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Quel est le protocole CRISPR/Cas9 le plus récent ?

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Je rassemble de la littérature pour démarrer un nouveau projet sur l'édition de gènes CRISPR/Cas9. Je dois élaborer un protocole pour commencer et j'ai l'intention d'utiliser le document suivant comme guide :

« Ingénierie du génome utilisant le système CRISPR-Cas9 ». Protocole Nature 8(11):2281-308 · Novembre 2013

Pourriez-vous s'il vous plaît indiquer s'il s'agit du protocole général publié le plus fiable et le plus récent pour le système CRISPR/Cas9.


Cela dépend vraiment de ce que vous voulez en faire. S'en tenir à l'ingénierie du génome dans les cellules humaines, Nature Protocol 8(11):2281-308 · Novembre 2013 est la norme de facto. Une amélioration que je suggère est de remplacer le "Surveyor Assay" par une analyse de déconvolution des traces de séquençage à l'aide de TIDE.


Thérapie génique CRISPR/Cas

Correspondance Baohong Zhang, Département de biologie, East Carolina University, Greenville, NC 27858, États-Unis.

Département de biologie, East Carolina University, Greenville, Caroline du Nord, États-Unis

Correspondance Baohong Zhang, Département de biologie, East Carolina University, Greenville, NC 27858, États-Unis.

Résumé

Les répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées en cluster (CRISPR)/enzyme associée à CRISPR (Cas) sont un outil d'édition du génome naturel adopté à partir du système de défense immunitaire adaptatif procaryote. Actuellement, l'édition du génome basée sur CRISPR/Cas9 est devenue l'un des outils les plus prometteurs pour le traitement des maladies génétiques humaines, notamment les maladies cardiovasculaires, les troubles neurologiques et les cancers. En tant que modification rapide du système CRISPR/Cas9, y compris le système d'administration, la thérapie génique basée sur CRISPR/Cas9 a été largement étudiée dans les traitements précliniques et cliniques. L'édition du génome CRISPR/Cas est également un outil robuste pour créer des modèles génétiques animaux pour étudier et traiter les troubles génétiques humains, en particulier les maladies associées à des mutations ponctuelles. Cependant, des défis importants subsistent également avant que la technologie CRISPR/Cas puisse être utilisée de manière routinière en clinique pour le traitement de différentes maladies génétiques, notamment la toxicité et la réponse immunitaire des cellules traitées au composant CRISPR/Cas, une méthode d'administration à haut débit et un impact potentiel hors cible. . L'effet hors cible est l'une des principales préoccupations de la thérapie génique CRISPR/Cas9, davantage de recherches devraient se concentrer sur la limitation de cet impact en concevant des ARNg hautement spécifiques et en utilisant une spécificité élevée des enzymes Cas. La modification de la méthode d'administration CRISPR/Cas9 cible non seulement un tissu/une cellule spécifique, mais limite également potentiellement l'impact hors cible.


Résumé

Les malformations congénitales sont la principale cause de mortalité infantile aux États-Unis et en Europe. Grâce aux progrès rapides de la génomique humaine, nous pouvons désormais identifier efficacement les variantes de séquences susceptibles de provoquer des maladies chez ces patients. Cependant, établir la causalité de la maladie reste un défi. De plus, dans le cas des cardiopathies congénitales, de nombreux gènes candidats identifiés sont soit nouveaux pour le développement embryonnaire, soit n'ont aucune fonction connue. Par conséquent, il existe un besoin urgent de développer des technologies peu coûteuses et efficaces pour cribler ces gènes candidats pour la phénocopie de la maladie dans des systèmes modèles et d'effectuer des études fonctionnelles pour découvrir leur rôle dans le développement. À cette fin, nous avons cherché à tester l'édition de gènes basée sur F0 CRISPR en tant que stratégie de perte de fonction pour la phénocopie de la maladie dans l'organisme modèle grenouille, Xenopus tropicalis. Nous démontrons que le système CRISPR/Cas9 peut modifier efficacement les deux allèles de la génération F0 en quelques heures après la fécondation, récapitulant même les phénotypes précoces de la maladie qui sont très similaires aux knockdowns des oligos morpholino (MO) dans presque tous les cas testés. Nous constatons que l'injection de protéine Cas9 est considérablement plus efficace et moins toxique que cas9 ARNm. Nous concluons que la modification du gène F0 basée sur CRISPR dans X. tropicalis est efficace et rentable et récapitule facilement les phénotypes de la maladie et des MO.


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Contenu

Les premières études en Caenorhabditis elegans [1] et Drosophila melanogaster [2] [3] ont vu des criblages à grande échelle et systématiques de perte de fonction (LOF) effectués par mutagenèse à saturation, démontrant le potentiel de cette approche pour caractériser les voies génétiques et identifier les gènes dotés de fonctions uniques et essentielles. La technique de mutagenèse par saturation a ensuite été appliquée à d'autres organismes, par exemple le poisson zèbre [4] [5] et les souris. [6] [7]

Des approches ciblées pour le knockdown de gènes ont émergé dans les années 1980 avec des techniques telles que la recombinaison homologue, [8] [9] les ribozymes trans-clivants, [10] [11] et les technologies antisens. [12] [13]

En l'an 2000, la technologie d'interférence ARN (ARNi) était devenue une technique rapide, simple et peu coûteuse pour la suppression ciblée de gènes, et était couramment utilisée pour étudier in vivo fonction des gènes dans C. elegans. [14] [15] [16] [17] En effet, en l'espace de quelques années seulement après sa découverte par le Feu et al. (1998), [18] presque tous les

19 000 gènes dans C. elegans avait été analysé à l'aide d'un knockdown basé sur l'ARNi. [19]

