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4.2 : Structure des virus - Biologie

4.2 : Structure des virus - Biologie



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4.2 : Structure des virus

Un atlas structuré des interactions homme-virus

Alors que la connaissance des interactions protéine-protéine (PPI) est essentielle pour comprendre les relations virus-hôte, les limitations de l'évolutivité des méthodes à haut débit ont entravé leur identification au-delà d'un certain nombre de virus bien étudiés. Ici, nous mettons en œuvre un cadre de calcul in silico (prédiction de l'interactome de l'hôte pathogène utilisant la similarité de structure [P-HIPSTer]) qui utilise des informations structurelles pour prédire ∼282 000 PPI panviraux-humains avec un taux de validation expérimentale de ∼76%. En plus de redécouvrir la biologie connue, P-HIPSTer a produit une série de nouvelles découvertes : la découverte d'une machinerie partagée et unique utilisée dans les virus infectant l'homme, un rôle probable des interactions ZIKV-ESR1 dans la modulation de la réplication virale, l'identification d'IPP qui faire la distinction entre les virus du papillome humain (VPH) à potentiel oncogène élevé et faible, et une histoire de pression sélective évolutive imposée sur le protéome humain. De plus, P-HIPSTer permet la découverte de circuits cellulaires auparavant méconnus qui agissent sur les virus infectant l'homme et donne un aperçu des virus expérimentalement intraitables.

Mots clés: évolution immunologie structure des protéines interactions protéine-protéine biologie des systèmes virologie.


4.2 : Structure des virus - Biologie

Les virus ne sont pas des plantes, des animaux ou des bactéries, mais ce sont les parasites par excellence des règnes vivants. Bien qu'ils puissent sembler être des organismes vivants en raison de leurs prodigieuses capacités de reproduction, les virus ne sont pas des organismes vivants au sens strict du terme.

Sans cellule hôte, les virus ne peuvent pas remplir leurs fonctions vitales ou se reproduire. Ils ne peuvent pas synthétiser de protéines, car ils manquent de ribosomes et doivent utiliser les ribosomes de leurs cellules hôtes pour traduire l'ARN messager viral en protéines virales. Les virus ne peuvent pas générer ou stocker d'énergie sous forme d'adénosine triphosphate (ATP), mais doivent tirer leur énergie, et toutes les autres fonctions métaboliques, de la cellule hôte. Ils parasitent également la cellule pour les matériaux de construction de base, tels que les acides aminés, les nucléotides et les lipides (graisses). Bien que les virus aient été supposés être une forme de protovie, leur incapacité à survivre sans organismes vivants rend hautement improbable qu'ils aient précédé la vie cellulaire au début de l'évolution de la Terre. Certains scientifiques pensent que les virus ont commencé comme des segments voyous du code génétique qui se sont adaptés à une existence parasitaire.

Tous les virus contiennent de l'acide nucléique, soit de l'ADN ou de l'ARN (mais pas les deux), et une enveloppe protéique qui enveloppe l'acide nucléique. Certains virus sont également entourés d'une enveloppe de molécules de graisse et de protéines. Sous sa forme infectieuse, à l'extérieur de la cellule, une particule virale est appelée virion. Chaque virion contient au moins une protéine unique synthétisée par des gènes spécifiques dans son acide nucléique. Les viroïdes (ce qui signifie « ressemblant à un virus ») sont des organismes pathogènes qui ne contiennent que de l'acide nucléique et n'ont pas de protéines structurelles. D'autres particules pseudo-virales appelées prions sont principalement composées d'une protéine étroitement intégrée à une petite molécule d'acide nucléique.

Les virus sont généralement classés par les organismes qu'ils infectent, les animaux, les plantes ou les bactéries. Étant donné que les virus ne peuvent pas pénétrer dans les parois cellulaires des plantes, pratiquement tous les virus des plantes sont transmis par des insectes ou d'autres organismes qui se nourrissent de plantes. Certains virus bactériens, tels que le bactériophage T4, ont développé un processus d'infection élaboré. Le virus a une "queue" qu'il attache à la surface de la bactérie au moyen d'"épingles" protéiniques. La queue se contracte et le bouchon de queue pénètre dans la paroi cellulaire et la membrane sous-jacente, injectant les acides nucléiques viraux dans la cellule. Les virus sont ensuite classés en familles et genres en fonction de trois considérations structurelles : 1) le type et la taille de leur acide nucléique, 2) la taille et la forme de la capside, et 3) s'ils ont une enveloppe lipidique entourant la nucléocapside (la capside acide nucléique inclus).

Il existe principalement deux types de formes parmi les virus : les bâtonnets, ou filaments, et les sphères. La forme du bâtonnet est due à l'arrangement linéaire de l'acide nucléique et des sous-unités protéiques constituant la capside. La forme de la sphère est en fait un polygone à 20 côtés (icosaèdre).

