00:02:45.14 Et donc nous étions très intéressés à essayer de comprendre
00:02:47.27 si ce composé particulier
00:02:50.05 inhiberait également la réponse des mastocytes in vivo.
00:02:53.13 Donc, pour ce faire, ce que nous avons fait
00:02:56.20 est nous avons pris des souris et nous leur avons injecté des IgE
00:03:00.25 qui était spécifique à une molécule
00:03:03.19 appelé DNP-BSA.
00:03:06.07 Et quand nous avons injecté ces IgE,
00:03:08.17 que les IgE vont maintenant circuler dans la souris,
00:03:11.04 recouvrira les mastocytes et les basophiles,
00:03:13.27 et maintenant quand on injecte la souris
00:03:16.06 avec l'allergène,
00:03:19.00 dans les trois minutes,
00:03:20.13 nous pouvons déterminer si les mastocytes vont libérer de l'histamine,
00:03:23.16 que nous pouvons ensuite analyser.
00:03:25.07 Nous avons également déterminé si BTP
00:03:27.04 bloquerait cet effet.
00:03:29.00 Et donc ce que nous avons trouvé c'est que
00:03:31.22 lorsque nous avons injecté du BTP à des souris
00:03:33.26 une heure avant de leur donner l'allergène,
00:03:35.28 nous pourrions obtenir une libération réduite d'histamine,
00:03:38.24 indiquant que BTP bloque réellement
00:03:41.12 la libération d'histamine de ces mastocytes.
00:03:43.27 L'autre chose que nous voulions faire
00:03:45.21 est de déterminer si cet effet mastocyte
00:03:48.23 entraînerait des différences de température.
00:03:52.04 Une des choses qui arrive
00:03:54.02 lorsque vous exposez des souris aux IgE et à l'allergène
00:03:57.22 est qu'ils perdent en fait la température corporelle,
00:04:00.04 et nous pouvons mesurer cette température corporelle
00:04:01.28 en mesurant la température dans le temps
00:04:04.16 en présence ou en l'absence du BTP.
00:04:08.10 Et donc dans cette expérience ce que nous avons fait.
00:04:10.26 nous avons injecté des IgE aux souris et,
00:04:14.16 une heure avant d'avoir l'allergène,
00:04:16.16 nous avons donné le BTP
00:04:18.02 et ensuite nous avons mesuré la quantité de.
00:04:20.04 les changements de température qui se sont produits.
00:04:22.12 Ce que vous pouvez voir ici
00:04:24.12 est une différence de température corporelle chez ces souris,
00:04:26.25 et vous pouvez voir que les souris qui ont reçu le véhicule
00:04:29.02 a en fait perdu la température corporelle,
00:04:31.13 alors que les souris qui ont reçu du BTP
00:04:33.20 n'a pas perdu la température corporelle.
00:04:35.16 Et donc ce que cette expérience nous a indiqué
00:04:38.04 était que BTP était capable d'inhiber
00:04:40.04 à la fois la libération d'histamine dans les mastocytes,
00:04:41.23 mais aussi les effets de la dégranulation des mastocytes,
00:04:44.10 c'est-à-dire la perte de température.
00:04:47.01 Alors, BTP, alors,
00:04:49.05 peut inhiber la dégranulation des mastocytes
00:04:51.29 et peut inhiber la libération
00:04:54.11 du contenu des granules de mastocytes,
00:04:57.17 donc nous voulions savoir si BTP
00:04:59.26 pourrait affecter directement les mastocytes.
00:05:01.13 Et donc, heureusement, nous pouvons générer des mastocytes très simplement
00:05:03.28 en prélevant de la moelle osseuse de souris,
00:05:05.24 en les cultivant en présence de cytokines,
00:05:08.00 interleukine-3,
00:05:09.18 et le facteur de cellules souches,
00:05:11.06 et 4-6 semaines plus tard
00:05:12.20 nous avons une population composée en grande partie de mastocytes,
00:05:14.18 presque 100 % de mastocytes.
00:05:16.10 Nous pouvons alors prendre ces mastocytes et les analyser.
00:05:19.00 Et la façon dont nous l'avons fait est
00:05:21.00 nous avons pris les mastocytes,
00:05:22.16 nous les avons incubés avec des IgE pendant la nuit,
00:05:24.20 en les armant,
00:05:26.12 et ensuite nous pouvons ajouter l'antigène,
00:05:28.04 et avec le temps, nous pourrons analyser ces mastocytes.
00:05:30.23 Et nous l'avons fait,
00:05:32.12 et ce que nous avons trouvé, c'est que
00:05:34.21 dans des mastocytes qui viennent d'être traités avec un véhicule
00:05:36.26 nous avons une belle dégranulation,
00:05:39.13 tandis que les mastocytes qui étaient
00:05:41.11 uniquement traité avec BTP
00:05:43.07 et déclenché avec IgE.
00:05:45.04 nous n'avons plus de dégranulation,
00:05:46.27 indiquant que BTP
00:05:49.01 inhibe en fait la dégranulation des mastocytes,
00:05:52.00 les empêchant de publier leur contenu,
00:05:54.09 y compris l'histamine, l'héparine et le TNF.
00:05:57.27 Donc, la prochaine chose que nous voulions savoir est
00:06:00.03 quelle est la cible de BTP.
00:06:01.29 Et nous avons donc collaboré avec quelques chimistes,
00:06:06.16 Blake Peterson et son élève Laurie Mottram,
00:06:09.20 et ils ont synthétisé pour nous
00:06:11.26 le BTP couplé à un lieur et à la biotine.
00:06:15.13 Et ce que nous pourrions alors faire
00: 06: 17.12 est de prendre cette liaison BTP-biotine
00:06:19.18 et couplez-le à une perle
00:06:21.13 et déterminer, à l'aide de techniques biochimiques standard,
00:06:24.18 quelles protéines interagiraient réellement
00:06:26.28 avec la fraction BTP.
00:06:29.00 Et donc cette expérience est montrée ici.
00:06:31.09 Vous pouvez voir que nous prendrions le contrôle des perles
00:06:34.16 et enduisez-les uniquement du linker et de la biotine,
00:06:37.18 ou des perles qui ont le BTP.
00:06:41.05 Nous passerions un extrait de protéine sur ces billes,
00:06:44.09 nous lavions toutes les matières étrangères,
00:06:47.00 et ensuite nous analysions les protéines
00:06:50.03 qui a en fait spécifiquement interagi avec les perles
00:06:52.06 sur les gels SDS-PAGE
