Informations

Comment fonctionne la transformation par choc thermique ?

Comment fonctionne la transformation par choc thermique ?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Que se passe-t-il exactement lorsque des cellules compétentes comme DH5ɑ subissent un choc thermique avec de l'ADN présent ? Comment l'ADN pénètre-t-il dans les cellules ?

Concrètement, pourquoi toutes les étapes sont-elles nécessaires ? Et si vous subissiez un choc thermique juste après avoir ajouté de l'ADN ? Et si vous ne mettez pas de glace après un choc thermique ? A quoi sert le chlorure de calcium ? Que se passe-t-il réellement lorsque les cellules sont « compétentes » ? Qu'est-ce qui régit l'efficacité de la transformation (à part des choses évidentes comme la quantité d'ADN ou de cellules) ?

Pour bien comprendre de quoi je parle, j'utilise un protocole comme celui-ci :

  1. Sortir les cellules de -80C et décongeler sur de la glace pendant 5 min.
  2. Ajouter 1 ul (~ 500 ng) d'ADN plasmidique à 50 ul de cellules, mélanger doucement avec la pointe de la pipette.
  3. Laisser sur glace 30 min.
  4. Mettre au bain-marie à 42C pendant 45 secondes.
  5. Mettre sur de la glace pendant 10 min.
  6. Ajouter 950 ul LB, mettre à 37C pendant 1 heure.
  7. Étaler 300 ul de la culture sur des plaques de gélose LB avec une sélection appropriée.

J'obtiens généralement des milliers de colonies à partir de cela (en fait, une dilution au 1:10 ou au 1:100 est souvent nécessaire pour que je puisse réellement obtenir des colonies isolées). Même si je saute l'excroissance, j'en reçois toujours des centaines.

Je n'ai pas mon protocole cellulaire compétent, mais en gros, j'utilise ce chlorure de rubidium que tout le monde utilise : les cellules DH5ɑ sont lavées avec des tampons, mises en suspension dans une solution avec CaCl2 et RbCl, puis congelées dans de l'azote liquide. Je n'ai jamais réellement mesuré, mais généralement, la concentration de cellules dans les aliquotes congelées est environ 10 fois supérieure à celle d'une culture liquide d'une nuit (elles sont centrifugées et remises en suspension dans un petit volume).


La transformation par choc thermique altère la fluidité de la membrane créant des pores :

Une augmentation soudaine de la température crée des pores dans la membrane plasmique de la bactérie et permet à l'ADN plasmidique de pénétrer dans la cellule bactérienne.

Référence: Journal des expériences visualisées. Transformation bactérienne : la méthode du choc thermique. 2014. http://www.jove.com/science-education/5059/bacterial-transformation-the-heat-shock-method

Le changement de température altère la fluidité de l'état de membrane semi-cristalline atteint à 0oC permettant ainsi à la molécule d'ADN d'entrer dans la cellule à travers la zone d'adhésion.

Référence: Anh-Hue T. Tu. Transformation d'Escherichia coli rendue compétente par le protocole au chlorure de calcium. 2008-2013. Société américaine de microbiologie

… l'étape d'impulsion thermique (0 degrés C42 degrés C) de la procédure de transformation standard avait considérablement réduit la fluidité de la membrane externe des cellules. La diminution de la fluidité a été causée par la libération de lipides de la surface cellulaire vers le milieu extracellulaire. Un choc froid ultérieur (42 degrés C0 degrés C) aux cellules a augmenté la fluidité davantage à sa valeur d'origine et cela a été causé par la libération de protéines membranaires dans le milieu extracellulaire.

Référence: Panja S, Aich P, Jana B, Basu T. Comment l'ADN plasmidique pénètre-t-il les membranes cellulaires dans le processus de transformation artificielle d'Escherichia coli ? Mol. Membre Biol. 2008 août;25(5):411-22. doi: 10.1080/09687680802187765. PubMed PMID : 18651316.


Transformation par choc thermique. Comment ça fonctionne? - (Août/04/2008 )

Je ne trouve pas comment fonctionne la transformation de choc thermique. Il semble que personne ne le sache! Est-ce comme ça? Quelqu'un sait comment ça marche ? Je veux dire. J'aimerais connaître le mécanisme physique impliqué dans cette méthode.

Je ne peux pas trouver comment fonctionne la transformation de choc thermique. Il semble que personne ne le sache! Est-ce comme ça? Quelqu'un sait comment ça marche ? Je veux dire. J'aimerais connaître le mécanisme physique impliqué dans cette méthode.

J'aimerais aussi savoir comment fonctionne le choc thermique. Est-ce que quelqu'un connaît peut-être une source à ce sujet? J'ai parcouru des tonnes d'articles de recherche scientifique, et aucun n'a décrit le fonctionnement du choc thermique. La plupart d'entre eux viennent de parler du fait que cela augmente l'efficacité de la transformation. Puisque je veux écrire un essai, j'aurais besoin d'informations approfondies. Je suis déjà un peu désespéré.