La nature des virus n'a été comprise qu'au XXe siècle, mais leurs effets ont été observés depuis des siècles. Le médecin britannique Edward Jenner a même découvert le principe de l'inoculation à la fin du XVIIIe siècle, après avoir observé que les personnes qui contractaient la variole bénigne étaient généralement immunisées contre la maladie plus mortelle de la variole. À la fin du XIXe siècle, les scientifiques savaient qu'un agent causait une maladie des plants de tabac, mais qu'il ne se développerait pas sur un support artificiel (comme les bactéries) et qu'il était trop petit pour être vu au microscope optique. Les progrès de la culture de cellules vivantes et de la microscopie au XXe siècle ont finalement permis aux scientifiques d'identifier les virus. Les progrès de la génétique ont considérablement amélioré le processus d'identification.

Capside - La capside est l'enveloppe protéique qui entoure l'acide nucléique avec son acide nucléique enfermé, elle s'appelle la nucléocapside. Cette coquille est composée de protéines organisées en sous-unités appelées capsomères. Ils sont étroitement associés à l'acide nucléique et reflètent sa configuration, soit une hélice en forme de bâtonnet, soit une sphère en forme de polygone. La capside a trois fonctions : 1) elle protège l'acide nucléique de la digestion par les enzymes, 2) contient des sites spéciaux à sa surface qui permettent au virion de se fixer à une cellule hôte, et 3) fournit des protéines qui permettent au virion de pénétrer dans l'hôte membrane cellulaire et, dans certains cas, d'injecter l'acide nucléique infectieux dans le cytoplasme de la cellule. Dans les bonnes conditions, l'ARN viral dans une suspension liquide de molécules protéiques s'auto-assemblera une capside pour devenir un virus fonctionnel et infectieux.

Enveloppe - De nombreux types de virus ont une enveloppe glycoprotéique entourant la nucléocapside. L'enveloppe est composée de deux couches lipidiques entrecoupées de molécules protéiques (bicouche lipoprotéique) et peut contenir du matériel provenant de la membrane d'une cellule hôte ainsi que celui d'origine virale. Le virus obtient les molécules lipidiques de la membrane cellulaire au cours du processus de bourgeonnement viral. Cependant, le virus remplace les protéines de la membrane cellulaire par ses propres protéines, créant une structure hybride de lipides dérivés de cellules et de protéines dérivées de virus. De nombreux virus développent également des pointes constituées de glycoprotéines sur leurs enveloppes qui les aident à se fixer à des surfaces cellulaires spécifiques.

Acide nucléique - Tout comme dans les cellules, l'acide nucléique de chaque virus code l'information génétique pour la synthèse de toutes les protéines. Alors que l'ADN double brin est responsable de cela dans les cellules procaryotes et eucaryotes, seuls quelques groupes de virus utilisent l'ADN. La plupart des virus conservent toute leur information génétique avec l'ARN simple brin. Il existe deux types de virus à ARN. Dans la plupart des cas, l'ARN génomique est appelé brin plus car il agit comme un ARN messager pour la synthèse directe (traduction) de la protéine virale. Quelques-uns, cependant, ont des brins négatifs d'ARN. Dans ces cas, le virion possède une enzyme, appelée ARN polymérase ARN-dépendante (transcriptase), qui doit d'abord catalyser la production d'ARN messager complémentaire à partir de l'ARN génomique du virion avant que la synthèse des protéines virales puisse se produire.

Le virus de la grippe (grippe) - Après le rhume, la grippe ou "la grippe" est peut-être l'infection respiratoire la plus connue au monde. Aux États-Unis seulement, environ 25 à 50 millions de personnes contractent la grippe chaque année. Les symptômes de la grippe sont similaires à ceux du rhume, mais ont tendance à être plus graves. La fièvre, les maux de tête, la fatigue, la faiblesse et la douleur musculaires, les maux de gorge, la toux sèche et l'écoulement nasal ou la congestion nasale sont courants et peuvent se développer rapidement. Les symptômes gastro-intestinaux associés à la grippe sont parfois ressentis par les enfants, mais pour la plupart des adultes, les maladies qui se manifestent par la diarrhée, les nausées et les vomissements ne sont pas causées par le virus de la grippe, bien qu'elles soient souvent appelées à tort la « grippe intestinale ». Un certain nombre de complications, telles que l'apparition d'une bronchite et d'une pneumonie, peuvent également survenir en association avec la grippe et sont particulièrement fréquentes chez les personnes âgées, les jeunes enfants et toute personne dont le système immunitaire est affaibli.