La production de bibliothèques d'ARNi a facilité l'application de cette technologie à l'échelle du génome, et les méthodes basées sur l'ARNi sont devenues l'approche prédominante pour les écrans knockdown à l'échelle du génome. [ citation requise ]

Néanmoins, les approches basées sur l'ARNi pour les écrans knockdown à l'échelle du génome ont leurs limites. D'une part, les effets hors cible élevés causent des problèmes d'observations faussement positives. [20] [21] De plus, parce que l'ARNi réduit l'expression des gènes au niveau post-transcriptionnel en ciblant l'ARN, les écrans basés sur l'ARNi n'entraînent qu'une suppression partielle et à court terme des gènes. Alors qu'un knock-down partiel peut être souhaitable dans certaines situations, une technologie avec une efficacité de ciblage améliorée et moins d'effets hors cible était nécessaire. [ citation requise ]

Depuis l'identification initiale en tant que système immunitaire adaptatif procaryote, [22] le système de répétitions palindromes courtes régulièrement espacées (CRISPR)/Cas9 bactérien de type II est devenu un outil simple et efficace pour générer des mutations LOF ciblées. [23] Il a été appliqué avec succès pour éditer des génomes humains et a commencé à remplacer l'ARNi comme outil dominant dans les études sur les mammifères. [24] Dans le contexte des écrans knock-out à l'échelle du génome, des études récentes ont démontré que les écrans CRISPR/Cas9 sont capables d'obtenir une déplétion protéique très efficace et complète et de surmonter les problèmes hors cible observés avec les écrans ARNi. [25] [26] En résumé, l'émergence récente de CRISPR-Cas9 a considérablement augmenté notre capacité à effectuer des écrans LOF à grande échelle. La polyvalence et la programmabilité de Cas9, associées au faible bruit, à l'efficacité de knock-out élevée et aux effets hors cible minimes, ont fait de CRISPR la plate-forme de choix pour de nombreux chercheurs engagés dans le ciblage et l'édition de gènes. [24] [27]

CRISPR/Cas9 Perte de fonction Modifier

Le système CRISPR/Cas9 de répétitions de palindromes courts régulièrement espacés en cluster est une technologie d'édition de gènes qui peut introduire des cassures double brin (DSB) à un locus génomique cible. En utilisant un seul ARN guide (sgRNA), l'endonucléase Cas9 peut être délivrée à une séquence d'ADN spécifique où elle clive la chaîne nucléotidique. [28] La spécificité du sgRNA est déterminée par une séquence de 20 nt, homologue au locus génomique d'intérêt, et la liaison à Cas9 est médiée par une région d'échafaudage constante du sgRNA. Le site cible souhaité doit être immédiatement suivi (5’ à 3’) par un motif adjacent de protospacer (PAM) conservé à 3 nucléotides. [29] [30] Afin de réparer les DSB, la cellule peut utiliser la jonction d'extrémité non homologue fortement sujette aux erreurs, ou la recombinaison homologue. En concevant des sgRNA appropriés, des insertions ou délétions planifiées peuvent être introduites dans le génome. Dans le contexte des criblages LOF à l'échelle du génome, l'objectif est de provoquer une perturbation et un knock-out de gènes. [ citation requise ]

Bibliothèques de sgRNA Modifier

Construire une bibliothèque Modifier

Pour effectuer des knock-outs CRISPR à l'échelle du génome, des collections de sgRNA connues sous le nom de bibliothèques de sgRNA, ou bibliothèques de knock-out CRISPR, doivent être générées. La première étape de la création d'une bibliothèque de sgRNA consiste à identifier les régions génomiques d'intérêt sur la base des règles de ciblage de sgRNA connues. [31] Par exemple, les sgRNA sont les plus efficaces pour cibler les régions codantes des gènes et non les UTR 5' et 3'. Les exons conservés sont des cibles attractives et la position par rapport au site de démarrage de la transcription doit être prise en compte. [31] Deuxièmement, tous les sites PAM possibles sont identifiés et sélectionnés. [31] L'activité sur et hors cible doit être analysée, tout comme la teneur en GC, et les étirements d'homopolymère doivent être évités. [31] L'endonucléase Cas9 la plus couramment utilisée, dérivée de Streptocoque pyogène, reconnaît une séquence PAM de NGG. [32]

De plus, des nucléotides spécifiques semblent être favorisés à des emplacements spécifiques. La guanine est fortement favorisée par rapport à la cytosine en position 20 juste à côté du motif PAM, et en position 16, la cytosine est préférée à la guanine. [33] Pour le nucléotide variable dans le motif NGG PAM, il a été montré que la cytosine est préférée et la thymine défavorisée. [33] Avec de tels critères pris en compte, la bibliothèque sgRNA est conçue informatiquement autour des sites PAM sélectionnés. [31] [33] [34]

Plusieurs sgRNA (au moins 4-6) doivent être créés contre chaque gène pour limiter la détection de faux positifs, et des sgRNA de contrôle négatif sans cible connue doivent être inclus. [31] [33] Les sgRNA sont ensuite créés par in situ synthèse, amplifié par PCR, et cloné dans un système de livraison de vecteur.