AS mikkel
Ce serait génial si vous aviez une source à ce sujet.

J'ai également lu sur un gradient thermique qui aide les plasmides à entrer dans les cellules. Mais je ne peux tout simplement pas trouver une source qui dise comment cela fonctionne.

Voici comment je le comprends.

L'ajout du plasmide aux cellules sur de la glace fait adhérer le plasmide à la paroi cellulaire. Le choc thermique ouvre les pores (créés par la préparation de cellules compétentes) et fait entrer le plasmide dans la cellule. Placer les cellules sur de la glace après le choc ferme les pores et empêche le plasmide de s'échapper.

Voici comment je le comprends.

L'ajout du plasmide aux cellules sur de la glace fait adhérer le plasmide à la paroi cellulaire. Le choc thermique ouvre les pores (créés par la préparation de cellules compétentes) et fait entrer le plasmide dans la cellule. Placer les cellules sur de la glace après le choc ferme les pores et empêche le plasmide de s'échapper.

Cela ressemble beaucoup à ce que j'ai lu, et je pense que c'est plus ou moins la réponse.

Je suppose que cet article serait exactement le bon, malheureusement vous devez l'acheter. donc voici seulement le résumé :
abstrait

Si quelqu'un connaît un article similaire gratuit, veuillez le dire!

Salut Toulouse, merci beaucoup & je ferai tout ce que je peux pour obtenir ce papier. Si je le fais, je vous enverrai une copie pdf. Même ici, les bioforums pourraient être intéressés à obtenir le papier. alors merci encore.

Voici comment je le comprends.

L'ajout du plasmide aux cellules sur de la glace fait adhérer le plasmide à la paroi cellulaire. Le choc thermique ouvre les pores (créés par la préparation de cellules compétentes) et fait entrer le plasmide dans la cellule. Placer les cellules sur de la glace après le choc ferme les pores et empêche le plasmide de s'échapper.

Cela ressemble beaucoup à ce que j'ai lu, et je pense que c'est plus ou moins la réponse.

Je suppose que cet article serait exactement le bon, malheureusement, vous devez l'acheter. donc voici seulement le résumé :
abstrait


Autophagie induite par chaperon et maladie rénale

18.4.2 Accompagnateurs-Hsc70 et partenaires

Hsc70, ou Hsc73 dans certaines occasions, est un membre cytoplasmique hautement conservé de la famille Hsc70 [38] . Il représente environ 1% de la protéine intracellulaire totale. Les Hsc70 ont été confirmées avec de multiples rôles dans une grande variété de processus, notamment le repliement et le trafic de protéines intracellulaires [42,43] , le trafic d'antigènes, la présentation du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe II [44] , la dissociation de la clathrine et l'assemblage de protéines de vésicules enrobées [45,46] . Hsc70 a été confirmé comme le seul chaperon qui se lie directement au substrat CMA, un processus régulé par les changements de conformation alimentés par l'hydrolyse de l'ATP [26,47-49] . La forme de Hsc70 liée à l'ADP contient la plus grande affinité pour tous les substrats potentiels de CMA [50,51] . Hsc70 est distribuée dans le cytoplasme ou dans la lumière du lysosome [7,48,52] . La cytoplasme Hsc70 (cyt-Hsc70) reconnaît la présence de motifs de type KFERQ dans les protéines substrats, facilitant ainsi leur transfert vers les récepteurs CMA situés sur les membranes des lysosomes [26,52] . Il a également été proposé que la cyt-Hsc70 participe au déploiement des protéines substrats, ce qui est nécessaire à l'entrée dans la lumière des lysosomes [23] . Les formes chimériques des substrats CMA sont généralement capables de se lier aux membranes lysosomales, bien qu'elles ne subissent pas de translocation lorsque le dépliement est chimiquement bloqué. Ces données suggèrent que le dépliement n'est pas nécessaire pour la liaison [48] , suggérant la possibilité d'une liaison au substrat sur la membrane lysosomale avant le processus de dépliement [24] .