Le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) - Le virus responsable du VIH a été isolé pour la première fois en 1983 par l'Américain Robert Gallo et le scientifique français Luc Montagnier. Depuis lors, une énorme quantité de recherches axées sur l'agent causal du SIDA a été effectuée et beaucoup a été appris sur la structure du virus et son mode d'action typique. Le VIH fait partie d'un groupe de virus atypiques appelés rétrovirus qui conservent leur information génétique sous forme d'acide ribonucléique ( ARN ). Grâce à l'utilisation d'une enzyme connue sous le nom de transcriptase inverse, le VIH et d'autres rétrovirus sont capables de produire de l'acide désoxyribonucléique (ADN) à partir de l'ARN, alors que la plupart des cellules effectuent le processus inverse, transcrivant le matériel génétique de l'ADN en ARN. L'activité de l'enzyme permet à l'information génétique du VIH de s'intégrer de façon permanente dans le génome (chromosomes) d'une cellule hôte.


Structure des virus : une brève histoire

Cette revue est un compte rendu partiellement personnel de la découverte de la structure du virus et de son implication pour la fonction du virus. Bien que je me sois efforcé de couvrir tous les aspects de la virologie structurelle et de reconnaître les personnes concernées, je sais que j'ai préféré prendre des exemples de ma propre expérience en racontant cette histoire. Je tiens à m'excuser auprès de tous ceux que j'ai pu offenser involontairement en omettant leur travail. La première connaissance de la structure du virus est le résultat des études de Stanley sur le virus de la mosaïque du tabac (TMV) et de l'analyse ultérieure de la diffraction des fibres aux rayons X par Bernal et Fankuchen dans les années 1930. À peu près au même moment, il est devenu évident que des cristaux de petits virus à ARN végétaux et animaux pouvaient diffracter les rayons X, démontrant que les virus doivent avoir des structures distinctes et uniques. Plus de progrès ont été réalisés dans les années 1950 avec la réalisation par Watson et Crick que les virus pourraient avoir une symétrie icosaédrique. Avec l'amélioration des techniques expérimentales et informatiques dans les années 1970, il est devenu possible de déterminer les structures tridimensionnelles de résolution quasi atomique de certains petits virus à ARN icosaédriques végétaux et animaux. Ce fut une grande surprise que les capsides protectrices des premières structures virales à déterminer aient la même architecture. Les protéines de capside de ces virus avaient toutes un repliement « en gelée » et, de plus, l'organisation de la protéine de capside dans le virus était similaire, suggérant un virus ancestral commun à partir duquel de nombreux virus d'aujourd'hui ont évolué. A cette époque, une structure plus détaillée du TMV avait également été établie, mais l'architecture et le repliement de la protéine de capside étaient assez différents de ceux des virus icosaédriques. Les petites structures du virus à ARN icosaédrique étaient également informatives sur la manière et l'emplacement des récepteurs cellulaires, des composés antiviraux et des anticorps neutralisants liés à ces virus. Cependant, les plus gros virus enveloppés d'une membrane lipidique n'ont pas formé de cristaux suffisamment ordonnés pour obtenir une bonne diffraction des rayons X. À partir des années 1990, ces virus enveloppés ont été étudiés en combinant la microscopie cryoélectronique du virus entier avec la cristallographie aux rayons X de leurs composants protéiques. Ces structures ont donné des informations sur l'assemblage du virus, la neutralisation du virus par les anticorps et la fusion du virus avec et l'entrée dans la cellule hôte. Les mêmes techniques ont également été employées dans l'étude de bactériophages complexes qui étaient trop gros pour cristalliser. Néanmoins, il restait encore de nombreux virus pléomorphes et hautement pathogènes qui n'avaient pas la symétrie et l'homogénéité icosaédriques qui avaient rendu possibles les premières investigations structurelles. Actuellement, certains de ces virus commencent à être étudiés en combinant cristallographie aux rayons X et cryotomographie.


Systèmes de classification antérieurs

Les virus ne contiennent que quelques éléments permettant de les classer : le génome viral, le type de capside et la structure de l'enveloppe des virus enveloppés. Tous ces éléments ont été utilisés dans le passé pour la classification virale (tableau 1 et figure 1). Les génomes viraux peuvent varier selon le type de matériel génétique (ADN ou ARN) et son organisation (simple ou double brin, linéaire ou circulaire, segmenté ou non segmenté). Dans certains virus, des protéines supplémentaires nécessaires à la réplication sont directement associées au génome ou contenues dans la capside virale.