Bibliothèques existantes Modifier

Le développement d'une nouvelle bibliothèque de sgRNA est un processus laborieux et chronophage. En pratique, les chercheurs peuvent sélectionner une bibliothèque existante en fonction de leur objectif expérimental et des lignées cellulaires d'intérêt. En février 2020, les ressources les plus largement utilisées pour les écrans knock-out CRISPR à l'échelle du génome étaient les deux bibliothèques Genome-Scale CRISPR Knock-Out (GeCKO) créées par le laboratoire Zhang. [35] Disponibles via addgene, ces bibliothèques lentivirales ciblent respectivement les exons humains et de souris, et les deux sont disponibles sous forme de système à un vecteur (où les sgRNA et Cas9 sont présents sur le même plasmide) ou en tant que système à deux vecteurs (où le sgRNAs et Cas9 sont présents sur des plasmides séparés). Chaque bibliothèque est livrée sous forme de deux demi-bibliothèques, permettant aux chercheurs de cribler avec 3 ou 6 sgRNA/gène. [36]

Outre GeCKO, un certain nombre d'autres bibliothèques CRISPR ont été générées et mises à disposition via addgene. Les laboratoires Sabatini & Lander disposent actuellement de 7 bibliothèques distinctes pour l'homme et la souris, y compris des sous-bibliothèques ciblées pour des sous-groupes distincts tels que les kinases et les gènes ribosomiques (Addgene #51043-51048). De plus, des améliorations de la spécificité des ARNsg ont abouti à des bibliothèques de « deuxième génération », telles que les bibliothèques Brie (Addgene #73632) et Brunello (Addgene #73178) générées par les laboratoires Doench et Root, et la bibliothèque Toronto knockout (TKO). (Addgene #1000000069) généré par le laboratoire Moffat. [36]

Vecteurs lentiviraux Modifier

Le knock-out de gène ciblé à l'aide de CRISPR/Cas9 nécessite l'utilisation d'un système d'administration pour introduire le sgRNA et le Cas9 dans la cellule. Bien qu'un certain nombre de systèmes d'administration différents soient potentiellement disponibles pour CRISPR, [37] [38] les criblages de perte de fonction à l'échelle du génome sont principalement effectués à l'aide de vecteurs lentiviraux de troisième génération. [35] [39] [40] Ces vecteurs lentiviraux sont capables de transduire efficacement une large gamme de types de cellules et de s'intégrer de manière stable dans le génome des cellules en division et non en division. [41] [42] Les particules lentivirales de troisième génération sont produites en co-transfectant des cellules de rein embryonnaire humain (HEK) 293T avec :

  1. deux plasmides d'encapsidation, l'un codant pour Rev et l'autre Gag et Pol
  2. un plasmide d'enveloppe interchangeable qui code pour une glycoprotéine d'enveloppe d'un autre virus (le plus souvent la protéine G du virus de la stomatite vésiculeuse (VSV-G))
  3. un ou deux (selon la bibliothèque appliquée) plasmides de transfert, codant pour Cas9 et sgRNA, ainsi que des marqueurs de sélection. [35][43][44]

Le surnageant contenant des particules lentivirales est récolté, concentré et ensuite utilisé pour infecter les cellules cibles. [45] Le protocole exact pour la production de lentiviraux variera en fonction du but de la recherche et de la bibliothèque appliquée. [35] [43] [44] Si un système à deux vecteurs est utilisé, par exemple, les cellules sont séquentiellement transduites avec Cas9 et sgRNA dans une procédure en deux étapes. [35] [44] Bien que plus complexe, cela a l'avantage d'un titre plus élevé pour le virus de la bibliothèque sgRNA. [35]

Sélection phénotypique Modifier

En général, il existe deux formats différents d'écrans knock-out CRISPR à l'échelle du génome : en réseau et en pool. Dans un écran en réseau, chaque puits contient un sgRNA spécifique et connu ciblant un gène spécifique. [46] Étant donné que le sgRNA responsable de chaque phénotype est connu en fonction de l'emplacement du puits, les phénotypes peuvent être identifiés et analysés sans nécessiter de séquençage génétique. Ce format permet la mesure de phénotypes cellulaires plus spécifiques, peut-être par fluorescence ou luminescence, et permet aux chercheurs d'utiliser plus de types de bibliothèques et de méthodes de livraison. [46] Pour les écrans LOF à grande échelle, cependant, les formats en réseau sont considérés comme peu efficaces et coûteux en termes de ressources financières et matérielles, car les populations cellulaires doivent être isolées et cultivées individuellement. [46]

Dans un criblage groupé, les cellules cultivées dans un seul récipient sont transduites en masse avec des vecteurs viraux contenant collectivement l'ensemble de la bibliothèque sgRNA. Pour s'assurer que la quantité de cellules infectées par plus d'une particule contenant du sgRNA est limitée, une faible multiplicité d'infection (MOI) (généralement 0,3-0,6) est utilisée. [46] [47] Les preuves jusqu'à présent ont suggéré que chaque sgRNA devrait être représenté dans un minimum de 200 cellules. [48] ​​[23] Les cellules transduites seront sélectionnées, suivies d'une sélection positive ou négative pour le phénotype d'intérêt, et le séquençage génétique sera nécessaire pour identifier les sgRNA intégrés. [46]

Séquençage de nouvelle génération et analyse des hits Modifier

Suite à la sélection phénotypique, l'ADN génomique est extrait des clones sélectionnés, aux côtés d'une population de cellules témoins. [23] [46] [49] Dans les protocoles les plus courants pour les knock-outs à l'échelle du génome, une « bibliothèque de séquençage de nouvelle génération (NGS) » est créée par une réaction en chaîne par polymérase (PCR) en deux étapes. [23] [46] La première étape amplifie la région sgRNA, en utilisant des amorces spécifiques à la séquence d'intégration lentivirale, et la deuxième étape ajoute les séquences Illumina i5 et i7. [23] Le NGS des produits PCR permet d'identifier les sgRNA récupérés, et une étape de quantification peut être utilisée pour déterminer l'abondance relative de chaque sgRNA. [23]