00:06:54.04 par spectrométrie de masse
00:06:56.06 pour identifier les protéines associées au BTP.
00:06:58.19 Et nous avons donc fait cette expérience
00:07:00.09 en utilisant des lysats de cellules,
00:07:03.05 et ce que nous avons trouvé, c'est que
00:07:05.15 une protéine importante qui a été purifiée
00:07:07.09 sur ces billes BTP
00:07:08.22 était une protéine appelée drebrine.
00:07:10.12 Et donc drebrin est en fait
00:07:12.24 une protéine de liaison à l'actine,
00:07:14.12 et il peut en fait interagir avec l'actine
00:07:16.25 et conduit à la polymérisation de l'actine
00:07:20.04 quand vous le mettez dans des cellules.
00:07:22.24 Nous avons également constaté que
00:07:25.03 quand tu mutes deux résidus
00:07:27.14 dans le domaine de liaison à l'actine de la drebrine,
00:07:29.28 nous pourrions abolir la liaison du BTP à la drebrin,
00:07:32.26 indiquant que BTP a interagi
00:07:35.02 directement avec drebrin
00:07:36.21 et pas de manière indirecte.
00:07:38.08 Et ces résidus sont indiqués ici en rouge.
00:07:39.24 Si nous mutons la lysine 270 et la lysine 271
00:07:42.17 aux méthionines,
00:07:44.11 nous abolissons complètement la liaison du BTP à la drebrin,
00:07:47.04 alors que si nous mutions l'arginine en méthionine,
00:07:50.17 ou glutamine en leucine,
00:07:52.23 nous avons maintenu l'interaction,
00:07:54.25 indiquant que cette interaction est spécifique.
00:07:57.18 Ainsi, nous pourrions montrer, alors,
00: 07: 59.18 que BTP interagit avec cette protéine de liaison à l'actine, la drebrine,
00:08:03.07 et la drebrine est une protéine régulatrice de l'actine.
00:08:06.05 Cela a donc introduit un tout nouveau domaine
00:08:10.03 que nous pourrions explorer
00:08:11.27 pour essayer de déterminer
00:08:13.18 quelle était la base moléculaire de cette réponse du récepteur Fc.
00:08:17.24 Encore une fois, voici le chemin que je vous ai montré,
00:08:19.20 et ce que nous vous avons montré c'est que
00:08:22.04 calcium, représenté en rouge,
00:08:24.02 est en fait inhibé par BTP.
00:08:25.11 Je viens aussi de te montrer ce drebrin
00:08:27.16 a été identifiée comme une protéine interagissant avec BTP.
00:08:31.22 Et donc la question était,
00:08:33.14 où se situe la drebrin dans cette voie
00:08:36.25 qui est déclenché par le récepteur FC ?
00:08:39.13 Et donc nous avons fait quelques expériences
00:08:40.28 pour essayer de déterminer
00:08:42.28 si drebrin serait capable
00:08:45.05 pour affecter l'activation de
00:08:47.12 un certain nombre de ces différentes voies.
00:08:48.25 Donc, pour ce faire,
00: 08: 50.10, nous avons en fait généré des souris knock-out drebrin,
00:08:52.06 et nous l'avons fait en nous procurant les cellules souches embryonnaires,
00:08:54.24 qui avait une cassette
00:08:57.26 qui était piégé dans le gène de la drebrine,
00:09:00.06 qui a abouti aux cellules
00:09:02.25 ne pas être capable de fabriquer la protéine.
00:09:05.04 Nous avons généré des souris à partir de ces cellules souches embryonnaires
00:09:07.16 et ensuite nous avons examiné le cerveau de ces souris,
00:09:09.23 qui exprimait également drebrin,
00:09:11.21 pour l'expression de drebrin.
00:09:12.24 Et vous pouvez voir, ici,
00:09:14.12 dans cette tache occidentale
00:09:16.17 que les cerveaux de type sauvage
00:09:18.12 exprimé drebrin pleine longueur,
00: 09: 19.26 tandis que le cerveau des souris déficientes en drebrine
00:09:22.06 n'avait pas de drebrin du tout.
00:09:24.16 Nous avons ensuite continué à caractériser ces souris
00:09:27.24 pour déterminer si leurs mastocytes
00:09:29.24 étaient fonctionnels.
00:09:31.03 Et ce que vous pouvez voir ici
00:09:33.12 est la peau du type sauvage de souris déficientes en drebrine,
00:09:37.14 coloré au bleu de Toluidine,
00:09:39.11 et dans les flèches noires
00:09:41.08 vous pouvez voir où se trouvent les mastocytes dans la peau,
00:09:43.00 et vous pouvez voir que le développement des mastocytes
00:09:44.18 était tout à fait bien en l'absence de drebrin
00:09:47.01 chez ces souris.
00:09:48.24 Nous avons également examiné des images de micrographie électronique
00:09:52.16 et vous pouvez voir, encore une fois,
00:09:54.03 que l'ultrastructure de ces mastocytes
00:09:55.26 était tout à fait bien,
00:09:57.16 si drebrin était là ou non.
00:09:59.20 Nous étions donc assez confiants qu'en l'absence de drebrin,
00:10:01.10 au moins in vivo,
00:10:03.02 les mastocytes ont pu se développer
00:10:04.27 et ils ont été trouvés au bon endroit.
00:10:07.02 Donc, la prochaine chose que nous avons décidé de faire
00:10:09.05 est de demander si ces mastocytes
00:10:11.11 étaient fonctionnels in vivo dans cette analyse,
00:10:14.21 que je vous ai montré plus tôt.
00:10:16.27 Et ici, ce que nous avons encore fait.
00:10:19.00 nous avons armé les mastocytes in vivo
00:10:21.14 avec des IgE en injectant des IgE,
00:10:23.22 et puis, le lendemain,
00:10:26.18 nous les avons mis au défi avec l'allergène
00:10:27.27 et puis trois minutes plus tard
00:10:29.25 nous avons collecté ces souris
00:10:31.18 et déterminé s'il y avait de l'histamine.
00:10:32.28 Et encore une fois, ce que vous voyez ici
00: 10: 35.15 est que les souris de type sauvage ont généré beaucoup d'histamine
00:10:37.00 quand nous leur avons donné l'allergène plus IgE,
00:10:39.18 alors que les souris déficientes en drebrine
00:10:41.18 a eu une réponse histaminique très réduite
00:10:44.20 dans les mêmes conditions.
00:10:46.03 Donc ces expériences nous ont indiqué
00:10:48.19 que la drebrine était vraiment importante pour la libération d'histamine
