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Définition d'un Katal (unité d'activité enzymatique)

Définition d'un Katal (unité d'activité enzymatique)


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Je suis très confus quant à ce qu'est réellement un « Katal ». De Wikipédia,

"Le katal n'est pas utilisé pour exprimer la vitesse d'une réaction; qui est exprimé en unités de concentration par seconde (ou moles par litre par seconde). Il est plutôt utilisé pour exprimer l'activité catalytique qui est une propriété du catalyseur. Le katal est invariant de la procédure de mesure, mais la valeur numérique de la quantité ne l'est pas et dépend des conditions expérimentales. Par conséquent, afin de définir la quantité d'un catalyseur, le taux de conversion d'une réaction chimique définie est spécifié en moles réagies par seconde Un katal de trypsine, par exemple, est la quantité de trypsine qui brise une mole de liaisons peptidiques par seconde dans des conditions spécifiées."

Donc, si un Katal est une QUANTITÉ spécifique de trypsine, alors pourquoi est-il exprimé en unités de moles par seconde. Ce n'est pas dimensionnellement cohérent ! Une « quantité » pourrait être exprimée en moles ou en masse, mais certainement pas en moles par seconde, ce qui est comme une vitesse de réaction multipliée par le volume… ? Les unités et la définition semblent tout simplement fausses.

Si je devais supposer que le Katal est la quantité d'enzyme catalysant une mole d'une réaction par seconde, alors cela signifierait qu'une enzyme avec un plus petit nombre de Katals d'activité serait en fait plus active car il en faut moins pour catalyser une mole de réaction par seconde ?


Un katal est en effet une quantité spécifique d'enzyme (plutôt qu'une vitesse de réaction), mais qui est mesurée par rapport à l'activité catalytique de l'enzyme, plutôt qu'en fonction du nombre de molécules, de leur poids ou de leur taille.

En gros, un katal est la quantité d'enzyme qui peut convertir 1 mole en 1 seconde. (Tout comme un pascal est la quantité de pression qui applique un newton de force à une surface d'un mètre carré.) Ou pour reformuler légèrement les choses, tout comme vous pouvez prendre un objet d'une longueur particulière et exprimer cette longueur comme "X mètres " (étant le nombre de bâtonnets de mètre que vous pouvez aligner à côté de cette longueur), vous pouvez prendre une quantité donnée d'enzyme et exprimer l'activité catalytique de cette quantité d'enzyme comme " X katals ", étant le nombre de moles que l'enzyme peut convertir en une seconde.

Ce n'est pas une propriété intrinsèque de l'enzyme elle-même. (C'est une propriété "extensive", pas une propriété "intensive".) Le nombre de katals varie en fonction de la quantité d'enzyme que vous avez - si vous avez deux fois la quantité d'enzyme, vous avez deux fois le nombre de katals. (Tout comme vous avez deux fois le nombre de grammes ou deux fois le nombre de moles.)

En tant que tel, vous ne pouvez pas parler d'"une enzyme avec un plus petit nombre de katals d'activité". Je peux comprendre la confusion, cependant, étant donné l'utilisation de "activité" dans le nom. Un article auquel l'article de Wikipedia fait référence parle du fait qu'il y avait un argument pour appeler la quantité mesurée "quantité catalytique" plutôt que "activité catalytique"

Quant à savoir pourquoi mesurer les quantités d'enzymes en katals par rapport aux moles ou aux grammes, l'argument est similaire à la raison pour laquelle il existe des unités distinctes pour la masse (gramme) et le nombre (mole). Il exprime une caractéristique de la "taille" de l'enzyme non captée par les autres unités.


Bien que ce soit de vieilles nouvelles, comme @R.M. a été assez bon pour fournir une réponse, je pense que je devrais ajouter la mienne. La raison n'est pas que je pense que sa réponse est incorrecte de quelque manière que ce soit - elle est techniquement tout à fait correcte et je ne vais pas répéter ou reformuler ses arguments techniques - mais je ne pense pas qu'elle réponde à ce que je considère comme le malentendu dans l'argument de l'affiche - un malentendu que d'autres pourraient faire, même si le PO a évolué vers d'autres choses.

Le problème est un problème de sémantique - Qu'entendez-vous par le mot 'montant'?

Le PO est clair. Elle écrit:

« Une 'quantité' pourrait être exprimée en moles ou en masse, mais certainement pas en moles par seconde… »

Alors sa compréhension du mot montant est lié à (extrinsèque) Masse propriété d'une enzyme, dont elle sent clairement qu'elle est intimement liée à la nombre de molécules.

Il me semble que la façon de traiter cet argument est de souligner qu'il s'agit d'une idée fausse - il existe des propriétés de molécules autres que la masse qui peuvent être et sont utilisées pour les quantifier, et pour les enzymes, l'activité catalytique est l'une de ces propriété, et celui qui doit être utilisé dans la pratique.

En pratique, la quantification des molécules (le processus qui produit une quantité) doit être effectuée en fonction de leurs propriétés mesurables lorsque nous sommes incapables de « compter leur nombre » (pour ainsi dire). La masse est en fait indirecte - pour être utile, nous devons connaître la pureté du composé et son poids moléculaire. De même, nous pouvons quantifier des molécules par ex. leur absorbance lumineuse à une longueur d'onde particulière, mais pour ce faire, nous avons besoin d'une valeur de référence molaire qui différera, par ex. entre le NADH et le tryptophane, un acide aminé. La quantification utilisant l'activité enzymatique peut être envisagée sous cet angle.


Quelle est la différence entre l'activité enzymatique et l'activité spécifique

Les différence principale entre l'activité enzymatique et l'activité spécifique est que l'activité enzymatique correspond aux moles de substrat converties par l'enzyme par unité de temps, tandis que l'activité spécifique correspond à l'activité de l'enzyme par milligramme d'enzyme totale. De plus, l'activité enzymatique mesure la quantité d'enzymes actives présentes dans une condition donnée, tandis que l'activité spécifique mesure la pureté de l'enzyme dans le mélange.

L'activité enzymatique et l'activité spécifique sont deux unités enzymatiques qui mesurent l'activité enzymatique. La mesure de l'activité enzymatique par dosages enzymatiques est importante pour l'étude de la cinétique enzymatique ainsi que de l'inhibition enzymatique.