Tableau 1. Classification des virus par structure et noyau du génome
Classifications de base Exemples
ARN Virus de la rage, rétrovirus
ADN Herpesvirus, virus de la variole
Simple brin Virus de la rage, rétrovirus
Double brin Herpesvirus, virus de la variole
Linéaire Virus de la rage, rétrovirus, virus de l'herpès, virus de la variole
Circulaire Papillomavirus, de nombreux bactériophages
Non segmenté : le génome est constitué d'un seul segment de matériel génétique Virus parainfluenza
Segmenté : le génome est divisé en plusieurs segments Virus de la grippe

Figure 1. Les virus sont classés en fonction de leur matériel génétique de base et de la conception de leur capside. (a) Le virus de la rage a un noyau d'ARN simple brin (ARNsb) et une capside hélicoïdale enveloppée, tandis que (b) le virus de la variole, l'agent causal de la variole, a un noyau d'ADN double brin (ADNdb) et une capside complexe. (crédit « rage diagram » : modification des travaux du CDC « rage micrograph » : modification des travaux du Dr Fred Murphy, CDC crédit « small vérole micrograph » : modification des travaux du Dr Fred Murphy, Sylvia Whitfield, CDC crédit « small vérole » photo » : modification du travail par les données de la barre d'échelle CDC de Matt Russell)

Les virus peuvent également être classés par la conception de leurs capsides (tableau 2 et figure 2). Les capsides sont classées en icosaédriques nus, icosaédriques enveloppés, hélicoïdaux enveloppés, hélicoïdaux nus et complexes. Le type de matériel génétique (ADN ou ARN) et sa structure (simple ou double brin, linéaire ou circulaire, segmenté ou non segmenté) sont utilisés pour classer les structures du noyau viral (tableau 2).

Tableau 2. Classification des virus par structure de capside
Classification de la capside Exemples
Icosaèdre nu Virus de l'hépatite A, poliovirus
Icosaèdre enveloppé Virus d'Epstein-Barr, virus de l'herpès simplex, virus de la rubéole, virus de la fièvre jaune, VIH-1
Enveloppé hélicoïdal Virus de la grippe, virus des oreillons, virus de la rougeole, virus de la rage
hélicoïdal nu Virus de la mosaïque du tabac
Complexe avec de nombreuses protéines, certaines ont des combinaisons de structures de capside icosaédriques et hélicoïdales Herpèsvirus, virus de la variole, virus de l'hépatite B, bactériophage T4

Figure 2. Les micrographies électroniques à transmission de divers virus montrent leurs structures. La capside du (a) virus de la polio est icosaédrique nue (b) la capside du virus d'Epstein-Barr est icosaédrique enveloppée (c) la capside du virus des oreillons est une hélice enveloppée (d) la capside du virus de la mosaïque du tabac est hélicoïdale nue et (e) la capside de l'herpèsvirus est complexe. (crédit a : modification du travail par Dr. Fred Murphy, Sylvia Whitfield crédit b : modification du travail par Liza Gross crédit c : modification du travail par Dr. FA Murphy, CDC crédit d : modification du travail par USDA ARS crédit e : modification des travaux de Linda Stannard, Département de microbiologie médicale, Université de Cape Town, Afrique du Sud, données de la barre d'échelle de la NASA de Matt Russell)


Méthodes

Alignement de séquence

Les séquences de nucléoprotéines, y compris le virus de Sendai (NP_056871,1 numéros d'accès ont été obtenus à partir de la base de données des protéines NCBI), le virus de la maladie de Newcastle (YP_009513194.1), le virus des oreillons (NP_054707), le virus Nipah (NP_112021.1), le virus Parainfluenza 5 (YP_138511.1 ) et le virus de la rougeole (NP_056918.1) ont été téléchargés à partir de PubMed au format FASTA. Geneious a été utilisé pour aligner les séquences 39 , et l' alignement a été affiché via ESPript 40 . La prédiction de la structure secondaire sur la queue N de la nucléoprotéine SeV a été réalisée dans PSIPRED 41 .

Les plasmides et l'expression des gènes

NPO a été cloné dans le plasmide pCAGGS avec une étiquette His 6x sur les extrémités C pour l'expression de la protéine dans des cellules de mammifère. NPO et ses dérivés avec deux balises His 6 × sur les deux extrémités N et C ont été synthétisés dans des plasmides pET28b pour l'expression génique dans Escherichia coli. Tous les plasmides ont été vérifiés par séquençage génique avant l'expression génique.

NPO dans le plasmide pCAGGS ont été transfectés dans des cellules HEK293F avec de la Lipofectamine 2000, lorsque la densité cellulaire a atteint 4 × 10 6 cellules/mL. Les cellules transfectées ont été cultivées à 37°C, 6% CO2, 180 tr/min pendant 3 jours supplémentaires, puis récolté par centrifugation à 1000 × g pendant 15 minutes.

NPO et ses mutants dérivés exprimés dans E. coli Des cellules BL21 (DE3) ont été utilisées pour l'expression de protéines à haut rendement. En détail, les cellules contenant les plasmides respectifs ont été cultivées dans des milieux LB à 37 °C jusqu'à ce que la DO600 atteigne 0,8. Les protéines cibles ont été induites avec 1 mM d'IPTG (isopropyl-β-d -1-thiogalactopyranoside) à 16°C, 220 rpm pendant 20 h. Les cellules ont été récoltées par centrifugation à 4680 × g pendant 20 min pour obtenir les culots cellulaires.