00:10:51.04 à partir de mastocytes in vivo
00:10:52.16 lorsque nous les avons déclenchés avec des IgE.
00:10:55.10 La deuxième expérience que nous avons faite
00:10:57.06 était l'expérience dont j'ai parlé plus tôt, c'est-à-dire,
00:11:00.13 ces souris déficientes en drebrine perdent-elles réellement leur température corporelle
00:11:03.20 quand on leur injecte un allergène ?
00:11:05.14 Et nous avons donc fait la même expérience.
00:11:06.22 Nous avons armé les mastocytes in vivo avec des IgE,
00:11:09.24 nous leur avons donné l'allergène,
00:11:11.04 puis nous avons surveillé leur température
00:11:12.24 jusqu'à 60 minutes plus tard
00:11:14.28 pour déterminer s'ils perdent leur température corporelle.
00:11:17.05 Et ce que vous pouvez voir ici, c'est que
00:11:22.16 les souris de type sauvage qui ont reçu le véhicule.
00:11:24.06 ils ont perdu leur température corporelle,
00:11:27.01 en l'absence de drebrin,
00:11:29.08 ils n'ont plus perdu leur température corporelle,
00:11:32.00 et des souris de type sauvage traitées avec du BTP
00:11:34.02 n'a également plus perdu de température corporelle.
00:11:36.10 Donc, dans les deux KO,
00:11:38.02 ainsi que le composé,
00:11:39.14 nous avons obtenu le même résultat.
00:11:40.22 C'est-à-dire l'anaphylaxie systémique passive
00:11:43.18 a été en fait réduit
00:11:46.02 en réponse à un allergène
00:11:48.09 quand on inhibe avec BTP
00:11:49.26 ou quand on assomme le gène drebrin.
00:11:53.25 Donc, la prochaine chose que nous voulions faire, alors,
00:11:55.27 est de regarder les mastocytes individuels
00:11:58.01 et demandez si nous avons vu le même résultat.
00:11:59.11 Donc, encore une fois, nous avons prélevé de la moelle osseuse sur des souris,
00:12:01.26 dans ce cas soit des souris de type sauvage soit des souris déficientes en drebrine,
00:12:04.02 les a fait pousser en culture pendant six semaines,
00:12:06.24, puis nous les avons recouverts d'IgE pendant la nuit
00:12:08.20 puis les a déclenchés avec un allergène
00:12:10.18 pour déterminer s'ils répondraient.
00:12:13.22 Et donc, encore une fois,
00:12:16.04 nous examinons l'activation des mastocytes
00:12:18.23 par le récepteur IgE,
00:12:20.22 et nous allons d'abord examiner les réponses du calcium
00:12:22.12 pour voir si le calcium a été affecté
00:12:24.10 en l'absence de drebrin,
00:12:26.12 et cette expérience est montrée ici.
00:12:29.00 On prend des mastocytes et on les charge
00:12:30.27 avec un colorant sensible au calcium,
00:12:33.03 nous les enduisons ensuite d'IgE,
00:12:35.00 puis les déclencher avec l'antigène,
00:12:37.14 et vous pouvez voir que les cellules de type sauvage,
00:12:39.14 en gris clair,
00:12:41.16 augmente le calcium et que le calcium reste longtemps,
00:12:44.23 alors qu'en l'absence de drebrin
00:12:46.26 ces mastocytes augmentent initialement le calcium,
00:12:49.24 mais le calcium ne tient pas,
00:12:51.20 il commence à diminuer avec le temps.
00:12:54.01 Et sur le graphique du bas
00:12:55.29 vous pouvez voir la pente de cette décomposition du calcium
00:12:58.05 est une pente négative
00:13:00.13 en l'absence de drebrine dans ces mastocytes,
00:13:02.10 alors que c'est une pente positive dans les cellules de type sauvage,
00:13:04.29 indiquant qu'en l'absence de drebrin
00:13:06.27 ce que nous affectons réellement
00:13:08.28 est la libération prolongée de calcium
00:13:10.26 que nous voyons qui est nécessaire
00:13:12.26 pour que ces mastocytes se dégranulent et libèrent leur contenu.
00:13:16.20 Donc, la dégranulation des mastocytes, alors,
00:13:20.08 nécessite l'activation de drebrin,
00:13:22.26 l'activation du récepteur FC,
00:13:25.04 et publie ces contenus :
00:13:26.16 histamine, héparine et autres cytokines.
00:13:29.11 Et nous avons alors demandé si nous pouvions
00:13:32.27 voir réduction de la dégranulation
00:13:34.17 en l'absence de drebrine dans ces mastocytes.
00:13:36.22 Donc, cette expérience est montrée ici.
00:13:39.04 Nous pouvons stimuler ces mastocytes,
00:13:41.04 soit des mastocytes de type sauvage
00:13:42.16 ou mastocytes déficients en drebrine,
00:13:44.02 avec IgE et l'allergène,
00:13:46.10 et d'une manière dépendante de la concentration
00:13:48.08 vous obtenez une augmentation de la dégranulation,
00:13:50.26 tel que mesuré par la libération de -hexosaminase.
00:13:54.02 Donc, dans les mastocytes de type sauvage
00:13:55.22 vous obtenez une augmentation de la libération de -hexosaminase,
00:13:58.14 et quand drebrin manque,
00:14:01.05 vous pouvez voir ici que les mastocytes
00:14:04.06 dégranule beaucoup moins que le type sauvage.
00:14:07.06 Donc l'absence de drebrin, alors,
00: 14: 09.07 affecte la dégranulation des mastocytes in vitro,
00:14:10.26 en plus des réductions du calcium intracellulaire au fil du temps.
00:14:16.00 Alors, qu'en est-il des cytokines ?
00:14:17.26 Alors, je vous ai dit dans la première partie de mon discours
00: 14: 20.08 que l'activation des mastocytes avec un allergène
00:14:22.18 libère non seulement des histamines,
00:14:24.10 mais libère également des cytokines,
00:14:26.08 et ces cytokines peuvent avoir des effets importants
00:14:28.02 sur le système immunitaire,
00:14:29.10 nous avons donc fait une expérience similaire
00:14:31.09 où nous avons pris des mastocytes
00:14:33.27 et les a stimulés
00:14:35.25 et demandé si le drebrin, ou l'absence de drebrin,
00:14:37.28 affecterait la libération de cytokines.
00:14:41.12 Et la libération de cytokines.
00: 14: 43.12 certaines de ces cytokines dépendent du calcium