Il a été démontré que le cytosol Hsc70 est associé à d'autres cochaperons qui aident au déploiement et à la libération du substrat pour la dégradation et régulent le pas de CMA [50] . Par exemple, la hanche (protéine interagissant avec Hsc70), la protéine organisatrice Hsc70-hsp90 (houblon), hsp90, hsp40 et Bag1 (anthogène 1) associé à BCl2 ont toutes été trouvées sur les membranes lysosomales, qui peuvent être co-immunoprécipitées avec le complexe de la protéine substrat et Hsc70. Le rôle permissif probable de ces cochaperons dans la CMA a été renforcé par le fait que l'incubation de lysosomes à l'aide d'anticorps bloquants de ces cochaperons affiche des réponses négatives sur l'activité de la CMA [48,50] . Par exemple, il a été proposé que la hsp40 stimule l'activité de l'ATPase Hsc70 pour favoriser le taux de liaison aux protéines substrats. De plus, Hip peut favoriser l'assemblage de Hsc70 avec les substrats et hsp40 [27,38] , et stabiliser le complexe de substrat et Hsc70 en bloquant la liaison de l'ATP nouvellement synthétisé [50] . Bag1 fonctionne comme un facteur d'échange de nucléotides qui peut favoriser la libération de substrat par le chaperon en favorisant la liaison à l'ATP [53] . Bag1 a plusieurs isoformes différentes, provoquant des effets régulateurs à la fois positifs et négatifs sur l'activité de Hsc70 [50,53] . Le houblon agit comme un échangeur de nucléotides et peut également agir comme un adaptateur entre Hsc70 et Hsp90 [50] . Le cochaperon Hsp90 reconnaît la région dépliée au sein des protéines substrats [48] et empêche son agrégation indésirable par couplage avec les segments dépliés des protéines ciblées pour obtenir une stabilisation optimale [50] . La fonction de Hsp90 dans la régulation de l'activité de chaperon peut être assistée par des cochaperons supplémentaires tels que p50 et Cdc37. Il est rapporté que Hsc70 et Hsp90 se localisent dans la lumière lysosomale et agissent de manière coordonnée [4,8,48,54,55] . En fait, à un moment donné, certains cochaperons peuvent jouer une réponse stimulatrice tandis que d'autres offrent un effet inhibiteur sur l'activité du cochaperon, dénotant la complexité de multiples complexes substrat-chaperon à différentes étapes du processus CMA [48] .

Compte tenu du rôle essentiel de Hsc70 dans la CMA, il est plausible de cibler Hsc70 dans le contrôle de l'activité de la CMA. Compte tenu de son large éventail de fonctions cellulaires, la manipulation directe des niveaux de Hsc70 n'est pas spécifique et n'est pas possible pour l'inhibition de la CMA. A cette fin, cibler les interactions de Hsc70 avec ses cochaperons devrait être plus réaliste pour des considérations thérapeutiques. Par exemple, la cochaperone cytosolique CHIP (carboxyle terminal of Hsc70-interacting protein) semble fonctionner comme un bon candidat pour diriger les protéines cytosoliques vers le repliement ou la dégradation. Il a été démontré que CHIP annule les déficiences comportementales et pathologiques de l'atrophie musculaire spinale et bulbaire grâce à la régulation à la hausse de la machinerie protéolytique [56] . De nombreuses autres études ont également confirmé un rôle dans la dégradation des protéines cytosoliques via la voie du système ubiquitine-protéasome (UPS) dans l'effet bénéfique offert par CHIP sur l'homéostasie cellulaire [57] . D'autres études ont indiqué que CHIP est associé à une dégradation lysosomale dans la clairance des accumulations anormales de protéines [48] . Des études plus approfondies sont nécessaires pour étudier le rôle de différentes voies autophagiques dans la dégradation lysosomale associée à CHIP, et si un tel processus dépend de Hsc70.


Contenu

Avec l'introduction de facteurs de stress environnementaux, la cellule doit être capable de maintenir la protéostase. La soumission aiguë ou chronique à ces conditions nocives provoque une réponse cytoprotectrice pour favoriser la stabilité du protéome. [9] Les HSP (par exemple HSP70, HSP90, HSP60, etc.) sont présentes dans des conditions normales mais sous stress thermique, elles sont régulées à la hausse par le facteur de transcription heat shock factor 1 (HSF1). [10] [11] Il existe quatre facteurs de transcription différents chez les vertébrés (HSF 1-4) où le principal régulateur des HSP est HSF1, tandis que σ 32 est le facteur de transcription du choc thermique dans E. coli. [12] [13] Lorsqu'il n'est pas lié à l'ADN, HSF1 est dans un état monomère où il est inactif et régulé négativement par les chaperons. [14] Lorsqu'un stress survient, ces chaperons sont libérés en raison de la présence de protéines dénaturées et divers changements de conformation de HSF1 le font subir une localisation nucléaire où il devient actif par trimérisation. [15] [14] HSF1 nouvellement trimérisé se liera aux éléments de choc thermique (HSE) situés dans les régions promotrices de différentes HSP pour activer la transcription de l'ARNm de HSP. L'ARNm sera finalement transcrit et comprendra les HSP régulées à la hausse qui peuvent atténuer le stress actuel et restaurer la protéostase. [16] HSF1 régulera également l'expression des HSP par le biais de modifications épigénétiques. Le HSR finira par s'atténuer à mesure que HSF1 reviendra à sa forme monomère, régulée négativement par association avec HSP70 et HSP90 avec des modifications post-traductionnelles supplémentaires. [17] Le HSR n'est pas seulement impliqué dans l'augmentation des niveaux de transcription des HSP, d'autres facettes incluent la stabilité de l'ARNm induite par le stress empêchant les erreurs dans l'ARNm et un contrôle amélioré pendant la traduction pour contrecarrer le mauvais repliement. [18]