Domaines clés couverts

Mots clés

Activité enzymatique, pureté enzymatique, unités enzymatiques, activité spécifique, concentration du substrat


Expression et mesure de l'activité enzymatique

La présence ou l'absence d'une enzyme est généralement déterminée en observant la vitesse de la ou des réaction(s) qu'elle catalyse. Les dosages enzymatiques quantitatifs sont conçus pour mesurer soit la quantité totale d'une enzyme particulière (ou classe d'enzymes) en unités de moles, soit, plus communément, l'activité catalytique associée à une enzyme particulière. Les deux types de dosages diffèrent en ce que ceux de la dernière catégorie ne mesurent que l'enzyme active. Les dosages contenus dans cette section concernent principalement la mesure de l'activité catalytique ou de l'enzyme active. Les dosages sont basés sur des expériences cinétiques, car les activités sont calculées à partir des taux de réaction mesurés dans des conditions définies. Le principe de base de ces dosages est que la quantité d'enzyme dans un mélange réactionnel peut être déterminée à partir de la vitesse à laquelle la réaction catalysée par l'enzyme se produit.

UNITÉS D'ACTIVITÉ

L'objectif de la plupart des dosages enzymatiques est de mesurer quantitativement la quantité d'activité enzymatique (activité catalytique) présente dans un échantillon. Ainsi, les résultats d'analyse sont typiquement rapportés en unités "d'activité". Une unité d'activité peut être définie de diverses manières, mais toutes ces unités sont finalement basées sur des taux de consommation de substrat et/ou de formation de produit. Les unités les plus courantes pour exprimer l'activité catalytique sont l'unité internationale (également appelée unité ou unité enzymatique U) et le Katal (Kat). L'Union internationale de biochimie (IUB) a défini à l'origine une unité standard d'activité enzymatique (1 U) comme la quantité d'enzyme qui catalyse la formation de 1 |mol de produit (ou la conversion de 1 |imol de substrat) par minute dans des conditions standard. En 1979, le Comité de nomenclature de l'IUB a recommandé l'utilisation du Katal comme unité fondamentale de l'activité enzymatique. Le Katal est défini comme la quantité d'enzyme qui catalyse la formation de 1 mol de produit (ou la conversion de 1 mol de substrat) par seconde dans des conditions définies. Ainsi, 1 Kat équivaut à 6 x 107 U. Le Katal a été recommandé car il est conforme au Système International (Unités SI).

Il est également courant que les activités enzymatiques soient rapportées en unités basées sur des modifications des propriétés du mélange réactionnel qui sont elles-mêmes fonction de l'étendue de la réaction enzymatique. Ces unités sont souvent difficiles à interpréter en

Concentration du substrat [S]

Figure C1.1.1 Relation entre la concentration de substrat et la vitesse initiale à des concentrations d'enzymes fixes. La constante de Michaelis, KM, est égale à la concentration de substrat correspondant à la moitié de Vmax.

Figure C1.1.1 Relation entre la concentration de substrat et la vitesse initiale à des concentrations d'enzymes fixes. La constante de Michaelis, KM, est égale à la concentration de substrat correspondant à la moitié de Vmax.

Stratégies de mesure de l'activité enzymatique

Figure C1.1.2 Déroulement dans le temps de la génération du produit pour une réaction catalysée par une enzyme typique. La concentration du produit s'approche asymptotiquement de sa valeur d'équilibre (ligne pointillée horizontale). La ligne en pointillés en diagonale illustre la partie de la courbe utilisée pour calculer la vitesse initiale.

Expression et mesure de l'activité enzymatique termes de nombres absolus d'événements catalytiques, mais ils peuvent être utilisés pour communiquer efficacement les quantités relatives d'activité enzymatique. Les dosages de ce type sont particulièrement courants lorsque des substrats complexes et/ou des mélanges réactionnels hétérogènes sont utilisés. Les changements de solubilité, de turbidité et de viscosité, par unité de temps, sont des exemples de telles unités.

Le résultat de la discussion ci-dessus est qu'une variété d'unités d'activité enzymatique peut être rencontrée. Il est donc essentiel que toutes les unités, quelles que soient leurs bases, soient clairement définies.

CONDITIONS DE DOSAGE

Les dosages enzymatiques sont généralement effectués dans des conditions pertinentes, qu'il s'agisse de conditions physiologiques, de conditions de conservation des aliments ou de conditions correspondant à une activité maximale. Cela implique qu'il faut tenir compte des paramètres du mélange réactionnel tels que le pH, la température, la force ionique, la composition du tampon et d'autres composants non impliqués dans la réaction. Il est prudent de supposer que des changements dans l'un de ces paramètres peuvent affecter l'activité enzymatique. Les analystes effectueront souvent des analyses dans des conditions optimales apparentes (activité maximale), telles qu'un pH optimal, car ces conditions ont tendance à coïncider avec la sensibilité maximale de l'analyse. Il devrait ressortir de cette discussion que les dosages utilisant des conditions de réaction différentes peuvent n'avoir qu'une valeur comparative limitée.

La concentration du substrat est encore une autre variable qui doit être clairement définie. La relation hyperbolique entre la concentration du substrat ([S]) et la vitesse de réaction, pour les systèmes à base d'enzymes simples, est bien connue (figure C1.1.1). À de très faibles concentrations de substrat ([S]<<Km), il existe une dépendance linéaire de premier ordre de la vitesse de réaction sur la concentration de substrat. À des concentrations de substrat très élevées ([S]>>^M), la vitesse de réaction est essentiellement indépendante de la concentration de substrat. Vitesses de réaction à des concentrations de substrat intermédiaires ([S]

^M) sont d'ordre mixte par rapport à la concentration de substrat. Si un essai est basé sur des mesures de vitesse initiales, la concentration de substrat définie peut se situer dans l'une de ces plages et fournir quand même une estimation quantitative de l'activité enzymatique totale (voir l'équation C1.1.5). Le point essentiel est qu'une seule concentration de substrat doit être utilisée pour tous les essais d'étalonnage et d'échantillons d'essai. Dans la plupart des cas, les tests sont conçus de telle sorte que [S]>>^M, où de petits écarts dans la concentration du substrat auront un effet minime sur la vitesse de réaction, et où des mesures précises de la vitesse initiale sont généralement plus faciles à obtenir.