00:14:44.21 et certaines des cytokines ne dépendent pas du calcium,
00:14:46.28 nous avons donc examiné deux modèles différents de cytokines :
00:14:49.00 cytokines dépendantes du calcium
00:14:50.11 et des cytokines indépendantes du calcium.
00:14:53.04 Et cette expérience est montrée ici.
00:14:55.04 Dans les deux graphiques du haut se trouvent des cytokines dépendantes du calcium,
00:14:57.19 interleukine-2 et GM-CSF,
00:15:00.23 et vous pouvez voir ici, dans les cercles pleins,
00:15:03.29 les cellules de type sauvage produisent de l'IL-2 et du GM-CSF
00:15:08.04 parfaitement bien,
00:15:09.16 mais dans les mastocytes qui manquent de drebrine,
00:15:11.14 vous pouvez voir qu'ils ne sont plus
00:15:13.20 libèrent les cytokines dépendantes du calcium.
00:15:16.02 En revanche, si nous regardons IL-6, sur le graphique du bas,
00:15:19.04 qui n'est pas une cytokine dépendante du calcium,
00:15:21.18 vous pouvez voir qu'il y a très peu de différence
00:15:23.03 entre les cellules de type sauvage et les cellules déficientes en drebrine
00:15:24.26 dans la production de cytokines.
00:15:27.02 Ainsi, ces expériences montrent que
00:15:29.08 drebrin joue un rôle essentiel
00:15:30.24 dans la régulation à la fois de la signalisation calcique conduisant à la dégranulation,
00:15:34.17 mais aussi la signalisation calcique
00:15:36.12 conduisant à la production de cytokines
00:15:38.24 et seulement ces cytokines
00:15:40.10 qui dépendent du calcium
00:15:41.17 sont affectés par l'absence de drebrin.
00:15:43.24 L'autre chose que nous voulions savoir
00:15:48.04 est où dans cette voie
00:15:50.00 est-ce que drebrin ment.
00:15:51.02 Et donc nous avons fait un certain nombre d'expériences
00:15:52.19 où nous avons examiné le
00:15:54.17 activation des kinases Src, Syk et Tec,
00:15:56.18 et il n'y avait aucune différence.
00:15:58.05 Nous avons demandé si l'activation PLC-gamma
00:16:00.21 a été affecté par l'absence de drebrine,
00:16:02.29 et il n'y avait aucune différence.
00:16:04.14 Et donc ce que nous pourrions conclure, alors,
00: 16: 06.12 était que drebrin joue un rôle
00:16:08.18 dans une voie parallèle ou différente
00:16:10.13 qui n'est pas en amont de PLC-gamma,
00:16:12.25 mais affecte encore le calcium
00:16:14.24 d'une certaine manière
00:16:16.22 que nous ne comprenons pas très bien.
00:16:19.06 Maintenant, l'une des choses dont je vous ai parlé
00:16:22.01 était que l'activation de drebrin
00:16:23.16 est important pour la polymérisation de l'actine,
00:16:28.03 et nous voulions donc savoir
00: 16: 29.20 si la drebrine affecterait l'actine
00:16:32.22 dans ces cellules.
00:16:33.24 Maintenant, l'actine est vraiment importante
00:16:35.10 pour la structure de la cellule,
00:16:38.01 mais il s'est également avéré important
00:16:40.18 pour la dégranulation
00:16:42.20 et le mouvement des granules dans les cellules,
00:16:44.24 et donc l'idée que drebrin joue un rôle
00:16:47.03 non seulement dans la régulation de la signalisation du calcium
00:16:49.05 mais aussi dans la régulation du cytosquelette d'actine
00: 16: 52.07 nous a incités à regarder l'actine
00:16:54.07 dans ces cellules.
00:16:55.22 Nous avons donc fait des expériences très simples
00:16:57.20 pour le déterminer.
00:16:59.00 Premièrement, nous avons pris l'un ou l'autre type sauvage
00:17:01.09 ou mastocytes déficients en drebrine
00:17:02.25 et les a colorés avec de la phalloïdine,
00:17:04.24 qui colore l'actine F, ou filamenteuse.
00:17:09.16 Et vous pouvez voir, le plus évident,
00:17:11.20 est que les cellules de type sauvage
00:17:13.24 ont en fait une belle actine
00:17:16.04 autour du périmètre de la cellule,
00: 17: 18.11 mais si nous regardons les cellules déficientes en drebrine
00:17:20.19 vous pouvez voir qu'ils ont plus d'actine
00:17:22.04 et l'actine est effectivement distribuée
00:17:24.16 non seulement dans le périmètre de la cellule,
00:17:26.14 mais commence à s'étendre à l'intérieur de la cellule.
00:17:28.04 Donc, nous voulions quantifier cela un peu plus,
00:17:30.23 et nous avons donc fait de la cytométrie en flux
00:17:32.14 avec ces cellules
00:17:34.01 en utilisant de la phalloïdine marquée,
00:17:36.01 et vous pouvez voir ici
00: 17: 38.07 que les mastocytes de type sauvage, en solide,
00: 17: 41.01 ont en fait moins d'actine si vous regardez
00:17:43.23 à l'intensité de fluorescence moyenne
00:17:45.14 que les mastocytes qui n'ont pas de drebrine.
00:17:50.13 Donc, en l'absence de drebrin,
00: 17: 51.27 ces mastocytes ont en fait augmenté la F-actine,
00:17:54.11 ce qui peut affecter la réponse.
00:17:57.15 Donc, nous voulions explorer cela un peu plus loin
00: 17: 59.01 et demandez ce qui arrive à la F-actine
00:18:01.11 quand ces cellules sont-elles réellement stimulées ?
00:18:04.06 Et donc ce que nous avons fait, c'est que nous avons pris ces mastocytes
00:18:06.23 et les a stimulés de la même manière que
00:18:08.17 nous les avons stimulés avant,
00:18:09.23 avec IgE et allergène,
00:18:11.03 et nous avons examiné la F-actine au fil du temps
00:18:13.07 dans ces cellules.
00:18:15.00 Et c'est donc une diapositive un peu compliquée
00:18:17.11 et je vais vous expliquer ça lentement.
00:18:19.07 Sur la droite, vous pouvez voir que les mastocytes de type sauvage
00:18:22.12 commencez avec l'actine au temps zéro,
00:18:23.25 la plupart de l'actine est au bord de la cellule.
00:18:26.14 au périmètre de la cellule.
00:18:28.05 Deux minutes après l'activation,
00:18:29.18 vous pouvez voir que la F-actine