Les chaperons moléculaires sont généralement appelés protéines qui s'associent et aident d'autres protéines à atteindre une conformation native tout en n'étant pas présentes dans l'état final. [19] Les chaperons se lient à leur substrat (c'est-à-dire une protéine mal repliée) d'une manière dépendante de l'ATP pour remplir une fonction spécifique. [20] Les résidus hydrophobes exposés sont un problème majeur en ce qui concerne l'agrégation de protéines, car ils peuvent interagir les uns avec les autres et former des interactions hydrophobes. [21] C'est le travail des chaperons d'empêcher cette agrégation en se liant aux résidus ou en fournissant aux protéines un environnement « sûr » pour se replier correctement. [22] On pense également que les protéines de choc thermique jouent un rôle dans la présentation de morceaux de protéines (ou de peptides) à la surface des cellules pour aider le système immunitaire à reconnaître les cellules malades. [23] Les principaux HSP impliqués dans le HSR comprennent HSP70, HSP90 et HSP60. [5] Les chaperons incluent les HSP70 et les HSP90 tandis que les HSP60 sont considérés comme des chaperonins. [18]

La famille de chaperons HSP70 est le principal système HSP au sein des cellules, jouant un rôle clé dans la traduction, la post-traduction, la prévention des agrégats et le repliement des protéines agrégées. [24] Lorsqu'une protéine naissante est traduite, HSP70 est capable de s'associer aux régions hydrophobes de la protéine pour empêcher les interactions défectueuses jusqu'à ce que la traduction soit terminée. [25] Le repliement post-traductionnel de la protéine se produit dans un cycle où la protéine se lie/se libère du chaperon, ce qui permet d'enterrer les groupes hydrophobes et aide à surmonter l'énergie nécessaire pour se replier en temps opportun. [26] HSP70 joue un rôle dans la désagrégation des protéines en utilisant le mécanisme susmentionné, le chaperon se lie aux résidus hydrophobes exposés et désassemble partiellement ou totalement la protéine, permettant à HSP70 d'aider au bon repliement. [27] Lorsque les protéines sont au-delà du point de repliement, les HSP70 peuvent aider à orienter ces agrégats potentiellement toxiques vers la dégradation par le protéasome ou par autophagie. [28] Les HSP90 sont parallèles aux HSP70 en ce qui concerne le repliement ou les protéines et leur utilisation dans la clairance des protéines. [4] Une différence entre les deux HSP est la capacité de HSP90 à maintenir les protéines dans une configuration dépliée mais stable jusqu'à ce qu'un signal entraîne la translocation de la protéine et l'achèvement de son repliement. [25]

Parfois, HSP70 est incapable d'aider efficacement une protéine à atteindre sa structure 3D finale. La principale raison étant que les barrières thermodynamiques pour le repliement sont trop élevées pour que le chaperon puisse les rencontrer. [24] Parce que l'espace intracellulaire est très encombré, les protéines ont parfois besoin d'un espace isolé pour empêcher les interactions aberrantes entre d'autres protéines, qui est fourni par les chaperonines ou les HSP60. [7] Les HSP60 sont en forme de tonneau et adaptées pour se lier aux résidus hydrophobes des protéines. [29] Une fois qu'un capuchon se lie à la chaperonine, la protéine est libre dans le baril pour subir un effondrement hydrophobe et atteindre une conformation stable. [30] Une fois le capuchon retiré, la protéine peut être correctement repliée et continuer à remplir sa fonction ou revenir à une HSP si elle n'est toujours pas repliée avec précision. [31] Ces chaperons ont pour fonction de supprimer l'agrégation et d'accélérer considérablement le repliement des protéines. [21]

Lors du choc thermique, il existe une deuxième branche moins étudiée connue sous le nom de régulation négative transcriptionnelle globale. Identifié par le laboratoire John T Lis.

La découverte de la réponse au choc thermique est attribuée au généticien italien Ferruccio Ritossa, qui a observé des changements appelés « bouffées » chromosomiques en réponse à l'exposition à la chaleur tout en travaillant avec les chromosomes polytènes de Drosophile. [32] [33] Par son propre compte, la découverte était le résultat fortuit d'une température élevée involontaire dans un incubateur de laboratoire. [34] Les observations de Ritossa, rapportées en 1962, [35] ont été décrites plus tard comme "le premier stress environnemental connu agissant directement sur l'activité des gènes" [32] mais n'ont pas été initialement largement citées. [32] [36] La signification de ces observations est devenue plus claire dans les années 1970, lorsqu'une classe distincte de protéines de choc thermique a été découverte dans le laboratoire de Herschel K. Mitchell, [37] et que des réponses de choc thermique ont été signalées dans d'autres organismes et est venu à être reconnu comme universel. [32] [36] [38]


Faire une hypothèse : qu'est-ce que j'attendrai de mes cellules transformées ?