La composition des mélanges réactionnels de dosage est généralement définie dans la mesure où elle est pratique. Dans la plupart des cas, la principale source d'inconnues est la préparation enzymatique elle-même. Des composés kinétiquement pertinents endogènes à la source d'enzyme, tels que des substrats, des inhibiteurs et des activateurs, peuvent se partager avec l'enzyme pendant la préparation de l'échantillon. Par conséquent, à des fins de comparaison, il est recommandé de standardiser les schémas de préparation enzymatique.

EXPÉRIENCES DE VITESSE INITIALES

On suppose généralement que les activités enzymatiques rapportées sont basées sur des expériences de vitesse initiale, et que les activités rapportées sont proportionnelles à la quantité d'enzyme active dans le mélange réactionnel. Les analystes doivent vérifier indépendamment ces hypothèses dans leurs laboratoires, en utilisant les systèmes expérimentaux propres à leurs situations. La cinétique de vitesse initiale (ou vitesse initiale) implique que l'on mesure la vitesse instantanée à la concentration en substrat correspondant à l'initiation de la réaction. De manière réaliste, la vitesse initiale signifie souvent la vitesse mesurée aussi près que possible du début de la réaction. Les vitesses initiales sont généralement déterminées en collectant des points de données immédiatement après le début de la réaction, en analysant les données pour confirmer que le taux initial a été réellement observé (cela peut être aussi simple que de montrer que les premiers points de données définissent un taux linéaire de formation de produit), puis calcul de la vitesse correspondante dans les unités appropriées. Si la réaction est telle qu'il n'est pas possible expérimentalement d'obtenir un taux linéaire initial de formation de produit, alors une technique de régression non linéaire peut être utilisée pour estimer la vitesse initiale à partir de la première phase du déroulement temporel de la réaction.

La figure C1.1.2 montre une évolution dans le temps typique résultant d'un essai continu de formation de produit dans une réaction catalysée par une enzyme. La nature hyperbolique de la courbe illustre que la vitesse de réaction diminue à mesure que la réaction est presque terminée. La vitesse de réaction, à un instant donné, est la pente de la droite tangente à la courbe au point correspondant au temps d'intérêt. Les vitesses de réaction diminuent à mesure que les réactions progressent pour plusieurs raisons, notamment l'épuisement du substrat, les concentrations de réactif approchant les valeurs d'équilibre (c'est-à-dire que la réaction inverse devient pertinente), l'inhibition du produit, l'inactivation de l'enzyme et/ou un changement des conditions de réaction (p. produit). En ce qui concerne chacune de ces raisons, leurs effets seront au minimum dans la phase initiale de la réaction, c'est-à-dire dans des conditions correspondant aux mesures de vitesse initiales. Par conséquent, l'interprétation des données de vitesse initiale est relativement simple et donc largement utilisée dans les dosages enzymatiques.

CONCENTRATION ENZYMES ET VITESSE DE RÉACTION

Les dosages enzymatiques sont généralement conçus avec la présomption que les activités mesurées seront directement proportionnelles à la quantité d'enzyme active dans les mélanges réactionnels. Ainsi, la base conceptuelle de la plupart des tests est qu'il existe une relation linéaire entre l'activité mesurée et le potentiel catalytique (enzyme active). Il est peu probable que cette relation simple soit valable pour toutes les permutations expérimentales et, par conséquent, des tests vérifiant la relation entre l'activité mesurée et la quantité d'enzyme doivent être inclus dans tous les dosages. Ceci peut être accompli de manière relativement simple en analysant une série d'échantillons qui couvrent une gamme de concentrations d'enzymes et, sur la base des données, en préparant une courbe d'étalonnage de l'activité mesurée par rapport à la concentration enzymatique (relative), tout en s'assurant que les concentrations d'enzymes dans les échantillons d'essai réels se situent dans cette plage. À titre de référence, les concentrations d'enzymes dans les dosages traditionnels se situent généralement dans la plage nanomolaire à micromolaire.

Une réaction à un seul substrat peut être décrite comme

où E est l'enzyme S est le substrat ES est le complexe enzyme-substrat P est le produit et ki, k2 et k3 sont des constantes de vitesse. La cinétique d'un tel système enzymatique non réactif est le plus souvent décrite par l'équation de base de la cinétique enzymatique, l'équation de Michaelis-Menten.

Il exprime la vitesse (v) d'une réaction à substrat unique (équation C1.1.1) en termes de concentration de substrat au temps zéro ([S]) et les constantes cinétiques KM et Vmax. Vmax est défini comme la vitesse maximale limite pour la réaction, qui est observée lorsque toute l'enzyme est présente sous forme d'ES. KM, connue sous le nom de constante de Michaelis, est une constante de pseudo-équilibre, qui est égale à la concentration de substrat à laquelle la vitesse de réaction est égale à la moitié de Vmax (figure C1.1.1). Stratégies pour

Mesures de l'activité enzymatique

Vmax et KM sont définis par les équations suivantes :

Le terme de vitesse, v, dans l'équation C 1.1.2 fait référence aux vitesses initiales mesurées. La dérivation de l'équation est basée sur les hypothèses que les concentrations d'enzymes sont bien inférieures aux concentrations de substrat ([E]total<<[S]) et que, au cours de l'essai, la concentration du complexe enzyme-substrat reste essentiellement constante (le -hypothèse d'état). Le but de cette discussion est de montrer que les vitesses initiales mesurées devraient être directement proportionnelles à la quantité d'enzyme active dans les mélanges réactionnels. L'équation C1.1.5, obtenue en substituant et en réarrangeant les équations ci-dessus, illustre plus clairement cette relation.

Dans cette équation, notez que les termes entre parenthèses sont des constantes dans des conditions de vitesse initiale.