00:18:31.04 commence à se déplacer dans la cellule,
00:18:33.20 avec l'augmentation du signal
00:18:36.14 à 2 minutes, 5 minutes et 10 minutes,
00:18:38.26 puis par 30 minutes, en bas,
00:18:40.29 la cellule ressemble beaucoup à une cellule
00:18:43.03 qui n'a pas été activé.
00:18:44.13 Donc, dans les cellules de type sauvage,
00: 18: 45.29 il y a une augmentation de la F-actine
00:18:47.23 qui est réorganisé
00:18:50.03 loin du périmètre de la cellule
00:18:52.15 vers le milieu de la cellule
00:18:54.03 et puis il recule
00:18:56.01 au périmètre de la cellule.
00:18:58.04 Si nous regardons les mastocytes déficients en drebrine,
00:19:00.04 vous pouvez voir qu'au temps 0,
00:19:02.09 l'actine est distribuée dans toute la cellule,
00:19:04.07 non seulement au périmètre,
00:19:06.07 et ce schéma ne change pas beaucoup
00:19:08.27 pendant que nous stimulons les cellules au fil du temps.
00:19:11.15 Donc, changements induits par les récepteurs IgE FC
00:19:15.05 sont différents entre les cellules de type sauvage
00:19:18.20 et les cellules déficientes en drebrine,
00:19:20.19 dans l'espace et dans le temps.
00:19:23.17 Et nous pouvons quantifier cela
00:19:25.03 en comparant la différence
00:19:26.27 entre les cellules déficientes en drebrine
00: 19: 28.07 et les cellules de type sauvage à chaque instant,
00:19:31.04 statistiquement, et vous pouvez le voir ici.
00:19:33.14 sur l'axe des y dans le graphique de gauche,
00:19:37.05 qu'au temps 0,
00: 19: 40.03 il y a une énorme différence dans la localisation de la F-actine dans ces cellules,
00:19:42.27 et cela change au fur et à mesure que la cellule est activée,
00:19:45.19 mais dans tous les cas il y a une différence statistiquement significative
00:19:49.03 à l'emplacement de l'actine
00:19:51.09 dans les cellules de type sauvage
00:19:53.01 par rapport aux cellules déficientes en drebrine.
00:19:56.09 Alors, qu'est-ce que ces expériences
00:19:58.29 nous a indiqué
00:20:00.18 était que drebrin régulait
00:20:02.18 la superstructure F-actine dans ces mastocytes.
00:20:05.11 Donc, nous avons posé la question,
00:20:07.28 pouvons-nous détendre la superstructure F-actine
00:20:10.10 dans ces cellules déficientes en drebrine
00:20:12.20 et sauver la fonction
00:20:14.19 en l'absence de drebrin ?
00:20:15.29 Donc, nous avons utilisé un composé
00:20:17.26 appelé latrunculine B.
00:20:18.29 Ce que fait la latrunculine B
00: 20: 20.19 est-il lié à la F-actine
00:20:22.14 et augmente sa mobilité,
00:20:24.11 ou cela réduit la quantité d'actine F dans les cellules.
00:20:27.15 Et ce que je vous montre ici à [gauche]
00:20:30.20 sont des graphiques de cytométrie en flux
00:20:32.06 de mastocytes déficients en drebrine
00:20:33.27 traité à la latrunculine B,
00:20:35.07 et vous pouvez voir ici,
00:20:36.22 dans le tableau de [droite],
00:20:38.00 alors que nous augmentons la quantité de latrunculine B,
00: 20: 39.27 nous réduisons la quantité de F-actine
00:20:42.29 dans ces cellules.
00:20:44.07 Donc on peut utiliser la latrunculine B
00: 20: 45.19 pour régler la quantité de F-actine dans ces cellules,
00:20:47.22 et nous pouvons maintenant poser la question,
00: 20: 49.15 si nous réduisons la quantité d'actine F dans ces cellules déficientes en drebrine,
00:20:52.25 pouvons-nous sauver la dégranulation ?
00:20:55.20 Et cette expérience est montrée ici.
00:20:57.25 Donc, ici dans les cercles noirs remplis
00:21:00.02 sont des mastocytes de type sauvage
00:21:02.14 que nous avons stimulé avec des IgE et un antigène,
00:21:05.07 d'une manière dépendante de la concentration,
00:21:07.01 et nous obtenons une augmentation de la dégranulation
00:21:09.00 au cours de cette période.
00:21:11.12 En l'absence de drebrin,
00:21:13.01 dans les cercles ouverts,
00:21:14.08 vous pouvez voir que les mastocytes déficients en drebrine
00:21:18.19 dégranulent en fait beaucoup moins.
00:21:22.18 Cependant, lorsque nous traitons ces mastocytes déficients en drebrine
00:21:25.13 avec 0,5 ou 1 [micromolaire] latrunculine B,
00:21:28.17 nous pouvons partiellement sauver la dégranulation,
00:21:30.26 indiquant qu'autoriser la F-actine
00:21:32.11 pour être plus fluide dans ces cellules
00:21:34.13 permet à ces cellules de
00:21:37.07 être capable de dégranuler.
00:21:39.17 Donc, nous pouvons résumer, alors,
00:21:41.05 en plaçant drebrin dans cette voie,
00:21:44.11 en quelque sorte
00:21:46.13 que le récepteur FC déclenche l'activation
00:21:48.02 de ces tyrosine kinases,
00:21:49.22 qui conduit ensuite à l'activation
00:21:51.06 d'un certain nombre de voies différentes,
00:21:53.02 y compris drebrin,
00:21:54.15 et ce que fait drebrin
00: 21: 56.01 contrôle la quantité de F-actine dans ces cellules,
00:21:57.23 pour contrôler soit la signalisation du calcium
00:21:59.22 et/ou dégranulation de ces cellules
00:22:02.14 afin qu'ils puissent diffuser leur contenu,
00:22:04.15 produisent des cytokines,
00:22:06.11 et participer à la réponse allergique.
00:22:09.09 Et donc, avec ça,
00:22:10.15 Je voudrais remercier les personnes qui ont fait le travail dans le laboratoire.
00:22:12.13 La plupart de ce travail a été fait
00:22:14.27 par les personnes indiquées en rouge.
00: 22: 16.25 Mankit Law était la personne principale
00:22:19.19 qui a conduit la plupart du travail,
00:22:21.03 avec l'aide d'un certain nombre de post-doctorants
00:22:22.25 et des étudiants diplômés dans le laboratoire.
00:22:24.17 Nous avons collaboré avec Laurie Mottram et Blake Peterson,
00:22:27.05 avec Tomo Shirao et Hiro Yamazaki
00:22:29.29 à l'Université Gunma.