Isolement et purification des protéines

NPO dans HEK293F les cellules ont été lysées dans du tampon de lyse (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 5 mM β-Mercaptoéthanol et cocktail inhibiteur de protéase (Roche, USA)). Le lysat a été clarifié par centrifugation à 3200 × g pendant 20 minutes. Le surnageant a été chargé sur un double coussin de saccharose (90 % (p/v) de saccharose est inférieur à 20 % (p/v) de saccharose) et ultracentrifugé dans un rotor Beckman SW32 Ti à 130 000 ×g pendant 3h. Des fractions de 1 mL ont été collectées manuellement par ponction de fond, dont 10 L ont été soumis à une analyse western-blot. Les fractions contenant des nucléoprotéines ont été recueillies dans un tube de dialyse avec un seuil de poids moléculaire à 1 MDa, et dialysées pendant une nuit dans le tampon de lyse sans saccharose pour éliminer le saccharose. L'échantillon dialysé a été concentré et soumis à un autre cycle d'ultracentrifugation. Plus précisément, 1,5 ml de la protéine condensée a été chargé sur un gradient de saccharose continu de 25 à 60 % et a été centrifugé dans un rotor SW41 Ti à 160 000 × g pendant 4h. Les échantillons ont été automatiquement fractionnés par le collecteur Fraction FC-203B (Gilson, États-Unis) et les fractions contenant des nucléoprotéines ont été collectées sur la base d'un western-blot contre 6 × His-tag avant une dialyse pendant une nuit pour éliminer le saccharose. L'échantillon dialysé a été concentré et immédiatement appliqué à une préparation d'échantillon cryo-EM.

NPO et ses mutants dérivés exprimés dans E. coli ont été purifiés par affinité en tandem et chromatographie de filtration sur gel. Plus précisément, les cellules en culot ont été remises en suspension dans un tampon de lyse simplifié (20 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM de NaCl) et rompues via des homogénéisateurs à ultrasons (JNBIO, Chine). Après centrifugation à 47 850×g pendant 30 min, le surnageant a été chargé sur une colonne HisTrap TM HP de 5 mL (GE Healthcare LifeSciences, USA), pré-équilibrée avec un tampon de lyse simplifié. La colonne a été lavée avec 50 ml de tampon de lyse simplifié avec un gradient progressif d'imidazole à 20, 50 et 100 mM. Enfin, les protéines ont été éluées en utilisant un tampon de lyse simplifié contenant 500 mM d'imidazole. Les protéines ont été concentrées et chargées sur une colonne de chromatographie Superose 6 augmentation 10/300 GL de 24 ml (GE Healthcare Lifesciences, USA) prééquilibrée avec un tampon de lyse simplifié. Des fractions de 0,2 mL ont été recueillies, dont 10 L ont été soumis à une analyse SDS-PAGE.

Tous les échantillons de protéines ont été fraîchement préparés dans les tests suivants, sauf que N purifiéPO a été conservé à 4°C pendant 5 semaines pour le test de clivage.

Coloration négative EM

0,1 mg/mL) ont été appliqués à des grilles EM à décharge luminescente recouvertes d'une fine couche de film de carbone continu et colorées avec 2 % (p/v) d'acétate d'uranyle. Des grilles colorées négativement ont été imagées sur un MET Talos L120C (Thermo Fisher Scientific, USA) fonctionnant à 120 kV. Les images ont été enregistrées à un grossissement de ×73 000 et une défocalisation réglée à environ -2 m, à l'aide d'une caméra Ceta TM 16M (Thermo Fisher Scientific, USA).

Collecte de données cryo-EM

1 mg/mL) ont été appliqués à des grilles trouées à décharge luminescente R2/1 (Quantifoil, Ted Pella) avec une fine couche de film de carbone continu. Les grilles ont été buvardées à l'aide d'un Vitrobot Mark IV (ThermoFisher Scientific, USA) avec un temps de buvardage de 1 s, un niveau de force de 2 et une humidité de 100 % à 16 °C, immédiatement plongées dans de l'éthane liquide et conservées sous température d'azote liquide pendant future imagerie cryo-EM. Les grilles cryo-EM ont été examinées en mode faible dose sur un MET Talos L120C pour le criblage ou l'imagerie instantanée. Les clichés ont été pris avec un grossissement de ×73 000 et une défocalisation d'environ -2 m, à l'aide d'une caméra CetaTM 16 M.