Du laboratoire précédent, nous pouvons identifier nos plasmides. Les plasmides sont soit pGlo, pUC18/19 ou pUC18/19 avec un insert de 6 kb perturbant le gène LacZ. pGlo contient un gène qui code pour la protéine GFP qui émettra une fluorescence verte sous la lumière UV et fait 5,4 kb. pUC a généralement une taille de 2,7 Ko. LacZ est un gène codant pour la protéine & bêta-galactosidase, l'enzyme qui hydrolyse le lactose en les monosaccharides galactose et glucose. X-Gal est un produit chimique ressemblant au lactose. Cependant, lors de l'hydrolyse, la molécule dépose une coloration bleue dans la cellule.


Protéines de choc thermique et HD^

Dans la MH, une grande quantité de protéine huntingtine mutante est produite dans la cellule et forme des agrégats. Cette agrégation déclenche la réponse au choc thermique et de nombreuses protéines de choc thermique sont produites pour résoudre le problème. Dans la HD, hsp70, avec l'aide de hsp40, se lie à toutes les surfaces externes des protéines huntingtine mal repliées. Le revêtement hsp70 modifie la façon dont les protéines huntingtine mal repliées interagissent les unes avec les autres et empêche la formation d'agrégats. De plus, le revêtement hsp70 peut empêcher les interactions nocives avec d'autres protéines de la cellule. Pour en savoir plus sur les façons dont la huntingtine mutante peut inhiber d'autres protéines dans la cellule, cliquez ici. Ainsi, il est possible que la protéine de choc thermique hsp70 supprime les effets toxiques de l'agrégation de la huntingtine.

Il existe très peu de recherches sur la façon dont d'autres familles de protéines de choc thermique interagissent avec les agrégats de huntingtine. Une protéine de la famille hsp100, appelée hsp104, réduit à la fois l'effet toxique et la taille des agrégats de huntingtine. Dans une expérience utilisant un HD C. elegans modèle qui démontre une fonction motrice faible, l'ajout de hsp104 soulage cette déficience. Hsp104 peut séparer les protéines huntingtine qui commencent le processus d'agrégation. Hsp104 peut également fonctionner en coopération avec hsp70 et hsp40 pour séparer activement les agrégats et réduire certains de leurs effets toxiques. Cependant, hsp104 ne se trouve que dans la levure. Il n'y a pas de protéines similaires chez les mammifères, il semble donc peu probable qu'elles soient utilisées pour un certain type de traitement.

Il n'y a pas beaucoup de recherches sur les protéines de choc thermique &ldquosmall&rdquo. Il existe des preuves qu'ils réduisent les effets toxiques de la MH, mais le mécanisme n'est pas encore clair.


Transformer des cellules compétentes et isoler l'ADN plasmidique

  1. Décongeler les cellules compétentes sur de la glace pendant environ 45 min (utiliser environ 120 μl dans 1,5 ml d'eppendorf).
  2. Ajouter un mélange de ligature (ou un contrôle positif ou négatif approprié) – environ 10-15 μl.
  3. Flick le fond de l'eppendorf doucement pour mélanger.
  4. Incuber sur glace pendant 30 min.
  5. Chauffez les cellules pour la transformation en les plaçant dans un bain à 42 °C ou une plaque chauffante pendant 30 secondes seulement.
  6. Remettez les cellules sur la glace.
  7. Ajoutez 500 μl de média LB
  8. Agiter dans un agitateur orbital à environ 240 tr/min pendant 90 min.
  9. Centrifuger la solution à 12 000 tr/min pendant 30 secondes pour sédimenter les bactéries.
  10. Videz la majeure partie du surnageant en laissant environ 50 μl de milieu au-dessus des bactéries en culot.
  11. Re-suspendre les bactéries dans le LB restant, puis plaquer sur des plaques LB/Aapicilline (ou des plaques de gélose LB avec l'antibiotique approprié) et incuber une nuit à 37°C.
  12. Le lendemain matin, vérifiez la ou les plaques pour les colonies. Grattez une partie des colonies individuelles avec un embout de pipette stérile ou un cure-dent et plongez-les dans un tube de culture stérile contenant du milieu LB (3 ml) additionné d'ampicilline (6 μl de stock d'ampicilline à 5%). Agiter dans un agitateur orbital à 37°C pendant au moins 2 heures.
  13. Lorsque la solution a atteint un niveau raisonnable de trouble dû à la croissance bactérienne, utilisez environ la moitié de la culture bactérienne (1,5 ml) pour une mini-préparation et effectuez une digestion de restriction sur le plasmide résultant qui est isolé. Si l'insert approprié est visible sur l'électrophorèse sur gel d'agarose, vous pouvez vérifier l'ADN restant par séquençage.
  14. Pour la préparation de l'ADN plasmidique, placez environ 1 ml de la culture de 3 ml d'en haut dans un flacon stérile (500 ml) contenant environ 150-200 ml de milieu LB plus ampicilline (400 μl de 5% stock dans 200 ml de LB) . Agiter dans un agitateur orbital pendant la nuit à 37°C. Le lendemain, continuez avec la préparation de l'ADN.