  • Partie 1 : Allergies et système immunitaire

Discussion

Les résultats présentés démontrent une relation entre le profil des populations de cellules progénitrices pulmonaires putatives et les maladies pulmonaires chroniques. Des relations spécifiques entre l'augmentation du CCSP + progéniteurs de type épithélial et la mucoviscidose et entre l'augmentation des fibrocytes circulants et les maladies fibrotiques telles que la fibrose pulmonaire et la bronchiolite oblitérante ont été identifiées. De plus, les résultats suggèrent l'implication de médiateurs chimiotactiques clés, notamment SDF-1, SCGF-β et MCP-1, dans le recrutement ou le maintien de ces populations cellulaires au sein des groupes de maladies spécifiques étudiés.

Dans notre publication précédente [8], nous avons rapporté que la moelle osseuse murine contient une population de cellules qui expriment CCSP à leur surface. Cela a été confirmé par PCR sur des populations triées par FACS, western blot et avec l'utilisation de souris knock-out CCSP. Cette population a démontré une plus grande propension à exprimer un phénotype épithélial pulmonaire au niveau des gènes et des protéines et a été préférentiellement retenue dans le poumon blessé, par rapport aux autres cellules de la moelle osseuse et a contribué à la muqueuse épithéliale après transplantation de moelle osseuse. En raison de ces propriétés, nous avons appelé ces cellules des cellules progénitrices de type épithélial. Nous avons également signalé que la moelle humaine contient une population similaire par cytométrie en flux. Nous confirmons ici que la moelle osseuse humaine et le sang périphérique contiennent de telles cellules à l'aide de sondes PCR spécifiques basées sur Taqman. Il est à noter que la quantité d'ARNm de CCSP est environ 60 fois inférieure à celle des tissus bronchiques, mais plusieurs fois supérieure à celle des autres types de cellules de la moelle osseuse.

L'évaluation des populations de cellules progénitrices de type épithélial et fibroblastique chez les patients atteints d'une maladie pulmonaire chronique en phase terminale n'a pas été rapportée auparavant. Nous avons émis l'hypothèse que lors de l'étude de ces maladies variables, la mesure de deux populations cellulaires aux fonctions potentiellement contradictoires permettrait une compréhension plus complète. En effet, il existe des différences significatives dans ces populations cellulaires par rapport aux maladies sous-jacentes. Plus précisément, les cellules CCSP + dans la moelle osseuse et le sang périphérique ont augmenté chez les patients atteints de mucoviscidose où les lésions et les lésions épithéliales des petites voies aériennes peuvent être un stimulus prédominant et persistant. Reconnaissant les différences entre les lésions pulmonaires aiguës et chroniques, et entre les études chez la souris et chez l'homme, ces résultats appuient nos observations originales chez la souris où ces cellules ont augmenté à la suite d'une lésion des voies respiratoires induite par le naphtalène spécifique à l'épithélium. Nous supposons que cela peut être attribuable à un effort soutenu mais non résolu pour réparer l'épithélium CF endommagé conduisant à un environnement inflammatoire persistant entraînant un signal de recrutement perpétuel vers la moelle osseuse et l'accumulation de la population progénitrice de type épithélial CCSP +. Il a déjà été rapporté que l'épithélium bronchique des patients CF est plus prolifératif que celui des voies aériennes non CF [12]. Les xénogreffes humanisées des voies respiratoires, où les cellules dérivées de la mucoviscidose présentaient un plus grand potentiel de prolifération, étaient en outre caractérisées par un remodelage, une différenciation retardée et des réponses pro-inflammatoires altérées [13].

L'observation que les fibrocytes circulants sont augmentés dans les maladies fibrotiques est en accord avec les preuves antérieures [10, 14]. Nous avons également documenté que les patients BO sont un sous-ensemble particulièrement frappant en termes de nombre très élevé de fibrocytes [11]. Cela soutient l'hypothèse que les fibrocytes circulants peuvent contribuer à la population de fibroblastes pulmonaires, soit par activation paracrine de fibroblastes endogènes, soit par prise de greffe et contribution directe au dépôt et au remodelage de la matrice. La mesure des populations de progéniteurs épithéliaux et mésenchymateux a identifié des changements dans ces nombres de cellules qui correspondent à des changements dans la pathologie pulmonaire épithéliale ou mésenchymateuse sous-jacente. Plus précisément, des progéniteurs de type épithélial accrus ont été identifiés dans la mucoviscidose où l'épithélium est hyperplasique, tandis que les progéniteurs mésenchymateux ont été augmentés dans la maladie caractérisée par la fibroprolifération. Bien que de nombreux mécanismes communs existent chez les patients atteints d'une maladie pulmonaire en phase terminale, la biologie unique de la mucoviscidose par rapport à la maladie pulmonaire fibrotique peut être mieux décrite par ces nouvelles différences dans le nombre de cellules progénitrices, ouvrant de nouvelles voies d'investigation.

Il est important de noter qu'aucune corrélation n'a été trouvée entre l'âge, le sexe ou l'IMC du patient, ce qui suggère que ces paramètres démographiques ne semblent pas influencer les changements observés dans les profils cellulaires. Pourtant, une corrélation entre la proportion de CCSP + BMCs et PBMCs a été identifiée, suggérant une relation entre le nombre de cellules de la moelle osseuse en réserve et le nombre qui peuvent sortir et transiter par le sang périphérique. Le SCGF-β s'est avéré être en corrélation significative avec le nombre des deux populations de cellules CCSP +. Il est possible que le SCGF-β agisse comme un mitogène endogène pour les progéniteurs de type épithélial, comme cela a été décrit pour les cellules hématopoïétiques CD34 + [15], bien que la source directe de ce facteur n'ait pas été déterminée dans cette étude. Aucune corrélation n'a été identifiée entre les populations de cellules CCSP + et la proportion de fibrocytes circulants. Cela suggère que des mécanismes distincts peuvent être responsables du recrutement de chaque population et plaide contre une altération généralisée de la mobilisation ou du trafic des cellules dérivées de la moelle.

Cette étude présente plusieurs limites, notamment la conception transversale. De futures études seront nécessaires pour obtenir des données sur les patients à différents moments du développement de leur maladie pulmonaire. Cependant, il est douteux que le prélèvement de la moelle osseuse soit possible dans une telle étude de suivi longitudinale. Chez ces patients, tous atteints d'une maladie pulmonaire sévère au stade terminal en attente d'une transplantation pulmonaire, il n'y avait pas de relation significative entre CCSP + BMC/PBMC ou cellules CD45 + Collagène-1 + et le rapport VEMS/CVF chez les patients atteints de mucoviscidose ou de BPCO ou avec le % prédit. CVF pour les patients atteints de fibrose pulmonaire. Cela n'exclut pas la possibilité que ces populations cellulaires contribuent à la pathologie des maladies pulmonaires, et une analyse plus approfondie chez les patients à des stades beaucoup plus précoces de la maladie pulmonaire sera d'importantes priorités futures. De plus, de nombreux autres paramètres cliniques importants influencent la fonction pulmonaire et ces variables confusionnelles peuvent avoir obscurci toute relation entre le nombre de cellules et la fonction pulmonaire. Une autre limitation est l'utilisation de donneurs de poumons comme groupe témoin. Bien qu'il ne soit pas idéal, car ce groupe peut très bien avoir des lésions pulmonaires aiguës ou chroniques, il représentait la seule option pour l'analyse de la moelle osseuse, car le prélèvement sternal de témoins vraiment normaux ne serait pas éthique.