Des collectes de données sur de bonnes grilles ont été réalisées sur deux microscopes Titan Krios : Titan Krios G 2 TEM (ThermoFisher Scientific, USA), équipé d'un détecteur d'électrons direct K2 Summit (Gatan, USA), qui a été utilisé en mode super-résolution avec un taille de pixel de 0,65 Titan Krios G 3je TEM (ThermoFisher Scientific, USA), équipé d'un détecteur d'électrons direct K3 BioQuantum (Gatan, USA), qui a été utilisé en mode super-résolution avec une taille de pixel de 0,53 Å. Un soin particulier a été pris pour effectuer un alignement sans coma sur les microscopes et les conditions de collecte de données détaillées ont été répertoriées dans le tableau 1. à l'analyse des données, séparément.

Traitement de données cryo-EM et reconstruction 3D

Avant le traitement de l'image, les images brutes ont été alignées et additionnées avec une pondération de dose sous MotionCor2.1 43 et les paramètres CTF ont été déterminés par CTFFIND-4 44 . Le traitement des images a été principalement effectué dans RELION 3.1 45, et différentes stratégies de reconstruction, y compris la reconstruction hélicoïdale et l'analyse de particules simples, ont été appliquées respectivement aux tiges hélicoïdales et aux assemblages en forme de palourde de la nucléocapside SeV à deux têtes. Les flux de travail détaillés pour la reconstruction hélicoïdale et l'analyse d'une seule particule après la classification bidimensionnelle sont présentés respectivement dans la Fig. 3 et la Fig. 6 supplémentaires.

Les particules en forme d'anneau ont été prélevées automatiquement dans RELION et les joints entre deux hélices dans chaque filament ont été prélevés manuellement en plus d'augmenter les vues latérales des structures en forme de palourde. Les jonques évidentes ont été exclues par classification 2D sans référence. Structure en forme de palourde NDV (EMDB, EMD-9793) 9 et la moitié de la palourde (une spirale à un seul tour) ont été filtrées passe-bas à 60 et choisies comme références pour les alignements de références multiples 3D. Seules les classes avec les structures entières en forme de palourde ont été sélectionnées pour un raffinement automatique 3D supplémentaire. Une carte 3D a été obtenue après raffinement 3D avec la double symétrie forcée, filtrée et affinée avec la session de post-traitement RELION. Une résolution globale a été estimée à 5,6 Å sur la base des critères de l'étalon-or de corrélation de Fourier Shell (FSC) 0,143.

La résolution locale de la structure 3D a été mesurée avec RELION, et les protomères plus éloignés de l'espace de la structure en forme de palourde sont bien mieux résolus que ceux plus proches de l'espace en raison de l'oscillation structurelle. Pour conserver suffisamment de signal pour un alignement précis, 5 paires de protomères consécutifs provenant de structures en forme de palourde, qui sont les plus éloignées de l'espace, ont été choisies pour un raffinement local. Pour tirer pleinement parti de la symétrie circulaire locale, le centre de la particule a été basculé sur chaque paire de protomères en tournant le centre d'un protomère plus loin en utilisant notre propre script. Ainsi, le nombre total de particules a été multiplié par cinq avec les angles d'Euler distribués. L'ensemble de particules élargi a été soumis à un raffinement 3D avec une recherche angulaire locale pour un alignement plus précis et un autre cycle de classification 3D sans alignement a été appliqué pour réduire l'hétérogénéité. Les particules des classes avec la meilleure résolution ont été soumises au raffinement 3D en se concentrant sur les cinq paires de protomères avec une recherche angulaire locale de ±6°. La reconstruction finale a été déterminée avec la résolution de 3,9 Å par l'étalon-or FSC 0,143 après polissage.

Les points de départ et d'arrivée des tiges hélicoïdales des nucléocapsides SeV à deux têtes sont spécifiés manuellement et les particules ont été extraites toutes les 7 unités asymétriques (environ 90 % de chevauchement) le long des hélices. Les jonques et les fragments incurvés ont été supprimés sur la base d'une classification 2D. Le modèle initial a été synthétisé à partir d'une spirale à un tour de structure en forme de palourde SeV, qui est filtrée en passe-bas à 30 pour la classification 3D. La symétrie hélicoïdale a été appliquée lors de la classification 3D et les classes ont été fusionnées en un ou plusieurs groupes, en fonction de leur montée hélicoïdale, de leur torsion et de leur résolution. Pour NCPO, des particules appartenant à différentes classes ont été respectivement soumises à un raffinement. Pour NCclivé, étant donné que la variation de montée et de torsion était dans une plage relativement étroite et que la distribution des particules entre les classes était instable au cours des itérations, seules les classes avec une résolution plus prometteuse ont été combinées et soumises à un raffinement et à un polissage bayésien. Les reconstructions finales ont été filtrées et affinées en session de post-traitement RELION. Les résolutions ont été déterminées par l'étalon-or FSC 0,143. La torsion et la montée hélicoïdales détaillées pour chaque ensemble de données sont répertoriées dans la figure supplémentaire 3.