Une relation non linéaire entre la concentration enzymatique et l'activité mesurée indique un système réactionnel plus complexe. Des complications de cette nature peuvent découler de facteurs tels que des changements dans la composition du mélange réactionnel (p. reposent sur des systèmes enzymatiques couplés), la présence d'inhibiteurs et des phénomènes de dissociation enzyme-cofacteur ou enzyme-enzyme. Les relations non linéaires peuvent également être un résultat inhérent aux essais utilisant des substrats complexes, tels que les granules d'amidon, la cellulose et les réseaux de protéines. Dans tous les cas, il est conseillé de vérifier la nature de la relation entre l'activité mesurée et la quantité d'enzyme (comme discuté précédemment). Si la relation s'avère non linéaire, il est alors prudent de vérifier soigneusement le test pour s'assurer que la relation non linéaire n'est pas simplement un artefact de la méthode expérimentale.

Eisenthal, R. et Danson, M.J. (eds.) 1992. Enzyme Assays: A Practical Approach. IRL Press, Oxford.

Une bonne source d'informations sur la conception et l'exécution des tests enzymatiques. Le chapitre initial, par K.F. Tipton, fournit une excellente discussion sur les principes généraux impliqués dans les dosages enzymatiques. Les chapitres suivants traitent des approches de dosage spécifiques.

Segel, I.H. 1975. Enzyme Kinetics : Comportement et analyse de l'équilibre rapide et des systèmes enzymatiques à l'état d'équilibre. John Wiley & Sons, New York.

Une discussion détaillée, mais lisible, de l'équilibre rapide et de la cinétique à l'état d'équilibre. La première partie du livre traite de la biochimie des enzymes de base, de la cinétique des enzymes simples non réactives et des systèmes d'inhibition simples.

Whitaker, J.R. 1994. Principes d'enzymologie pour les sciences de l'alimentation, 2e éd. Marcel Dekker, New York.

Un texte classique utilisé depuis près de 30 ans pour enseigner aux étudiants de premier cycle et des cycles supérieurs en sciences alimentaires les principes fondamentaux de l'enzymologie. La dernière partie du texte met l'accent sur la biochimie des enzymes particulièrement pertinentes pour l'alimentation

Wong, D.W.S. 1995. Enzymes alimentaires : structure et mécanisme. Chapman et Hall, New York.

Ce livre donne un résumé informatif, mais relativement concis et bien référencé, de la structure et du mécanisme catalytique d'enzymes alimentaires sélectionnées. Toutes les enzymes couvertes jouent un rôle important dans les systèmes alimentaires et toutes ont leur mécanisme catalytique décrit au niveau moléculaire.

Contribution de Michael H. Penner Oregon State University Corvallis, Oregon k


Enzymes

Toutes les enzymes sont des protéines globulaires à structure tertiaire spécifique, qui catalysent les réactions métaboliques dans tous les organismes vivants. Cela signifie qu'ils accélèrent les réactions chimiques, mais ne sont pas "utilisés" dans le cadre de la réaction.

Les enzymes sont des molécules relativement grosses, constituées de centaines d'acides aminés qui sont responsables du maintien de la structure tertiaire spécifique de l'enzyme. Chaque enzyme a une forme de site actif spécifique, maintenue par la structure tertiaire globale spécifique. Par conséquent, la structure tertiaire ne doit pas être modifiée.

(b) indiquer que l'action enzymatique peut être intracellulaire ou extracellulaire

Une action enzymatique extracellulaire se produit à l'extérieur la cellule qui produit la protéine. Par exemple, certaines enzymes du système digestif sont extracellulaires car elles sont libérées des cellules qui les fabriquent vers les aliments dans les espaces du système digestif.

Une action enzymatique intracellulaire se produit à l'intérieur la cellule, qui produit l'enzyme. Par exemple, certaines enzymes du système digestif se trouvent dans le cytoplasme des cellules ou sont attachées aux membranes cellulaires et la réaction a lieu à l'intérieur de la cellule.

(c) décrire, à l'aide de diagrammes, le mécanisme d'action des molécules enzymatiques, en se référant à la spécificité, au site actif, à l'hypothèse verrou et clé, à l'hypothèse d'ajustement induit, au complexe enzyme-substrat, au complexe enzyme-produit et à l'abaissement de l'activation énergie.

L'énergie d'activation est le niveau d'énergie minimum requis pour permettre à une réaction d'avoir lieu. Les enzymes agissent en abaissant l'énergie d'activation des réactions. Cela signifie que les réactions peuvent se dérouler rapidement à des températures bien inférieures au point d'ébullition, car moins d'énergie est requise pour la réaction.

(d) décrire et expliquer les effets du pH, de la température, de la concentration enzymatique et de la concentration du substrat sur l'activité enzymatique

(e) décrire comment les effets du pH, de la température, de la concentration enzymatique et de la concentration du substrat sur l'activité enzymatique peuvent être étudiés expérimentalement

(f) expliquer les effets des inhibiteurs compétitifs et non compétitifs sur le taux de réactions contrôlées par les enzymes, en se référant à la fois aux inhibiteurs réversibles et non réversibles

Un inhibiteur d'enzyme est une substance ou une molécule qui ralentit la vitesse d'une réaction contrôlée par une enzyme en affectant la molécule d'enzyme d'une manière ou d'une autre.

Les inhibiteurs réversibles sont des inhibiteurs qui se lient au site actif pendant une courte période puis s'en vont. L'élimination de l'inhibiteur du mélange réactif laisse les molécules enzymatiques inchangées.

Les inhibiteurs irréversibles sont des inhibiteurs qui se lient de façon permanente à la molécule d'enzyme. Toutes les molécules enzymatiques liées par des molécules inhibitrices sont efficacement dénaturées.

(g) expliquer l'importance des cofacteurs et des coenzymes dans les réactions enzymatiques contrôlées

Un cofacteur est toute substance qui doit être présente pour garantir que les réactions contrôlées par les enzymes puissent avoir lieu à la vitesse appropriée. Certains cofacteurs font partie des enzymes (groupes prothétiques) d'autres affectent l'enzyme de manière temporaire (coenzymes et cofacteurs ioniques inorganiques).