Dans un effort pour comprendre les mécanismes responsables des différents profils de cellules progénitrices entre les maladies pulmonaires, des chimiokines et des récepteurs clés ont été analysés. Il a déjà été rapporté que les fibrocytes expriment un certain nombre de récepteurs de chimiokines importants, notamment CXCR4 [9], CCR2 [16] et CCR7 [17]. Lorsque CCSP + BMC et PBMC ont été analysés pour un panel de récepteurs similaires, l'expression de CCR2, CCR4, CXCR3 et CXCR4 a été identifiée. On s'attend à ce que certaines voies soient redondantes et que certaines cytokines aient la capacité d'activer les deux populations cellulaires. C'est peut-être la preuve de l'origine médullaire des deux populations.

Des études de migration pour CCSP + ont été réalisées pour étudier la in vitro réponse à diverses chimiokines. La migration n'a pas été analysée pour les fibrocytes, comme cela a déjà été rapporté [9, 18]. Ici, nous avons constaté que le facteur dérivé du stroma (SDF-1) était un stimulus de migration important pour les cellules CCSP +, comme cela a également été rapporté pour les fibrocytes. Il a déjà été rapporté que les anticorps neutralisants contre le SDF-1 peuvent atténuer les effets fibrotiques des lésions pulmonaires de souris induites par la bléomycine [9]. L'expression pulmonaire de SDF-1 a également été rapportée dans le cadre d'une lésion pulmonaire et du recrutement de cellules dérivées de la moelle osseuse [19]. Le SCGF-β s'est également avéré induire la migration de CCSP + PBMC et BMC chez les patients atteints d'une maladie pulmonaire en phase terminale. Ceci confirme la corrélation observée entre cette cytokine plasmatique et le nombre de cellules CCSP+ mesurées. L'expression des transcrits du SCGF-β serait limitée aux cellules de la lignée myéloïde [20], qui peuvent inclure des macrophages pulmonaires résidents. L'expression de CCR2 par les deux populations cellulaires, ainsi que l'augmentation des ligands IP-10 et MCP-1 dans la fibrose pulmonaire mettent en évidence le rôle de l'inflammation dans de nombreuses maladies pulmonaires en phase terminale. Il a en outre été démontré que la concentration plasmatique de MCP-1 était corrélée au nombre de fibrocytes circulants, identifiant à nouveau un rôle pour le recrutement de cellules progénitrices médié par CCR2, qui peut être amélioré chez le patient fibrotique.

Fait intéressant, le MIF s'est avéré spécifiquement augmenté chez les patients atteints de mucoviscidose, suggérant peut-être un rôle unique pour CD74 ou CXCR4 dans le mécanisme de recrutement des cellules CCSP +. Il a été rapporté que le MIF peut agir comme un ligand pour CXCR4 et induire la migration des monocytes et des cellules T, suggérant peut-être un nouveau mécanisme de trafic de cellules progénitrices de type épithélial [21, 22]. Le MIF est un médiateur inflammatoire pléiotrope avec des fonctions de type chimiokine qui peuvent diriger la migration des leucocytes vers les sites inflammatoires [21].Il a également été démontré que le MIF est produit par les cellules épithéliales [23] et les macrophages alvéolaires activés [24], suggérant un mécanisme potentiel par lequel l'épithélium CF endommagé recrute les cellules CCSP + circulantes. L'amélioration du recrutement CCSP + à l'aide du MIF peut ne pas être une option thérapeutique viable, car le MIF agit sur plusieurs types de cellules et peut exacerber les réponses inflammatoires.


Matériaux et méthodes

Animaux.

Des souris C57BL/6, CX3CR1 gfp/+ (9) et CD11b-DTR (fournies par J.S. Duffield, Harvard Medical School, Boston, MA) (47) ont été sélectionnées et utilisées conformément à la législation française. Les expériences ont été menées à l'âge de 4 à 8 semaines.

Lésion musculaire et préparation musculaire.

10 µl de notexine (25 µg/ml en PBS Latoxan) ont été injectés dans le TA. Pour l'analyse histologique, les muscles ont été préparés comme décrit précédemment (27). Une analyse quantitative de la régénération musculaire a été réalisée sur l'ensemble de la zone lésée : environ sept champs (20 × objectif PL Flustar Carl Zeiss MicroImaging, Inc.) ont été analysés chez chaque souris, représentant 300 à 400 fibres par souris. Le diamètre de la myofibre a été évalué après immunomarquage au collagène IV (voir Immunomarquage) sur environ sept champs (objectif 20x) chez chaque souris. Le petit diamètre des fibres musculaires à nucléation centrale uniquement a été évalué dans le muscle en régénération tardive (zone non hachurée sur la figure 8 B) avec le logiciel Axiovision 4.6 (Carl Zeiss MicroImaging, Inc.), représentant 250 à 350 fibres par souris. Chez les souris ayant reçu une injection de PBS, le fascicule perforé a été omis de l'analyse.

Isolement des MO/MP du muscle.

Le fascia du TA a été retiré. Les muscles ont été dissociés dans du DMEM contenant de la collagénase B 0,2% (Roche Diagnostics GmbH) et de la trypsine-EDTA 0,2% à 37°C pendant 45 min deux fois, filtrés et comptés. Les cellules CD45+ ont été isolées par tri magnétique (Miltenyi Biotec) et colorées avec un anticorps anti-Gr1 conjugué au PE ou PC5 (qui réagit avec Ly-6C et Ly-6G, mais seul Ly-6C est exprimé par MOs eBioscience). Les cellules ont été triées à l'aide d'un trieur de cellules (Epics Elite Beckman Coulter). Des populations présentant une pureté >90% ont été utilisées. Dans certaines expériences, des anticorps CD11c, I-Ab (BD Biosciences) et F4/80 (AbD Serotec) conjugués au PE ont été utilisés. L'analyse a été réalisée avec un cytomètre (FACSCalibur BD Biosciences).

Étiquetage des OM du sang.

Le marquage des MO circulants a été effectué exactement comme décrit précédemment (15) avec des microsphères simples (Fluoresbrite Polychromatic Red Microspheres 0,5 m, 2,5% de solides PolySciences, Inc.) et clo-lip, qui ont été préparées comme décrit précédemment (79). Le clodronate était un don de Roche Diagnostics GmbH.

Épuisement des MO circulants et des i.m. députés.