La dernière étape du criblage consiste à évaluer par ordinateur les sgRNA significativement enrichis ou appauvris, à les retracer jusqu'à leurs gènes correspondants et à déterminer à leur tour quels gènes et quelles voies pourraient être responsables du phénotype observé. Plusieurs algorithmes sont actuellement disponibles à cette fin, le plus populaire étant la méthode d'analyse basée sur le modèle de la méthode CRISPR/Cas9 Knockout (MAGeCK) à l'échelle du génome. [50] Développé spécifiquement pour les écrans knock-out CRISPR/Cas9 en 2014, MAGeCK a démontré de meilleures performances par rapport aux algorithmes alternatifs de l'époque, [50] et a depuis démontré des résultats robustes et une sensibilité élevée dans différentes conditions expérimentales. [51] À partir de 2015, l'algorithme MAgeCK a été étendu pour introduire des mesures de contrôle de la qualité et tenir compte de l'efficacité de knock-out des sgRNA auparavant négligée. [51] Un outil de visualisation basé sur le Web (VISPR) a également été intégré, permettant aux utilisateurs d'explorer de manière interactive les résultats, l'analyse et les contrôles de qualité. [51]

Mécanismes de signalisation cellulaire Modifier

Au cours des dernières années, l'écran CRISPR à l'échelle du génome est devenu un outil puissant pour étudier les réseaux complexes de signalisation cellulaire. [52] La signalisation cellulaire est essentielle pour un certain nombre de processus biologiques fondamentaux, y compris la croissance cellulaire, la prolifération, la différenciation et l'apoptose.

Un exemple pratique est l'identification des gènes requis pour la signalisation proliférative dans les cellules cancéreuses. Les cellules sont transduites avec une banque d'ARNsg CRISPR et étudiées pour leur croissance dans le temps. En comparant l'abondance d'ARNsg dans des cellules sélectionnées à un contrôle, on peut identifier quels ARNsg sont épuisés et à leur tour quels gènes peuvent être responsables du défaut de prolifération. De tels criblages ont été utilisés pour identifier les gènes essentiels au cancer dans la leucémie myéloïde aiguë [53] et le neuroblastome, [54] et pour décrire les différences spécifiques aux tumeurs entre les lignées cellulaires cancéreuses. [55]

Identifier les partenaires létaux synthétiques Modifier

Les thérapies ciblées contre le cancer sont conçues pour cibler des gènes, des protéines ou des environnements spécifiques contribuant à la croissance ou à la survie des cellules tumorales. Après une période de traitement prolongé avec ces thérapies, cependant, les cellules tumorales peuvent développer une résistance. Bien que les mécanismes à l'origine de la résistance aux médicaments anticancéreux soient mal compris, les causes potentielles comprennent : l'altération de la cible, la dégradation des médicaments, l'échappement de l'apoptose et les altérations épigénétiques. [56] La résistance est bien connue et pose un problème sérieux dans la gestion du cancer. [ citation requise ]

Pour surmonter ce problème, un partenaire létal synthétique peut être identifié. Les cribles LOF à l'échelle du génome utilisant CRISPR-Cas9 peuvent être utilisés pour rechercher des partenaires létaux synthétiques. [57] Pour cela, une lignée cellulaire de type sauvage et une lignée cellulaire tumorale contenant la mutation provoquant la résistance sont transduites avec une bibliothèque d'ARNsg CRISPR. Les deux lignées cellulaires sont cultivées et toutes les cellules sous-représentées ou mortes sont analysées pour identifier les gènes partenaires létaux synthétiques potentiels. Une étude récente de Hinze et al. (2019) [58] ont utilisé cette méthode pour identifier une interaction létale synthétique entre le médicament de chimiothérapie asparaginase et deux gènes de la voie de signalisation Wnt NKD2 et LGR6.

Facteurs de dépendance à l'hôte pour l'infection virale Modifier

En raison de leur petit génome et de leur nombre limité de protéines codées, les virus exploitent les protéines hôtes pour l'entrée, la réplication et la transmission. L'identification de telles protéines hôtes, également appelées facteurs de dépendance à l'hôte (HDF), est particulièrement importante pour identifier des cibles thérapeutiques. Au cours des dernières années, de nombreux groupes ont utilisé avec succès CRISPR/Cas9 à l'échelle du génome comme stratégie de dépistage des HDF dans les infections virales. [59]

Un exemple est fourni par Marceau et al. (2017), [60] qui visaient à disséquer les facteurs de l'hôte associés à la dengue et à l'infection à l'hépatite C (VHC) (deux virus de la famille Flaviviridae). ELAVL1, une protéine de liaison à l'ARN codée par le gène ELAVL1, s'est avérée être un récepteur critique pour l'entrée du VHC, et une divergence remarquable dans les facteurs de dépendance à l'hôte a été démontrée entre les deux flaviviridae. [60]

Autres applications Modifier

D'autres applications rapportées des criblages CRISPR à l'échelle du génome comprennent l'étude de : métabolisme mitochondrial, [61] résistance aux toxines bactériennes, [62] facteurs génétiques des métastases, [63] résistance aux médicaments contre le cancer, [64] mort cellulaire induite par le virus du Nil occidental, [65] et les réseaux de gènes des cellules immunitaires. [66] [67]

Cette section traitera spécifiquement des écrans CRISPR à l'échelle du génome. Pour un examen des limites de CRISPR, voir Lino et al. (2018) [38]

La bibliothèque sgRNA Modifier

Les écrans CRISPR à l'échelle du génome seront finalement limités par les propriétés de la bibliothèque de sgRNA choisie. Chaque bibliothèque contiendra un ensemble différent de sgRNA, et la couverture moyenne par gène peut varier. Les bibliothèques actuellement disponibles ont tendance à être biaisées vers les ARNsg ciblant les exons codant pour les protéines précoces (5'), plutôt que ceux ciblant les domaines protéiques plus fonctionnels. [58] Ce problème a été mis en évidence par Hinze et al. (2019), [58] qui ont noté que les gènes associés à la sensibilité à l'asparaginase n'ont pas réussi à marquer dans leur criblage à l'échelle du génome des cellules leucémiques résistantes à l'asparaginase.