Dr Richard Patten
Centre médical Tufts-Nouvelle-Angleterre
Centre de recherche en cardiologie moléculaire
Boston, Massachusetts


Pourquoi les cellules ont-elles été placées dans du CaCl2 et soumises à un choc thermique au cours de cette expérience ?

En laboratoire, les bactéries cellules peut être rendu compétent et l'ADN introduit par la suite par une procédure appelée le choc thermique méthode. Choc thermique la transformation utilise un environnement riche en calcium fourni par le chlorure de calcium pour contrecarrer la répulsion électrostatique entre l'ADN plasmidique et bactérien cellulaire membrane.

Aussi, quel est le but du CaCl2 dans la transformation ? Chlorure de calcium (CaCl2) transformation est une technique de laboratoire en biologie cellulaire procaryote (bactérienne). Il augmente la capacité d'une cellule procaryote à incorporer de l'ADN plasmidique, ce qui lui permet d'être génétiquement transformé.

Par conséquent, comment le CaCl2 et le traitement par choc thermique améliorent-ils l'absorption d'ADN ?

Les choc thermique étape dépolarise fortement la membrane cellulaire de CaCl2-traité cellules. Ainsi, la diminution du potentiel membranaire abaisse la négativité du potentiel interne de la cellule, ce qui permet finalement le mouvement des charges négativement chargées. ADN à l'intérieur de la cellule.

Pouvez-vous chauffer des cellules électrocompétentes par choc thermique ?

Cellules électrocompétentes sont préparés à faire face à l'électrotransformation et chimiocompétents cellules sont faits pour être transformés via choc thermique. Si tu exécuter l'électroporation avec chimiquement cellules compétentes, vous serez obtenir un très bel arc électrique à cause du chlorure de calcium présent dans cellule échantillon.


Comment fonctionne la transformation par choc thermique ? - La biologie

Quelles sont les figurines préférées des biochimistes ? 🤔 Transformateurs ! 🤓 Viens comme un *choc* ? J'espère que je suis assez *compétent* pour décrire comment, dans la TRANSFORMATION PLASMIDE, nous pouvons utiliser des cellules chimiquement compétentes et un choc thermique pour introduire l'ADN dans les cellules bactériennes. 🤞 J'obtiens une bonne *efficacité* dans l'obtention de ces informations dans votre cerveau !

La plupart du temps ces derniers temps, au lieu d'être sur ce banc, j'étais sur le banc dans la salle chaude, faisant des expériences impliquant des objets radiomarqués. Mais ce banc a toujours été occupé et le matin, c'est un gâchis car j'ai mis en place toutes les parties non radioactives de mes expériences, mais il est toujours visité tout au long de la journée à cause de ce qui se trouve au bout de la baie ! Le bain-marie ! Et notre laboratoire en a besoin pour les transformations &ndash donc je ne sais souvent pas si les gens viennent pour moi ou pour le bain !

Dans le CLONAGE MOLÉCULAIRE, nous prenons un gène d'un endroit et le collons dans un VECTOR qui sert de &ldquovehicle&rdquo pour prendre ce gène dans les cellules. Souvent, nous utilisons des VECTEURS PLASMIDES, qui sont des morceaux d'ADN circulaires que nous mettons dans des bactéries.

Les vecteurs plasmidiques sont les véhicules, mais ils ont besoin de tunnels pour entrer dans les cellules, mais nous ne voulons pas que ces tunnels soient énormes et toujours grands ouverts, sinon le contenu des cellules pourrait se répandre, des choses aléatoires pourraient entrer, etc. Nous avons donc besoin un moyen de contrôler leur taille et/ou leur ouverture/fermeture.

Il existe 2 voies principales pour la transformation artificielle et la compétence chimique + le choc thermique et l'électroporation

Avec des cellules chimiquement compétentes, vous utilisez du calcium pour obtenir l'ADN juste à côté des tunnels (zones d'adhérence) et un choc thermique pour ouvrir une voie supplémentaire (élargir les pores), accélérer les voitures et rendre l'intérieur de la cellule plus attrayant ( moins chargée négativement). Avec l'électroporation, vous utilisez le courant électrique pour &ldquobore&rdquo des tunnels temporaires. Nous utilisons généralement la transformation chimique, c'est donc ce sur quoi je vais me concentrer dans cet article.

Avis de non-responsabilité : il n'est pas tout à fait clair comment cela se passe mécaniquement, mais voici quelques théories de premier plan

Quelle que soit la méthode, les tunnels doivent traverser la ou les membranes cellulaires, qui sont comme des sandwichs constitués de 2 couches de molécules amphiphiles et ces molécules ont une partie hydrophile (aimant l'eau) et une autre partie hydrophobe (eau -éviter)

Les cellules que nous utilisons normalement sont différentes souches d'e. coli, qui en tant que bactéries & ldquoGram-négatives, ont 2 de ces double-couches pour traverser &ndash là&rsquo une membrane externe, puis un &ldquopériplasmique,» puis une &ldquoinner membrane», puis, enfin, vous êtes à l'intérieur de la cellule, le cytoplasme. Au niveau des tunnels appelés zones d'adhérence, ces 2 membranes sont fusionnées.