Construction de modèles et analyse structurelle

Le modèle d'homologie de la nucléoprotéine SeV et de l'ARN a été généré par Modeller 46 en utilisant la structure cristalline de la nucléoprotéine du virus de la rougeole (RCSB, PDB-4UFT) comme matrice 6 . Le modèle pseudo-atomique de la nucléoprotéine SeV a été ancré de manière flexible dans la densité EM de NCclivé à la résolution de 2,9 Å en utilisant Rosetta 47 et le logiciel Flex-EM 48 . Les résidus (403–414) de la queue N ont été tracés manuellement et placés contre les densités de NCclivé et la trypsine clivée nucléocapside avec 403-408 mieux résolu avec Coot 49 . Le modèle atomique comprenant à la fois la nucléoprotéine et l'ARN a été optimisé pour un meilleur ajustement de la densité locale en utilisant le raffinement de l'espace réel dans Phenix 50. Le dernier SeV NCclivé le modèle atomique a été dupliqué pour construire le modèle atomique de SeV NCclivé tige hélicoïdale. Ce modèle atomique a également été amarré en tant que corps rigide à des tiges hélicoïdales et des structures en forme de palourde de nucléocapsides SeV à deux têtes à l'aide du package Chimera de l'Université de Californie à San Francisco 51 .

Les densités EM supplémentaires enveloppées entre NTD et CTD dans toutes les reconstructions ont été attribuées en tant qu'ARN et amarrées à l'aide de poly-Uracil dans Coot en raison de la liaison non spécifique de la nucléoprotéine à l'ARN 49 .

L'analyse structurelle, y compris la distribution électrostatique de surface et la superposition structurelle, a été réalisée dans UCSF Chimera 51 .

Dosage enzymatique de la trypsine

Les deux NPO et nF118A ont été traités avec de la trypsine pour tester la sensibilité. Un mélange de 40 L de NPO ou NF118A (1 mg/mL) avec de la trypsine (0,003 mg/mL) a été incubée à 4 °C et une fraction de 5 L a été prélevée pour l'analyse SDS-PAGE à 0, 3, 6, 10, 15, 120 et 240 min, respectivement . Quantification des bandes à

65, 50 et 35 kDa ont été analysés densitométriquement par CLIQS (TotalLab, UK).

Pour le dosage de la digestion trypsique sur NPO dans les mêmes conditions, d'autres fractions de 3 L ont été prélevées pour une analyse cryo-EM à 0, 6, 15 et 120 min, et 25 images ont été capturées au grossissement de × 57 000 pour chaque échantillon. Le nombre de nucléocapsides droites a été compté et le pourcentage de nucléocapsides droites parmi tous les filaments a été calculé à différents moments de digestion.

Nucléocapsides isolées du virion SeV

Le virion SeV de type sauvage a été propagé dans des œufs de poule embryonnés âgés de 9 jours, comme décrit 52 . Le liquide allantoïdien infecté par le SeV a été récolté et conservé à -80 °C jusqu'à utilisation.

Le liquide allantoïdien décongelé a été centrifugé pendant 15 min à 4000×g sous 4 °C pour éliminer les débris bruts. Le surnageant a été soumis à un autre cycle de centrifugation pendant 4 h à 48 000 ×g sous 4 ° C, et le culot résultant a été remis en suspension avec du tampon PBS (50 mM NaH2Bon de commande4, 50 mM de NaCl, pH 7,2), puis chargé sur la colonne à gradient de saccharose continu de 25 à 65 % (p/v). Après l'ultracentrifugation de 18 h à 150 000 g sous 4 °C, la couche visible a été collectée et dialysée pendant une nuit dans du tampon PBS pour éliminer le saccharose. La suspension de virions a été concentrée et lysée avec du Triton X-100 à 2 % (v/v) pendant 6 h sous 4 °C, dont 3,5 L ont été immédiatement appliqués à la préparation d'échantillons cryo-EM. 500 bonnes micrographies ont été collectées sur Titan Krios G 3je TEM (ThermoFisher Scientific, USA), équipé d'un détecteur direct d'électrons K3 BioQuantum (Gatan, USA),

Analyse de la longueur de persistance

Analyse de la longueur de persistance sur SeV NCPO et NCclivé a été réalisée dans ImageJ comme indiqué précédemment 53 . En bref, 200 filaments chacun ont été tracés à l'aide d'un plugin ImageJ, JFilament 54, et d'une analyse de longueur de persistance sur SeV NCPO et NCclivé ont été calculés dans ImageJ.

Résumé du rapport

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.