(h) indiquer que les poisons métaboliques peuvent être des inhibiteurs d'enzymes et décrire l'action d'un poison nommé

(i) déclarer que certains médicaments agissent en inhibant l'activité des enzymes


Liens externes

  • Unité "katal" pour l'activité catalytique (Rapport technique IUPAC) Appl pur. Chem. Vol. 73, n° 6, pp.   927� (2001)
  • René Dybkær (1er mars 2002). "Le chemin tortueux vers l'adoption du katal pour l'expression de l'activité catalytique par la Conférence générale des poids et mesures". Chimie clinique. 48 (3) : 586�. doi: 10.1093/clinchem/48.3.586 . PMID   11861460. Archivé de l'original le 6 octobre 2008 . Récupéré le 8 décembre 2005 .
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Consulter les fiches signalétiques (MSDS) pour les dangers et les précautions de manipulation appropriées.

7.2 MÉTHODE :
Réaction d'arrêt titrimétrique

7.3.1
0,5 % (p/v) d'acide polygalacturonique (sous)

7.3.1.1
Préparer en ajoutant 200 ml d'eau purifiée à 1,00 g à 1,05 g d'acide polygalcturonique (produit n° P3889) sous agitation.

7.3.1.2
En remuant, porter à ébullition et maintenir l'ébullition pendant exactement cinq minutes. Placer immédiatement dans un bain-marie à 25 ºC avec un agitateur immergeable. Agiter jusqu'à ce que la température atteigne 25 ºC et laisser la solution s'agiter pendant dix minutes supplémentaires.

7.3.1.3
En continuant d'agiter, ajuster le pH de la solution en ajoutant 0,05 ml d'aliquotes de réactif 7.3.6 (NaOH-2) à 1 minute d'intervalle jusqu'à ce qu'un pH de 4,0 soit obtenu. Ajouter des aliquotes de 0,05 ml de NaOH 2 N sous agitation jusqu'à ce qu'un pH de 4,00 à 4,05 soit maintenu pendant un minimum de dix minutes. Si des particules sont présentes, filtrer sur une colonne Evergreen, fritté maximum de 90 M.

7.3.1.4
Revérifier le pH et ajuster avec le réactif 7.3.3 (NaOH) à 25 ºC à 4,00 - 4,02 sous agitation. Le pH doit rester dans la plage de 4,00 à 4,02 pendant au moins 30 minutes.

7.3.1.5
Il peut être nécessaire de revérifier le pH toutes les quinze minutes pour s'assurer que le pH se situe dans la plage de 4,00 à 4,02 à 25 ºC. Sinon, ajustez le pH avec NaOH 0,1N.

7.3.2
100 mM d'iode (je2)
Utilisez l'étalon volumétrique d'iode, 0,1 N (produit n° 318981).

7.3.3
Solution d'hydroxyde de sodium (NaOH) 1,0 N (produit n° S2567).

7.3.4
Carbonate de sodium 1 M (Na2CO3)
Préparez dans de l'eau purifiée à 106 mg/mL en utilisant du carbonate de sodium, qualité réactif (produit n° S2127).

7.3.5
Acide sulfurique 2,0 N (H2DONC4)
Préparer dans de l'eau purifiée à 0,06 mL/mL en utilisant de l'acide sulfurique, réactif ACS (produit n° 258105).

7.3.6
Hydroxyde de sodium 10 N (NaOH-2)
Préparer à 400 mg/mL dans de l'eau purifiée en utilisant de l'hydroxyde de sodium, qualité réactif (produit n° S5881).

7.3.7
100 mM de thiosulfate de sodium, standardisé (Na2S2O3)
Préparez dans 3 L d'eau purifiée en utilisant 78,3 g de thiosulfate de sodium pentahydraté (produit n° S8503) et 0,6 g de carbonate de sodium monohydraté (produit n° S4132). Standardiser contre une solution standard de dichromate de potassium, préparée à partir de dichromate de potassium, NIST.

7.3.8
Solution de pectinase (enzyme)
Immédiatement avant utilisation, préparer une solution contenant environ 100 unités/mL dans de l'eau purifiée froide. La dissolution peut nécessiter plus d'une minute d'agitation et certaines particules insolubles peuvent encore être présentes.

7.3.9
1,0 % (p/v) Amidon (Amidon)
Préparer dans de l'eau purifiée à 10 mg/mL en faisant bouillir pendant exactement cinq minutes sous agitation. Refroidir à température ambiante. Utiliser de l'amidon soluble dans la pomme de terre (produit n° S2004).

7.4.1
Pipeter (en millilitres) les réactifs suivants dans des récipients en verre appropriés en triple pour le contrôle et/ou l'échantillon :


Examen de l'activité enzymatique en 26 questions faciles

Les catalyseurs sont des substances qui réduisent l'énergie d'activation d'une réaction chimique, la facilitent ou la rendent énergétiquement viable. Le catalyseur augmente la vitesse de la réaction chimique.

Plus de questions-réponses ci-dessous

2. Quelle quantité de catalyseur est consommée dans la réaction qu'il catalyse ?

Les catalyseurs ne sont pas consommés dans les réactions qu'ils catalysent.

3. Y a-t-il une différence entre les niveaux d'énergie initial et final dans les réactions catalysées et non catalysées ?

La catalyse ne modifie pas l'état de l'énergie des réactifs et produits d'une réaction chimique. Seule l'énergie nécessaire à la réaction, c'est-à-dire l'énergie d'activation, est altérée.

4. Que sont les enzymes ? Quelle est l'importance des enzymes pour les êtres vivants ?

Les enzymes sont des protéines qui sont des catalyseurs de réactions chimiques. La chimie nous montre que les catalyseurs sont des substances non consommables qui réduisent l'énergie d'activation nécessaire pour qu'une réaction chimique se produise.

Les enzymes sont très spécifiques aux réactions qu'elles catalysent. Ils sont d'une importance vitale pour la vie car la plupart des réactions chimiques dans les cellules et les tissus sont catalysées par des enzymes. Sans action enzymatique, ces réactions ne se produiraient pas ou ne se produiraient pas à la vitesse requise pour les processus biologiques dans lesquels elles sont impliquées.

Le complexe enzyme-substrat

5. Quels sont les substrats des réactions enzymatiques ?

Les substrats sont des molécules réactives sur lesquelles les enzymes agissent.

Les enzymes ont des sites de liaison spatiale pour se fixer à leur substrat. Ces sites sont appelés centres d'activation de l'enzyme. Les substrats se lient à ces centres, formant le complexe enzyme-substrat.