Toutes les membranes contiennent des PHOSPHOLIPIDES, qui ont une tête hydrophile avec un groupe phosphate chargé négativement et une queue hydrophobe (qui évite l'eau) avec des chaînes lipidiques (grasses). Ils s'orientent queue à queue pour former une barrière entourant la cellule. La membrane externe contient également des LIPOPOLYSACCHARIDES (LPS) qui, en plus, ont des chaînes de sucre (polysaccharides) qui se détachent et qui peuvent avoir des charges encore plus négatives.

L'ADN a également une charge négative en raison des groupes phosphate dans son squelette. Cela l'aide à rester soluble dans l'eau, mais cela le rend également normalement répulsif à l'extérieur de la membrane (comme les charges repoussent). Nous avons donc besoin d'un médiateur chargé positivement (cationique).

Le chlorure de calcium (CaCl2) fournit une source de cations divalents (charge de 2) (molécules chargées positivement). ces Cl-anions (ions chargés négativement)

Le Ca2+ aide à cacher les charges négatives de l'ADN et des membranes afin qu'elles ne se repoussent pas et, encore mieux, le Ca2+ peut se lier à plus d'une chose à la fois, de sorte qu'il peut lier l'ADN à la surface cellulaire afin qu'il soit bien en place pour se précipiter. lorsque les tunnels s'ouvrent davantage pendant l'étape de choc thermique.

Lorsque nous chauffons les cellules, les pores perdent une partie de leurs lipides, de sorte que les tunnels s'agrandissent et que la membrane se "dépolarise", ce qui signifie que l'intérieur de la cellule devient moins chargé négativement et donc plus attrayant pour l'ADN chargé négativement. Normalement, les cellules maintiennent un potentiel membranaire en pompant des protons (H+) de sorte que l'intérieur de la cellule est plus négatif, ce qui serait très attrayant pour l'ADN chargé négativement.

La chaleur crée également un déséquilibre thermique &ndash l'ADN à l'extérieur n'est &rsquot &ldquoinsulated&rdquo donc il chauffe plus vite &ndash commence à se déplacer plus -> les voitures accélèrent plus vite dans le tunnel

Comme je l'ai dit, il y a encore beaucoup d'incertitudes sur la façon dont cela fonctionne, mais j'ai fait de mon mieux pour découvrir comment cela fonctionne. Et le travail, ça marche (généralement) !

Voyons donc que nous le faisons dans la pratique. Et on le fait beaucoup, donc on s'entraîne beaucoup ! (Et c'est le protocole que j'utilise habituellement, mais les temps exacts, etc. dépendent des types de cellules que vous utilisez, des volumes, des types de tubes, etc.)

Les cellules compétentes sont compétentes pour capter l'ADN mais pas très compétentes pour survivre & hellip elles & rsquo sont vraiment & ldquodélicates & rdquo donc vous devez les traiter avec TLC

Pour éviter une congélation-décongélation inutile, vous en faites généralement de petites aliquotes à usage unique et chaque tube a la quantité parfaite pour 1 transformation.

Vous devrez les décongeler au moins une fois, et lorsque vous le ferez, vous voudrez le faire &ldquogently&rdquo &ndash sur la glace. Les températures froides aident également à garder le calcium collé à la membrane où nous le voulons (les molécules n'ont pas l'énergie pour aller chercher de meilleures alternatives)

Une fois qu'ils sont décongelés, vous pouvez ajouter le plasmide et remuer doucement ou tapoter doucement (ne pas pipeter de haut en bas car cela est trop dur)

Ensuite, c'est parti pour un bain pour le choc thermique. Nous collons les tubes dans un bain d'eau chaude à 42°C pendant 40s. Mon banc est l'un des endroits les plus populaires du laboratoire car il dispose du bain-marie. Nous effectuons beaucoup de transformations, donc à un moment donné, il y a souvent quelqu'un qui se tient là, regarde l'horloge et attend que ces 40 secondes s'écoulent.

Ensuite, c'est tout de suite sur la glace. Ce choc thermique a été assez traumatisant pour les bactéries, vous devez donc les aider à récupérer. Vous leur donnez de la nourriture liquide et cela peut être du LB (aliment de base pour les bactéries) ou un aliment & ldquoricher & rdquo comme le SOC (il contient du glucose pour que les cellules brûlent du glucose pour produire de l'énergie et laissent ces acides aminés et ces lipides seuls afin qu'ils puissent aller vers la fabrication de protéines & fixation murale)

Il est important de noter que cet aliment ne contient PAS d'antibiotiques. Le plasmide que vous mettez a un gène de résistance aux antibiotiques afin que vous puissiez le sélectionner. Nous utilisons donc cet antibiotique lorsque nous les cultivons sur des plaques, mais nous devons d'abord donner aux cellules le temps de fabriquer ce qui les rend résistantes.