Criblage à haut débit

Ensuite, nous avons utilisé notre test de transfert d'énergie par résonance de fluorescence pour cribler une bibliothèque d'environ 10 000 composés, comprenant des médicaments approuvés, des candidats-médicaments d'essais cliniques et des produits naturels. Les principaux résultats étaient sept composés, y compris des médicaments approuvés (disulfirame et carmofur) ainsi que des candidats-médicaments précliniques ou cliniques (ebselen, shikonin, tideglusib, PX-12 et TDZD-8). Nous avons ensuite déterminé le CI50 les valeurs de ces sept composés, qui vont de 0,67 à 21,4 µM (Fig. 3). Ebselen a la plus forte inhibition de l'activité M pro, avec un IC50 de 0,67 µM. En utilisant un test à base de détergent décrit précédemment 25, nous avons constaté que TDZD-8 est un inhibiteur à base d'agrégats qui pourrait inhiber de manière non spécifique M pro (données étendues Fig. 5), il n'a donc pas été pris en compte pour une enquête plus approfondie. Ensuite, nous avons entrepris d'identifier les inhibiteurs covalents potentiels parmi ces composés grâce à une analyse par spectrométrie de masse en tandem. Les données de spectrométrie de masse en tandem montrent que l'ebselen, le PX-12 et le carmofur sont tous capables de se lier de manière covalente au C145 de la dyade catalytique dans le SARS-CoV-2 M pro. Cependant, le PX-12 et le carmofur ont complètement modifié M pro , alors que l'ebselen n'a pu modifier que partiellement cette cystéine de la protéase virale (Extended Data Fig. 6). Comme l'ebselen a un effet inhibiteur plus fort que les autres composés, il est possible qu'ebselen inhibe également M pro par une liaison non covalente. Il est probable qu'une partie des hits identifiés par criblage soient liés de manière covalente à la cystéine catalytique de M pro par l'intermédiaire de leurs groupes sulfhydryle. En général, on s'attend à ce que de telles molécules soient des liants de promiscuité et, par conséquent, en l'état actuel, peuvent avoir un potentiel limité en tant que médicaments principaux. Comme nos données structurelles sont basées sur N3, nous avons cherché à savoir si l'amarrage moléculaire pouvait prédire comment le disulfirame, le tideglusib et la shikonine se lient à cette protéine. Dans tous les cas, des poses d'amarrage raisonnables ont été trouvées, ce qui démontre qu'elles pouvaient tenir à l'intérieur de la poche de fixation du substrat (Extended Data Fig. 7).

uneF, L'activité hydrolytique du SARS-CoV-2 M pro a été mesurée en présence de concentrations croissantes des candidats médicaments. une, Ebselen. b, Disulfirame. c, Tideglusib. , Carmofur. e, Shikonine. F, PX-12. Courbes dose-réponse pour IC50 les valeurs ont été déterminées par régression non linéaire. Toutes les données sont affichées en moyenne ± s.e.m., m = 3 répétitions biologiques.


Remerciements

The authors thank Dr James Holder for figure 1une, Prof. Paul Hergenrother for the ADP-HPM, Dr Kang Zhu for practical assistance, J.H. and Dr Marcin Suskiewicz for critical reading of the manuscript, and Diamond Light Source for access to beamlines I03 (proposal numbers LB27001). Molecular graphics and analyses performed with UCSF Chimera, developed by the Resource for Biocomputing, Visualization and Informatics at the University of California, San Francisco, with support from NIH P41-GM103311.


Harnessing the Power of Viruses

Harnessing the Power of Viruses explores the application of scientific knowledge about viruses and their lives to solve practical challenges and further advance molecular sciences, medicine and agriculture. The book contains virus-based tools and approaches in the fields of: i) DNA manipulations in vitro and in vivo ii) Protein expression and characterization and iii) Virus- Host interactions as a platform for therapy and biocontrol are discussed. It steers away from traditional views of viruses and technology, focusing instead on viral molecules and molecular processes that enable science to better understand life and offer means for addressing complex biological phenomena that positively influence everyday life.

The book is written at an intermediate level and is accessible to novices who are willing to acquire a basic level of understanding of key principles in molecular biology, but is also ideal for advanced readers interested in expanding their biological knowledge to include practical applications of molecular tools derived from viruses.

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Viruses and Human Disease

Completely revised and updated, the new edition of this groundbreaking text integrates basic virology with pathophysiological conditions to examine the connection between virology and human disease. Most virology textbooks focus on the molecular biology involved without adequate reference to physiology. This text focuses on viruses that infect humans, domestic animals and vertebrates and is based on extensive course notes from James Strauss’ virology class at the California Institute of Technology taught for over 30 years. Expertly depicting in color the molecular structure and replication of each virus, it provides an excellent overview for students and professionals interested in viruses as agents of human disease.

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