6. Quels sont les principaux modèles théoriques qui tentent d'expliquer la formation du complexe enzyme-substrat ?

Il existe deux modèles principaux qui expliquent la formation du complexe enzyme-substrat : le modèle verrou et clé et le modèle d'ajustement induit.

Dans le modèle lock and key, l'enzyme a une région avec une conformation spatiale spécifique pour la liaison du substrat. Dans le modèle d'ajustement induit, la liaison du substrat induit un changement dans la configuration spatiale de l'enzyme pour ajuster le substrat.

7. Comment la formation du complexe enzyme-substrat explique-t-elle la diminution de l'énergie d'activation des réactions chimiques ?

L'enzyme fonctionne peut-être comme un tube à essai dans lequel les réactifs se rencontrent pour former des produits. Les enzymes facilitent cette rencontre, facilitant les collisions entre réactifs et, par conséquent, l'énergie d'activation de la réaction chimique est réduite. C'est une hypothèse possible.

8. De quel niveau structurel de l'enzyme (primaire, secondaire, tertiaire ou quaternaire) dépend l'interaction enzyme-substrat ?

Le substrat se lie à l'enzyme au niveau des centres d'activation. Ce sont des sites tridimensionnels spécifiques et donc ils dépendent des structures tertiaires et quaternaires de la protéine. Les structures primaires et secondaires, cependant, conditionnent les autres structures, et par conséquent sont d'égale importance.

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Spécificité de l'action enzymatique

9. Quel est le centre d'activation d'une enzyme ? Est-ce la clé ou la serrure dans le modèle de serrure et de clé ?

Le centre d'activation est une région de l'enzyme produite par sa conformation spatiale à laquelle se lie le substrat. Dans le modèle serrure et clé, le centre d'activation est la serrure et le substrat est la clé.

10. Pourquoi l'action enzymatique est-elle considérée comme hautement spécifique ?

L'action enzymatique est hautement spécifique car seuls les substrats spécifiques d'une enzyme se lient au centre d'activation de cette enzyme. Chaque enzyme catalyse généralement une seule réaction chimique spécifique.

Facteurs qui modifient l'activité enzymatique

11. Qu'arrive-t-il à la fonctionnalité d'une enzyme dénaturée ? Comment expliquer ce résultat à l'aide du modèle de serrure et de clé ?

Selon la serrure et la clé, la fonctionnalité enzymatique dépend entièrement de l'intégrité du centre d'activation, une région moléculaire avec des caractéristiques spatiales spécifiques. Après dénaturation, la conformation spatiale de la protéine est modifiée, le centre d'activation est détruit et l'enzyme perd son activité catalytique.

12. Quels sont les principaux facteurs qui modifient la vitesse des réactions enzymatiques ?

Les principaux facteurs qui modifient la vitesse des réactions enzymatiques sont la température, le pH et la concentration du substrat (quantité).

13. Comment la concentration du substrat affecte-t-elle la vitesse des réactions enzymatiques ?

Initialement, à mesure que la concentration du substrat augmente, la vitesse de la réaction augmente. Cela se produit parce que les centres d'activation libres de l'enzyme se lient aux substrats libres. Une fois que tous les centres d'activation des enzymes disponibles sont liés à leurs substrats, de nouvelles augmentations de la concentration en substrat n'auront aucun effet sur la vitesse de la réaction.

14. Comment la température affecte-t-elle l'action des enzymes sur leurs substrats ?

Il existe des plages de températures définies sous lesquelles les enzymes fonctionnent et il existe un niveau de température spécifique (température optimale) dans lequel les enzymes ont une efficacité maximale. Par conséquent, les variations de température affectent l'activité enzymatique et la vitesse des réactions qu'elles catalysent.

In addition, because they are proteins, enzymes can be denatured under extreme temperatures.

15. Concerning enzymatic reactions, how different are the curves of the graph of the variation in the speed of a reaction as function of substrate concentration and the graph of the variation in the speed of a reaction as function of temperature?

The curve of the variation in speed of the enzymatic reaction as a function of increasing substrate concentration increases in a curve formation until approaching the point where it stabilizes due to the saturation of the activationꃎnters of the enzymes.

The curve of the variation in the speed of the enzymatic reaction as a function of increasing temperature initially increases and then reaches a peak (the optimum temperature), after which it decreases to zero at the point in which the enzymes are rendered inactive by denaturation.

16. What is the relationship between  the cooling of organs and tissues for medical transplants and the effect of temperature on enzymatic reactions?

Molecular degradation during the decomposition of organs and tissues is catalyzed by enzymes. The cooling to adequate temperatures of some organs and tissues destined for transplantation reduces that enzyme activity and thus decreases the natural decomposition process. By the same rationale, the cooling reduces the metabolic work of cells and prevents the breakdown of their own structures to obtain energy. A subsequent increase in temperature reverts the denaturation of enzymes, allowing the organs and tissues also preserved by other specific techniques to be grafted into the receptors.

17. Does pH affect enzyme activity?

The concentration of hydrogen ions in a solution affects enzyme activity. Each enzyme has a maximum efficiency in an optimum pH.

Since pH is one of the factors in the denaturation of proteins, if an enzyme is subject to a pH level under which it is denatured, there will be no enzymatic activity.

18. Do enzymes act better under acidic or alkaline pHs?

Most enzymes act under pHs between 6 and 8, a range that corresponds to the general acidic level of cells and blood. There are enzymes, however, that act only under very acid or very alkaline pH. Therefore, enzyme activity depends on pH range.

In the stomach, for example, gastric juice has a very low pH, around 2. Nonetheless, the enzyme pepsin acts to intensively digest proteins. In the duodenum, pancreatic secretions increase the pH of the intestinal juice to allow other digestive enzymes, such as trypsin, to act.

19. Since pepsin is a gastric enzyme, does it have an acidic or alkaline optimum pH? What happens to pepsin when it enters the duodenum?

Pepsin acts within the stomach so its optimum pH is around 2, an acidic pH. When the enzyme enters the duodenum, it comes in contact with a higher pH and its enzyme activity comes to and end.

Cofacteurs

20. What are enzyme cofactors?

Some enzymes need other associated molecules to work. These molecules are called enzyme cofactors and they can be organic ions like mineral salts, or organic molecules, to give some examples.