Si une bibliothèque appropriée n'est pas disponible, la création et l'amplification d'une nouvelle bibliothèque sgRNA est un processus long qui peut prendre plusieurs mois. Les défis potentiels comprennent : (i) une conception efficace des sgRNA (ii) assurer une couverture complète des sgRNA dans tout le génome (iii) la conception du squelette du vecteur lentiviral (iv) produire des quantités suffisantes de lentivirus de haute qualité (v) surmonter une faible efficacité de transformation (vi) une mise à l'échelle appropriée de la culture bactérienne. [68]

Maintien de la couverture sgRNA cellulaire Modifier

L'un des plus grands obstacles au criblage CRISPR à l'échelle du génome est d'assurer une couverture adéquate de la bibliothèque de sgRNA à travers la population cellulaire. [23] Les preuves jusqu'à présent ont suggéré que chaque sgRNA devrait être représenté et maintenu dans un minimum de 200-300 cellules. [23] [48]

Considérant que le protocole standard utilise une multiplicité d'infection de

0,3, et une efficacité de transduction de 30 à 40 % [44] [23] le nombre de cellules nécessaires pour produire et maintenir une couverture appropriée devient très important. A titre d'exemple, la bibliothèque de sgRNA humain la plus populaire est la bibliothèque GeCKO v2 créée par le laboratoire Zhang [30] elle contient 123 411 sgRNA. Les études utilisant cette bibliothèque transduisent couramment plus de 1x10 8 cellules [58] [59] [69]

Comme CRISPR continue de présenter un faible bruit et des effets hors cible minimes, une stratégie alternative consiste à réduire le nombre de sgRNA par gène pour un criblage primaire. Des seuils moins stricts sont utilisés pour la sélection des hits, et des sgRNA supplémentaires sont ensuite utilisés dans un criblage secondaire plus spécifique. Cette approche est démontrée par Doench et al. (2016), [33] qui ont constaté que >92% des gènes récupérés à l'aide du protocole standard ont également été récupérés en utilisant moins d'ARNsg par gène. Ils suggèrent que cette stratégie pourrait être utile dans les études où la mise à l'échelle est d'un coût prohibitif. [ citation requise ]

Limitations lentivirales Modifier

Les vecteurs lentiviraux ont certaines limitations générales. D'une part, il est impossible de contrôler où le génome viral s'intègre dans le génome hôte, et cela peut affecter des fonctions importantes de la cellule. Vannucci et al. [70] fournissent une excellente revue des vecteurs viraux ainsi que de leurs avantages et inconvénients généraux. Dans le contexte spécifique des criblages CRISPR à l'échelle du génome, la production et la transduction des particules lentivirales est relativement laborieuse et prend du temps, prenant environ deux semaines au total. [44] De plus, parce que l'ADN s'intègre dans le génome de l'hôte, la livraison lentivirale conduit à une expression à long terme de Cas9, conduisant potentiellement à des effets hors cible. [ citation requise ]

Écrans en réseau ou en pool Modifier

Dans un écran en réseau, chaque puits contient un sgRNA spécifique et connu ciblant un gène spécifique. Les écrans en réseau permettent donc un profilage détaillé d'une seule cellule, mais sont limités par les coûts élevés et le travail requis pour isoler et cultiver le nombre élevé de populations de cellules individuelles. [46] Les écrans CRISPR groupés conventionnels sont relativement simples et rentables à réaliser, mais sont limités à l'étude de la population cellulaire entière. Cela signifie que les phénotypes rares peuvent être plus difficiles à identifier, et seuls les phénotypes bruts peuvent être sélectionnés pour, par ex. la survie cellulaire, la prolifération ou l'expression du gène rapporteur. [ citation requise ]

Médias culturels Modifier

Le choix du milieu de culture pourrait affecter la pertinence physiologique des résultats des expériences de culture cellulaire en raison des différences dans la composition et les concentrations en nutriments. [71] Un biais systématique dans les ensembles de données générés a été récemment montré pour les écrans de silençage des gènes CRISPR et ARNi (en particulier pour les gènes métaboliques), [72] et pour le profilage métabolique des lignées cellulaires cancéreuses. [71] Par exemple, une plus forte dépendance à l'ASNS (asparagine synthétase) a été trouvée dans les lignées cellulaires cultivées en DMEM, qui manque d'asparagine, par rapport aux lignées cellulaires cultivées en RPMI ou F12 (contenant de l'asparagine). [72] Éviter un tel biais pourrait être réalisé en utilisant un milieu uniforme pour toutes les lignées cellulaires criblées, et idéalement, en utilisant un milieu de croissance qui représente mieux les niveaux physiologiques de nutriments. Récemment, des types de milieux tels que Plasmax [73] et Human Plasma Like Medium (HPLM), [74] ont été développés.