De plus, puisqu'ils n'ont pas à dépenser de l'énergie à se battre pour leur vie grâce aux antibiotiques, ils peuvent dépenser de l'énergie à se battre pour leur vie à cause de tous ces trous dans leurs membranes ! Ils peuvent utiliser ce temps de récupération pour aider à réparer leurs membranes

Ainsi, dans l'étape OUTGROWTH, nous ajoutons des milieux sans antibiotiques et les laissons pousser pendant

30min-1h. Le temps dont ils ont besoin dépend de l'antibiotique que vous prévoyez d'utiliser. Les antibiotiques comme la kanamycine et le chloramphénicol inhibent la traduction (fabrication de protéines), de sorte que les cellules ont besoin d'une croissance plus longue, sinon elles ne pourront pas fabriquer les protéines dont elles ont besoin pour inactiver les antibiotiques. Les antibiotiques comme l'ampicilline qui n'arrêtent pas la production de protéines, n'ont donc pas besoin d'autant de temps pour récupérer. Plus ici : http://bit.ly/2IxPOM8

Pendant ce temps, même les cellules non transformées peuvent se développer, mais elles meurent une fois que nous les avons plaquées. Une fois qu'ils ont réparé leurs membranes et commencé à développer leur résistance, nous les passons de la croissance en suspension (à base de liquide) à la croissance en plaque et nous étalons le liquide (plein de bactéries) sur une plaque de gélose LB contenant cet antibiotique et la gélose est un sucre qui forme un gel rempli de nourriture LB enrichie d'antibiotique

Maintenant, puisque la nourriture LB est enrichie d'antibiotiques, seules les cellules transformées devraient pouvoir se développer. Et quand ils le font, ils le font en copiant tout leur ADN (y compris le plasmide que vous avez inséré) puis en se divisant. Ainsi, vous vous retrouvez avec de nombreuses cellules de chaque cellule transformée d'origine, et ces &ldquofamilies&rdquo apparaîtront sous la forme de &ldquodots&rdquo globby appelés colonies.

Plus l'efficacité de la transformation est élevée, plus vous verrez de colonies. This efficiency depends on a lot of things like how competent the cells where, how big the plasmid was, whether the plasmid &ldquostill needed help&rdquo etc.

Sometimes, the plasmids you put in are &ldquopre-made&rdquo and have already grown in bacteria (then been taken out & purified) but other times, they&rsquore things you&rsquove just pasted together (ligation products) or even plasmids with gaps the bacteria needs to fix through homologous recombination (like SLIC products). These are &ldquoharder&rdquo because you have to have the engineering go right AND the transformation go right. So you should expect lower transformation efficiency.

You can isolate the plasmid DNA from these colonies to use and, especially if you&rsquove just cloned it, send it for sequencing to check for &ldquotypos.&rdquo

Note: In addition to this &ldquoartificial competence&rdquo, some bacteria have &ldquonatural competence&rdquo &ndash In nature, some bacteria can take up *linear* pieces of foreign DNA (such as that released by dead, exploded bacteria) through a form of transformation that relies on DNA receptors


Remarques

This method was first discovered to increase the rate of bacteriophage infections by the uptake of viral DNA by the cells. [1]

Inoue et al. 1990 published a method to store cells in a competent state (able to take up DNA during transformation) that can greatly increase efficiency when a large number of transformations are being done over time. [2]

Li et al. 2007 constructed a MEMS (Micro Electro Mechanical Systems) device that greatly increases transformation efficiency with much smaller volumes. [3] [4]

Panja at al. 2008 found that the heat-shock (and a following cold-shock) step released lipids and proteins from the cell membrane and facilitated pore formation that might contribute to the uptake of DNA. Furthermore, repeated cycles of heat and cold shock, up to the third pair, increased transformation efficiency. [5]

Sarkar et al. 2002 found that ethanol removed lipopolysaccharide (LPS, lipid-phosphate membrane molecule with a cell surface O-antigen polysaccharide covalently attached) and lowered transformation efficiencies, suggesting DNA association with LPS molecules may be a key part of calcium chloride heat shock transformation. [6]


Voir la vidéo: LE COURS: Les transformations Partie 1 - Troisième (Juillet 2022).


Commentaires:

  1. Zolorisar

    confirmer

  2. Nur Al Din

    La réponse dûment

  3. Derwan

    Vous avez frappé la marque. Il y a aussi quelque chose pour moi, il me semble que c'est une bonne idée. Je suis d'accord avec toi.

  4. Emery

    Quelque chose y est et c'est une excellente idée. C'est prêt pour te soutenir.

  5. Vidal

    Je ne voudrais pas développer ce thème.

  6. Isaiah

    c'est comme ça que vivent les autres



Écrire un message