Inactive enzymes which are not bound to their cofactors are called apoenzymes. Active enzymes bound to their cofactors are called holoenzymes.

21. What is the relationship between vitamins and enzyme cofactors?

Many vitamins are enzyme cofactors that cannot be synthesized by the body and, as a result, must be obtained from the diet.

Enzyme Inhibitors, Allosterism and Zymogens

22. In a enzymatic reaction, what is the effect of a substance with the same spatial conformation as the enzyme substrate? How is this type of substance recognized?

Substances that “simulate” substrates can bind to the activation center of enzymes, thus blocking the true substrates from binding to these enzymes and paralyzing the enzymatic reaction. These “fake substrates” are called enzyme inhibitors.

The binding of enzyme inhibitors to enzymes can be reversible or irreversible.

Many medical drugs, including some antibiotics, antivirals, antineoplastics, antihypertensives and even sildenafil (trade name Viagra), are enzyme inhibitors that block enzyme activity.

23. What is the mechanism of action of the antibiotic penicillin?

Penicillin, discovered by the Scottish doctor Alexander Fleming in 1928, is a drug that inhibits the enzymes necessary for the synthesis of peptidoglycans, a component of the bacterial cell wall. Through this, the inhibition the bacterial population stops growing because there is no new cell wall formation.

Fleming won the Nobel Prize in medicine for the discovery of penicillin.

24. What is the mechanism of action of the antiretroviral drugs called protease inhibitors which are used against HIV infection?

Protease inhibitors are some of the antiretroviral drugs used to treat HIV infection. Protease is an enzyme necessary for the construction of the  human immunodeficiency virus (HIV)ꂯter the synthesis of its proteins within the host cell. The protease inhibitor binds to the activation center of the enzyme blocking the formation of the enzyme-substrate complex and enzyme activity, thus stopping viral replication.

25. What are allosteric enzymes?

Allosteric enzymes are enzymes with more than one activation center and to which other substances, called allosteric regulators, bind.

Allosteric regulators can be allosteric inhibitors or allosteric activators. The interaction between an allosteric enzyme and an allosteric inhibitor prohibits the binding of the substrate to the enzyme. The interaction between an allosteric enzyme and an allosteric activator allows the binding of the substrate to the enzyme and sometimes increases the affinity of the enzyme for the substrate. This regulatory phenomenon of enzyme activity is called allosterism.

26. What are zymogens?

Zymogens, or proenzymes, are enzymes secreted in inactive form. Under certain conditions, a zymogen changes into the active form of the enzyme. In general, zymogen secretions happen because enzyme activity can harm secretory tissue.

For example, the pepsinogen secreted by the stomach becomes active under an acidic pH, turning into the enzyme pepsin. Other well-known zymogens are trypsinogen and chymotrypsinogen, enzymes that are secreted by the exocrine pancreas and which become trypsin and chymotrypsin respectively.


The term allosterism refers to the fact that the activity of certain enzymes can be affected by the binding of small molecules. Molecules causing allosteric effects come in two classifications. Ones that are substrates for the enzymes they affect are called homotropic effectors and those that are not substrates are called heterotropic effectors.

The homotropic effectors usually are activators of the enzymes they bind to and the results of their action can be seen in the conversion of the hyperbolic curve typical of a V0 vs. [S] plot for an enzyme (Figure 4.18), being converted to a sigmoidal plot (Figure 4.44). This is due to the conversion of the enzyme from the T-state to the R-state on binding the substrate/homotropic effector.

Figure 4.44 - Kinetic profile of an allosteric enzyme whose activity is controlled by a homotropic effector. Image by Aleia Kim

The V0 vs. [S] plot of allosteric enzyme reactions resembles the oxygen binding curve of hemoglobin (see Figure 2.83). Even though hemoglobin is not an enzyme and is thus not catalyzing a reaction, the similarity of the plots is not coincidental. In both cases, the binding of an external molecule is being measured &ndash directly, in the hemoglobin plot, and indirectly by the V0 vs. [S] plot, since substrate binding is a factor in enzyme reaction velocity.

Allosteric inhibition

Allosterically, regulation of these enzymes works by inducing different physical states (shapes, as it were) that affect their ability to bind to substrate. When an enzyme is inhibited by binding an effector, it is converted to the T-state (T=tight), it has a reduced affinity for substrate and it is through this means that the reaction is slowed.

Allosteric activation

On the other hand, when an enzyme is activated by effector binding, it converts to the R-state (R=relaxed) and binds substrate much more readily. When no effector is present, the enzyme may be in a mixture of T- and R-states.

La rétro-inhibition

An interesting kind of allosteric control is exhibited by HMG-CoA reductase, which catalyzes an important reaction in the pathway leading to the synthesis of cholesterol. Binding of cholesterol to the enzyme reduces the enzyme&rsquos activity significantly. Cholesterol is not a substrate for the enzyme, so it is therefore a heterotropic effector.

Notably, though, cholesterol is the end-product of the pathway that HMG-CoA reductase catalyzes a reaction in. When enzymes are inhibited by an end-product of the pathway in which they participate, they are said to exhibit feedback inhibition.

Feedback inhibition always operates by allosterism and further, provides important and efficient control of an entire pathway. By inhibiting an early enzyme in a pathway, the flow of materials (and ATP hydrolysis required for their processing) for the entire pathway is stopped or reduced, assuming there are not alternate supply methods.

Pathway control

In the cholesterol biosynthesis pathway, stopping this one enzyme has the effect of shutting off (or at least slowing down) the entire pathway. This is significant because after catalysis by HMG-CoA reductase, there are over 20 further reactions necessary to make cholesterol, many of them requiring ATP energy. Shutting down one reactions stops all of them. Another excellent example of allosteric control and feedback inhibition is the enzyme ATCase, discussed below.

Another interesting example of allosteric control and feedback inhibition is associated with the enzyme Aspartate Transcarbamoylase (ATCase). This enzyme, which catalyzes a step in the synthesis of pyrimidine nucleotides, has 12 subunits. These include six identical catalytic subunits and six identical regulatory subunits. The catalytic subunits bind to substrate and catalyze a reaction. The regulatory subunits bind to either ATP or CTP. If they bind to ATP, the enzyme subunits arrange themselves in the R-state.

