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L'urée à différentes concentrations (5 ou 0,5 M) a-t-elle des effets différents sur les protéines ?

L'urée à différentes concentrations (5 ou 0,5 M) a-t-elle des effets différents sur les protéines ?



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Le problème est d'expliquer pourquoi chaque additif donne lieu à la distribution de la protéine (RMAS) comme le montre le coup occidental ci-dessous :

Dans chaque cas, les homogénats ont été soumis à une centrifugation à grande vitesse et les fractions surnageant/pastille ont été résolues séparément par électrophorèse sur gel SDS-polyacrylamide. Les gels ont été transférés et sondés avec un anticorps dirigé contre le RMAS.

Je suis particulièrement bloqué sur l'explication de l'effet de la 0,5 M d'urée vs 5M d'urée sur les protéines solubles et insolubles représentées respectivement par le culot et le surnageant. Je pense qu'à de faibles concentrations d'urée (0,5 M), la protéine du culot est déstabilisée par l'urée et la solubilité augmente en montrant une bande. Cependant, les protéines solubles sont dénaturées et ne présentent aucune bande. Cependant, à 5 M d'urée, les protéines du culot sont solubles de manière réversible et ne se présentent donc pas sous forme de bande alors que les protéines solubles sont OK et présentent donc une bande « normale ». Je ne sais pas si c'est la bonne explication, quelqu'un pourrait-il me l'expliquer s'il vous plaît ??


Ce que vous devez faire est de comparer les quantités relatives de la protéine dans la fraction insoluble (pastille) à la fraction soluble (surnageant). De cette façon, vous pouvez déterminer à quel point le RMAS est devenu soluble par l'effet du composé indiqué.

Le DTT brise les liaisons disulfure, mais ne fait rien d'autre pour solubiliser la protéine, donc tout est dans le culot, sans détectable dans le supe. NaCl est un sel qui augmente la "force" ionique du tampon de lyse, mais ne fait rien pour solubiliser la protéine, donc encore une fois, toute la cible reste dans le culot. D'un autre côté, des détergents comme le Triton et le SDS libèrent la protéine de la fraction insoluble et en déplacent la majeure partie dans le surnageant, ce qui conduit au schéma que vous voyez pour eux. En fonction de la localisation subcellulaire exacte de la protéine d'intérêt et de la quantité et de la combinaison de détergent(s) utilisé(s), il se peut que vous ne voyiez pratiquement aucune protéine dans le culot, car tout a été solubilisé.

L'urée et le chlorhydrate de guanidinium sont des agents chaotropes, perturbant la liaison hydrogène, les forces de van der Waals et affaiblissant les associations hydrophobes, provoquant la dénaturation et la séparation de la protéine des autres protéines du culot, la mettant ainsi dans la supe. Cet effet est généralement observé à des molarités relativement élevées (par exemple, le GuHCl est souvent utilisé dans la gamme 6-8 M), ce qui explique la différence d'effet observée avec l'urée 0,5 et 5 M. À de faibles concentrations, il n'y a tout simplement pas assez d'urée présente pour dénaturer efficacement la protéine. je suis un peu surpris que rien est apparu dans la voie de 0,5 M, cependant, ce n'est qu'un simulé Western montrant des résultats idéaux - dans la vraie vie, les choses ne sont presque jamais aussi tranchées.


Voir la vidéo: Etude dune Enzyme lUrease - ENZYMOLOGIE u0026 BIOCHIMIE METABOLIQUE - SVI S4 (Août 2022).