CRISPR + RNA-seq à cellule unique Modifier

Les technologies émergentes visent à combiner des écrans CRISPR groupés avec la résolution détaillée du séquençage d'ARN monocellulaire massivement parallèle (RNA-seq). Des études utilisant « CRISP-seq », [75] « CROP-seq », [76] et « PERTURB-seq » [77] ont démontré des lectures génomiques riches, identifiant avec précision les signatures d'expression génique pour les knock-outs de gènes individuels dans un pool complexe de cellules . Ces méthodes ont l'avantage supplémentaire de produire des profils transcriptionnels des cellules induites par le sgRNA. [ citation requise ]


Protocoles pour l'édition du génome CRISPR dans votre système modèle

Vous recherchez des protocoles d'édition du génome CRISPR ? Découvrez notre bibliothèque croissante de protocoles et de méthodes utilisateur. Nous avons peut-être ce dont vous avez besoin pour commencer. Et, si vous disposez d'un nouveau protocole d'utilisation de l'ARN et/ou des nucléases Alt-R CRISPR, découvrez comment le partager avec la communauté des chercheurs.

La recherche sur les applications utilisant les systèmes CRISPR-Cas pour l'édition du génome se développe rapidement. Cela présente un besoin de réactifs et de protocoles efficaces pour une grande variété de systèmes modèles au-delà des cellules cultivées de mammifères.

Avantages des ARN et protéines Alt-R CRISPR pour l'édition du génome

ARN guide CRISPR. Utilisez les ARN Alt-R CRISPR pour diriger une édition puissante et ciblée du génome. Ces ARN à longueur optimisée sont synthétisés chimiquement, ce qui permet l'ajout de modifications pour une résistance accrue aux nucléases et une réduction des réponses immunitaires innées.

Protéines CRISPR. Choisissez parmi plusieurs variantes recombinantes de Cas9 (Streptocoque pyogène), ainsi que Cpf1 (Acidaminococcus sp. BV3L6) endonucleases. Alt-R S.p. Cas9 Nuclease 3NLS is suitable for most genome editing studies. Some experiments may benefit from use of Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease, a high-fidelity nuclease that has been engineered to reduce off-target effects while retaining the on-target potency of wild-type Cas9. Alt-R A.s. Cpf1 Nuclease 2NLS provides additional genome editing target sites, because it recognizes an AT-rich protospacer adjacent motif (PAM) rather than the CG-rich Cas9 PAM sequence.

If you are interested in knock-in experiments or other applications requiring homology-directed repair (HDR), consider using an Alt-R Cas9 nickase to create single-strand breaks. Use of a nickase variant with a pair of guide RNAs reduces off-target effects by requiring specific binding of 2 ribonucleoproteins (RNPs), and promotes homology-directed repair, in part, by creating overhanging DNA breaks. However, you will need 2 potent CRISPR target sites at an appropriate distance from your HDR target site.

Alt-R CRISPR RNPs. While the Alt-R CRISPR RNAs are compatible with CRISPR proteins from any source (e.g., cells that stably express CRISPR protein, or CRISPR proteins expressed from DNA or mRNA constructs), we recommend delivery of CRISPR reagents as RNPs by lipofection (e.g., Figure 1), electroporation, or microinjection. Cas9 RNPs are compatible with all 3 methods however, for Cpf1 RNPs, we recommend electroporation and microinjection delivery methods.

Advantages of using Alt-R RNPs include:

  • Efficient, on-target genome editing
  • Precise control of editing complex delivery&mdashcells will not contain templates that express unregulated levels of CRISPR RNAs or endonucleases
  • Lower activation of cellular immune responses and, therefore, reduced toxicity&mdashtoxicity is often observed when using in vitro transcribed Cas9 mRNA or single guide RNAs (sgRNA)

Protocols and starting points are increasingly available

IDT scientists have developed detailed lipofection and electroporation protocols for using the Alt-R CRISPR-Cas9 System and the Alt-R CRISPR-Cpf1 System in mammalian cells (Table 1). With help from our collaborators, we also make user-submitted methods available for genome editing in other model systems. These protocols and methods are a good starting point for protocol optimization for your studies, and often offer tips for all aspects of genome editing experiments, from growth conditions through genome editing detection.


Accurate evaluation of CRISPR genome editing

Credit: Unsplash/CC0 Public Domain

CRISPR technology allows researchers to edit genomes by altering DNA sequences and by thus modifying gene function. Its many potential applications include correcting genetic defects, treating and preventing the spread of diseases and improving crops.

Genome editing tools, such as the CRISPR-Cas9 technology, can be engineered to make extremely well-defined alterations to the intended target on a chromosome where a particular gene or functional element is located. However, one potential complication is that CRISPR editing may lead to other, unintended, genomic changes. These are known as off-target activity. When targeting several sites in the genome, off-target activity can lead to translocations, unusual rearrangement of chromosomes, as well as other unintended genomic modifications.

Controlling off-target editing activity is one of the central challenges in making CRISPR-Cas9 technology accurate and applicable in medical practice. Current measurement assays and data analysis methods for quantifying off-target activity do not provide statistical evaluation, are not sufficiently sensitive in separating signal from noise in experiments with low editing rates, and require cumbersome efforts to address the detection of translocations.

In the May 24th issue of the journal Communication Nature, a multidisciplinary team of researchers from the Interdisciplinary Center Herzliya and Bar-Ilan University report the development of a new software tool to detect, evaluate and quantify off-target editing activity, including adverse translocation events that can cause cancer. The software is based on input taken from a standard measurement assay, involving multiplexed PCR amplification and Next-Generation Sequencing (NGS).

Known as CRISPECTOR, the tool analyzes next generation sequencing data obtained from CRISPR-Cas9 experiments, and applies statistical modeling to determine and quantify editing activity. CRISPECTOR accurately measures off-target activity at every interrogated locus. It further enables better false-negative rates in sites with weak, yet significant off-target activity. Importantly, one of the novel features of CRISPECTOR is its ability to detect adverse translocation events occurring in an editing experiment.