12 ng/g DT était i.v. injecté à des souris CD11b-DTR. Le sang a été récolté rétroorbitairement à divers moments après l'injection, et les cellules ont été marquées avec des anticorps anti-CD11b, anti-Gr1 et F4/80 et analysées par cytométrie en flux. En raison des fortes variations interindividuelles (3 à 12 % des PBMC), le nombre de MO circulantes chez les souris témoins a été normalisé à 5 % des PBMC pour chaque série (moyenne calculée avec des souris >25). Pour épuiser les MO/MP infiltrés, 25 ng/g de DT dans <10 l étaient i.m. injecté aux jours 5 et 6 après la blessure. Les contrôles comprenaient l'injection de PBS.

Immunomarquage.

Des lames musculaires ont été incubées avec un anticorps anti-collagène IV (1:50 Chemicon International, Inc.) révélé avec un anticorps anti-lapin conjugué à Cy5. Des cellules de souris triées ont été centrifugées sur des lames et marquées avec 1 g/ml d'anticorps anti-Ki67 (Abcam plc), révélés avec un anticorps anti-lapin conjugué au FITC. Des mpcs humaines cultivées ont été incubées avec 60 g/ml d'anticorps antidesmine (Abcam plc), révélés par un anticorps anti-lapin conjugué à Cy3 et avec 10 g/ml d'anticorps antimyogénine (BD Biosciences), révélés par un anti-souris biotinylé (Vector Laboratoires) et par la dichlorotriazinglaminofluorescéine-streptavidine (Beckman Coulter). Les contrôles comprenaient une incubation avec des IgG entières de lapin ou de souris. D'autres anticorps secondaires et IgG ont été obtenus auprès de Jackson ImmunoResearch Laboratories.

RT-PCR.

L'ARN total a été préparé à partir de cellules triées en utilisant le mini kit RNeasy (QIAGEN). 0,5 µg d'ARN total a été reverse transcriptase à l'aide de la reverse transcriptase Superscript II et amplifié avec une Taq DNA polymérase platine (Invitrogen) et les amorces spécifiques suivantes (respectivement sens et antisens) : β2 microglobuline, 5′-CAGTTCCACCCGCCTCAC-3′ et 5′ -CACATGTCTCGATCCCAG-3′ TNF-α, 5′-TTCCAGATTCTTCCCTGAGGT-3′ et 5′-TAAGCAAAAGAGGAGGCAACA-3′ IL-1β, 5′-TGACGTTCCCATTAGACAACTG-3′ et 5′-CCGTCTTTCATTACACAGGACA-3′ TGF-β1, 5′- GAGACGGAATACAGGGCTTTC-3′ et 5′-TCTCTGTGGAGCTGAAGCAAT-3′ IL-10, 5′-ACCAGCTGGACAACATACTGC-3′ et 5′-TCACTCTTCACCTGCTCCACT-3′ SLPI, 5′-CCTTAAGCTTGAGAAGCCACA-3′ et 5′-AGCACTTGTATTPARTTGCC,GTCAC et PPA 5′-AAGAGCTGACCCAATGGTTG-3′ et 5′-GGATCCGGCAGTTAAGATCA-3′. L'amplification a été réalisée à 94°C, 60°C et 72°C pendant 1 min pour chaque étape pendant 30 cycles. 10 µl de produits d'amplification ont été soumis à une électrophorèse sur un gel d'agarose à 2% contenant du bromure d'éthidium pour la visualisation. La quantification a été réalisée en utilisant le logiciel Image (Scion).

Culture humaine de mpc.

Les composants du milieu de culture ont été achetés auprès d'Invitrogen. Les mpcs humaines ont été cultivées à partir de prélèvements musculaires au moment de la chirurgie correctrice, conformément à la législation française (Code de la Santé Publique, livre II), comme décrit précédemment (26).

Culture de cellules MP humaines.

Les MP ont été différenciées des MO isolées du sang humain, comme décrit précédemment (26). Les MP différenciées ont été ensuite cultivées dans un milieu RPMI 1640 contenant 15 % de FBS ou un milieu RPMI 1640 avancé contenant 0,5 % de FBS (complété avec 1 % de pyruvate de sodium, 10 mM d'Hepes, 50 M de β-mercaptoéthanol, 1 % d'acides aminés non essentiels, 100 × 1 % de vitamines). Les MP ont été traitées ou non pendant 48 h avec soit 1 g/ml de LPS (Sigma-Aldrich) et 10 ng/ml d'IFN-γ (PeproTech), soit 10 ng/ml d'IL-4 (PeproTech) ou 80 ng/ml DEX (Sigma-Aldrich) et 10 ng/ml IL-10 (PeproTech).

Phagocytose.

nécrose mpc a été induite par H2O traitement pendant 1 h à 37°C. 100 % des cellules étaient positives à l'iodure de propidium. Des mpcs nécrotiques ont été ensemencés sur des MP (cinq mpcs morts pour un MP) pendant 3 h à 37°C. Les cultures MP ont été lavées trois fois pour éliminer le matériel non ingéré et cultivées davantage dans un milieu avancé sans sérum supplémenté en RPMI 1640 pendant 24 h pour préparer un milieu conditionné. Dans certaines expériences, les cellules ont été traitées, comme décrit précédemment, avec 10 g/ml de colchicine (Sigma-Aldrich) (40), 1 g/ml de cytochalasine D (Sigma-Aldrich) (41) ou 40 g/ml d'annexine V recombinante (BD Biosciences) (42). La phagocytose a été quantifiée dans les mêmes conditions après incubation avec des microsphères fluorescentes (comme décrit dans Marquage des MOs sanguins). Le nombre de cellules LX+ a été quantifié au microscope inversé et exprimé en pourcentage de cellules totales.

Co-cultures.

Les mpcs ont été étalées sur des cultures MP préalablement préparées (rapport MP/mpc de 3:1) dans un milieu avancé complété de RPMI 1640, sauf dans certaines expériences dans lesquelles les MP et les mpcs ont été ensemencés ensemble avant l'application du traitement MP, comme décrit dans Culture cellulaire MP humaine.

Comportement MPC.

la croissance de mpc a été évaluée comme décrit précédemment (26). la prolifération de mpc a été estimée par l'incorporation de BrdU (Roche Diagnostics GmbH). La différenciation mpc a été évaluée en comptant le nombre de cellules myogénine + parmi les cellules desmine +. La fusion mpc a été estimée en comptant le nombre de noyaux par myotube.

Analyses statistiques.

Toutes les expériences ont été réalisées en utilisant au moins trois cultures ou animaux différents dans des expériences indépendantes. Les étudiants t test a été utilisé pour les analyses statistiques. P < 0,05 a été considéré comme significatif.