Figure 4.45 - Schematic structure of ATCase. Regulatory Units = R, Catalytic Units = C. Image by Aleia Kim

The R-state of ATCase allows the substrate to have easier access to the six active sites and the reaction occurs more rapidly. For the same amount of substrate, an enzyme in the R-state will have a higher velocity than the same enzyme that is not in the R-state. By contrast, if the enzyme binds to CTP on one of its regulatory subunits, the subunits will arrange in the T-state and in this form, the substrate will not have easy access to the active sites, resulting in a slower velocity for the same concentration of substrate compared to the R-state. ATCase is interesting in that it can also flip into the R-state when one of the substrates (aspartate) binds to an active site within one of the catalytic subunits.

Aspartate has the effect of activating the catalytic action of the enzyme by favoring the R-state. Thus, aspartate, which is a substrate of the enzyme is a homotropic effector and ATP and CTP, which are not substrates of the enzyme are heterotropic effectors of ATCase.

Figure 4.46 - Plots of V0 vs. [S] for ATCase. Left - Allosteric effect of aspartate. Right - Allosteric effects of ATP (activator) and CTP (inhibitor). Image by Pehr Jacobson


Enzyme Kinetics – Michaelis–Menten kinetics

In 1913, Linor Michaelis (1875-1949) and Maud Menten (1879-1960) put forward the enzyme-substrate complex theory. According, the enzyme (E) combines with the substrate(S), to form an enzyme-substrate(ES) complex, which immediately breaks down to the Enzyme and the Product (P).

The above reactions are assumed to be reversible. Ici k1, k2, k3, k4 are specific rate constants. Michelis-Menton equation is the rate equation for the reaction catalyzed by an enzyme having a single substrate. In this derivation that the Brigg’s et Halden.

  • Molar Concentration of [E] =Concentration of free (or) free (or) uncombined enzyme
  • [ES]=Concentration of Enzyme-Substrate complex
  • [Et]=Total enzyme concentration (the sum of the free and combined forms)
  • [S]=Concentration of Substrate
  • [P]=Concentration of Product

The substrate concentration is assumed to be far greater than the concentration of Enzyme [E]. So that the amount of substrate-bound by the enzyme at any given time is negligible. Compared with the total concentration of [S].

Systematic studies of the effect of substrate concentration on ionic enzyme activity began performing in the late nineteenth century.

Already in 1882, the concept of an enzyme-substrate complex as an intermediary in the process of enzymatic catalysis was introduced. In 1913, Leonor Michaelis (pictured left) and Maud Menten (pictured right) developed this theory and proposed a rate equation that explains the kinetic behavior of the enzyme.

To explain the observed relation between the initial velocity (v0) and the initial substrate concentration ([S]0) Michaelis and Menten proposed that the enzymatically catalyzed reactions occur in two phases :

  • The first phase: In the first step , the enzyme-substrate complex is formed.
  • Second Phase: The enzyme-substrate complex results in the formation of the product, releasing the free enzyme.

In this scheme, k 1 , k 2 and k 3 are constants each individual kinetics of the process and also are called microscopic rate constants . Accordingly, we can say that:

One can distinguish between free enzyme (E) and attached to the enzyme substrate (S), so that the total concentration of enzyme , [E T ], (which is constant throughout the reaction) is:

As [E] = [ET] – [ES], it follows that:

This kinetic model adopts the steady-state hypothesis , according to which the concentration of the enzyme-substrate complex is small and constant throughout the reaction (Figure, right).

Therefore, the rate of formation of the enzyme-substrate complex (v 1 ) is equal to that of its dissociation (v 2 + v 3 ):

Further, as [ES] is constant, the rate of formation of the products is constant:

As v 1 = v 2 + v 3 , we can say that:

k 1 [S] [E T ] – k 1 [S] [ES] = k 2 [ES] + k 3 [ES]

Solving for [ES], is that: being km=(k2+k3) / k1, where the expression (k 2 + k 3 ) / k 1 has been replaced by K M , or Michaelis-Menten constant .

This link gives us an explanation of the reasons that make the K M an important kinetic parameter .

Thus, at steady state, the rate of formation of the product is:

For any enzyme, [E reaction T], k 3 and KM are constants. Let us consider two extreme cases:

  • A small substrate concentrations ([S] << KM ) = v (k3[ET] /KM) [S]. As the terms in parentheses are constant, they can be included in a new constant, kobs, so that the expression is reduced to v = k obs [S], so that the reaction is a first-order kinetic process.
  • A high substrate concentrations ([S] >> KM), v = k 3 [E T ] . The reaction rate is independent of the concentration of the substrate, and therefore, the reaction is a zero-order kinetic process. In addition, both k 3 and [E T ] are constant and allows us to define a new parameter, the maximum reaction rate (V max ): V max = k 3 [E T ], which is the rate that would be achieved when all available enzyme bound to the substrate is at.

If we introduce the parameter V max in the general rate equation (boxed formula above), we obtain the best known of the Michaelis-Menten expression :

There are enzymes that do not obey the Michaelis-Menten equation. It says it’s not Michaelian kinetics. This happens with Allosteric enzymes, whose graph v vs. [S] is not hyperbole, but a sigmoid (figure right). The Sigmoidal kinetics, small variations in [S] in a critical area (near KM ) results in large variations in the reaction rate.


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Hayley Milliman is a former teacher turned writer who blogs about education, history, and technology. When she was a teacher, Hayley's students regularly scored in the 99th percentile thanks to her passion for making topics digestible and accessible. In addition to her work for PrepScholar, Hayley is the author of Museum Hack's Guide to History's Fiercest Females.


Voir la vidéo: 7. Unités dactivité enzymatique (Juillet 2022).


Commentaires:

  1. Mausida

    Juste un cauchemar.///

  2. JoJot

    Je sais, comment il faut agir, écrire en personnel

  3. Kizahn

    C'est une information amusante

  4. Cein

    Excuse s'il vous plaît, que je vous interrompre.

  5. Tyg

    Je crois que vous vous trompez. Je peux défendre ma position. Envoyez-moi un courriel à PM, nous en discuterons.



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