"In genome editing, especially for clinical applications, it is critical to identify low level off-target activity and adverse translocation events. Even a small number of cells with carcinogenic potential, when transplanted into a patient in the context of gene therapy, can have detrimental consequences in terms of cancer pathogenesis. As part of treatment protocols, it is therefore important to detect these potential events in advance," says Dr. Ayal Hendel, of Bar-Ilan University's Mina and Everard Goodman Faculty of Life Sciences.

Dr. Hendel led the study, together with Prof. Zohar Yakhini of the Arazi School of Computer Science at Interdisciplinary Center (IDC) Herzliya. "CRISPECTOR provides an effective method to characterize and quantify potential CRISPR-induced errors, thereby significantly improving the safety of future clinical use of genome editing." Hendel's team used CRISPR-Cas9 technology to edit genes in stem cells relevant to disorders of the blood and the immune system. In the process of analyzing the data, they became aware of the shortcomings of the existing tools for quantifying off-target activity and of gaps that should be bridged to improve applicability. This experience led to the collaboration with Prof Yakhini's leading computational biology and bioinformatics group.

Prof. Zohar Yakhini, of IDC Herzliya and the Technion, says, "In experiments utilizing deep-sequencing techniques that have significant levels of background noise, low levels of true off-target activity can get lost under the noise. The need for a measurement approach and related data analysis that are capable of seeing beyond the noise, as well as of detecting adverse translocation events occurring in an editing experiment, is evident to genome editing scientists and practitioners. CRISPECTOR is a tool that can sift through the background noise to identify and quantify true off-target signals. Moreover, using statistical modeling and careful analysis of the data, CRISPECTOR can also identify a wider spectrum of genomic aberrations. By characterizing and quantifying potential CRISPR-induced errors our methods will support the safer clinical use of genome editing therapeutic approaches."


New, rapid CRISPR/Cas9 method identifies key genes in zebrafish spinal cord regeneration

A new, rapid screening approach uses CRISPR/Cas9 technology to identify immune system-related genes that play a crucial role in repairing zebrafish spinal cord injuries. Marcus Keatinge and Themistoklis Tsarouchas of the University of Edinburgh, U.K., and colleagues present these findings in the open-access journal PLOS Genetics.

In humans and other mammals, severed spinal-cord nerve connections do not heal, so a spinal cord injury may lead to permanent paralysis. In contrast, zebrafish are capable of recovering from spinal cord injury in a process that involves inflammation controlled by macrophages -- a type of immune system cell. However, the precise process by which macrophages aid spinal cord regeneration in zebrafish remains mysterious.

To help clarify this process, Keatinge, Tsarouchas and colleagues developed a new method for rapidly identifying macrophage-related genes that are involved in zebrafish spinal cord regeneration. The strategy employs CRISPR/Cas9 technology, which enables researchers to target and disrupt specific genes, thereby revealing their function. Molecules known as synthetic RNA Oligo CRISPR guide RNAs (sCrRNAs) enable this gene-specific targeting.

The researchers applied the new method to study spinal cord regeneration in larval zebrafish. Key to the method was a prescreening step in which they tested over 350 sCrRNAs that target genes already known to potentially play an important role in inflammation-related spinal cord regeneration. Introducing these sCrRNAs to the zebrafish enabled identification 10 genes that, when disrupted, impaired recovery from spinal cord injury.

Further analysis narrowed the list to four genes that appear to be crucial for repair of severed spinal nerve connections, validating the novel method. One gene in particular, tgfb1, appears to play an essential signaling role in controlling inflammation during the recovery process.

The new method and findings could help deepen understanding of spinal cord regeneration in zebrafish. The researchers also say the method could be adapted to screen for genes that play important roles in other biological processes, as well.

The authors add, "Zebrafish can fully regenerate their spinal cords after injury. Using a new and very rapid screening platform, we discover genes of the immune system that are essential for regeneration. We envision our findings to lead to new insights into the inability of mammals to regenerate and our versatile screening platform to be adapted to other disease or injury models in zebrafish."


Institut Large

The ability to precisely edit the genome of a living cell holds enormous potential to accelerate life science research, improve biotechnology, and even treat human disease.

Methods for genome editing — primarily zinc finger nucleases and Transcription Activator-Like Effector (TALE) Nucleases — have existed for several years, but in 2013 these were quickly eclipsed by the efficiency, effectiveness and precision of the engineered CRISPR-Cas9 system that was first harnessed for mammalian genome editing by Feng Zhang of the Broad Institute and MIT.

The CRISPR system

Like zinc fingers and TALEs, CRISPR systems are natural products. However, CRISPR-Cas differs from zinc fingers and TALEs in one crucial aspect that makes it superior for genome editing applications: whereas zinc fingers and TALEs bind to DNA through a direct protein-DNA interaction, requiring the protein to be redesigned for each new target DNA site, CRISPR-Cas achieves target specificity through a small RNA that can easily be swapped for other RNAs targeting new sites.

In nature, CRISPR-Cas systems help bacteria defend against attacking viruses (known as bacteriophage or just phage). They consist of two components, the CRISPR (clustered, regularly interspaced palindromic repeats) array and Cas (CRISPR-associated) proteins. CRISPR sequences bookend short stretches of DNA that bacteria have copied from invading phages, preserving a memory of the viruses that have attacked them in the past. These sequences are then transcribed into short RNAs that guide Cas proteins to matching viral sequences. The Cas proteins destroy the matching viral DNA by cutting it. There are a number of different types of CRISPR-Cas systems in nature, which vary in their components the CRISPR-Cas9 system uses just a single protein, Cas9, to find and destroy target DNA. In 2015, Zhang and colleagues successfully harnessed a second system, called CRISPR-Cpf1, which has the potential for even simpler and more precise genome engineering.

Engineering the CRISPR toolbox

In early 2011, Feng Zhang was just starting his own research group at the Broad Institute and MIT, where he is an investigator at the McGovern Institute for Brain Research and a faculty member in the departments of Brain and Cognitive Sciences and Biological Engineering. After learning about existing CRISPR research at a scientific meeting at the Broad, he quickly realized that the system, with a single RNA-guided protein, could be a game changer in genome editing technology. He was already working on DNA targeting methods, having helped to develop the TALE system as a Junior Fellow at Harvard. This system could target and activate genes in mammalian genomes.

Zhang and his team focused on harnessing CRISPR-Cas9 for use in human cells. In January 2013, he reported the first successful demonstration of Cas9-based genome editing in human cells in what has become the most-cited CRISPR paper (Cong et al., Science, 2013). Researchers from George Church’s lab at Harvard University reported similar findings in the same issue of Science (Mali et al., Science, 2013). The Zhang and Church papers showed that Cas9 could be targeted to a specific location in the human genome and cut the DNA there. The cut DNA was then repaired by inserting a new stretch of DNA, supplied by the researchers, essentially achieving “find and replace” functionality in the human genome.

In September, 2015, Zhang and partners described a different system, Cpf1, which appears to have significant implications for research and therapeutics. The Cpf1 system is simpler in that it requires only a single RNA. The Cpf1 enzyme is also smaller than the standard SpCas9, making it easier to deliver into cells and tissues.

Refining and sharing CRISPR tools

The CRISPR toolbox is continuing to expand rapidly, opening new avenues for biomedical research. Since the first publications in early 2013, the Zhang lab and other researchers have engineered a number of improvements to the system. For example, Cas9 has been modified so that instead of cutting the target DNA, it can turn gene expression on by recruiting transcriptional activators to its genomic location (Konermann, et al., Nature, 2014).

At the Broad Institute, the system has also been used for genome-wide screens to identify genes involved in resistance to cancer drugs and dissect immune regulatory networks. CRISPR has been used to rapidly create mouse models of cancer that arise from multiple gene alterations (Platt et al., Cell, 2014). In 2015, Zhang and his team reported success with Cas9 derived from a different bacterium, Staphylococcus aureus (SaCas9). SaCas9 is smaller than the original Cas9, which has advantages for gene therapy (Ran et al., Nature, 2015).

The Zhang lab has trained thousands of researchers in the use of CRISPR-Cas9 genome editing technology through direct education and by sharing more than 40,000 CRISPR-Cas9 components with academic laboratories around the world to help accelerate global research that will benefit human health. In September 2015, the Zhang lab also began to share Cpf1 components.

Users can obtain guide sequences for knock-outs and transcriptional activation as well as information about genome-wide libraries for CRISPR-based screening. The Zhang lab plasmids can be obtained via Addgene, a non-profit plasmid repository dedicated to improving life science research. Additional information about materials can be found on the Zhang laboratory website.


Transfect, enrich, screen, and publish—using our GeneArt CRISPR Nuclease Vector Kit. The CRISPR Nuclease system offers a ready-to-use, all-in-one expression vector system with a Cas9 nuclease expression cassette and a guide RNA cloning cassette for fast cloning of a target-specific crRNA. This system allows you to edit and engineer the genomic locus of your choice in a sequence-specific manner from a single plasmid. After relevant targets have been identified with GeneArt CRISPRs, the biologically-relevant mutations can be validated with GeneArt TALs to reduce potential off-targeting.

GeneArt CRISPR Nuclease Vector Kits are reporter vector systems for expression of the functional components needed for CRISPR-Cas genome editing. The kits make it easy to express noncoding guide RNA (including crRNA and tracrRNA), using a plasmid vector that also expresses Cas9 endonuclease.

The GeneArt CRISPR Nuclease Vector with OFP (orange fluorescent protein) for flow cytometry–based sorting of crRNA-expressing cell populations, whereas GeneArt CRISPR Nuclease Vector with CD4 enables bead-based enrichment of crRNA-expressing cells.

GeneArt CRISPR Nuclease Vectors. (UNE) GeneArt CRISPR Nuclease: OFP Reporter Plasmid map and features of GeneArt CRISPR Nuclease: OFP Reporter. The vector is supplied linearized between nucleotides 6,732 and 6,752, with 5 bp 5´ overhangs on each strand as indicated. (B) GeneArt CRISPR Nuclease: CD4 Enrichment Plasmid map and features of GeneArt CRISPR Nuclease: CD4 Enrichment. The vector is supplied linearized between nucleotides 7,336 and 7,355, with 5 bp 5´ overhangs on each strand as indicated. The linearized GeneArt CRISPR Nuclease Vectors provide a rapid and efficient way to clone double-stranded oligonucleotides encoding a crRNA representing a desired target into an expression cassette that allows sequence-specific targeting of the Cas9 nuclease.

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Once DNA fragments coding for CRISPR-Cas9 system components are cloned, the vector can be propagated within E. coli cells to generate sufficient quantities of your expression plasmid. We offer a variety of competent E. coli cells, selection of which depends upon the transformation method, and throughput of your experiment.

There are different methods to verify that your plasmid construct is correct, i.e. PCR, restriction digestion or sequencing. The choice depends on whether you are interested in determining if the plasmid contains your DNA insert, is the insert in the right orientation, or does the insert have the correct sequence. We provide molecular biology tools to implement any analysis method you may choose.



Commentaires:

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